基于Rag1基因序列的黃河高原鰍群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

謝佳燕 顏淵 楊鈺慧 閆達(dá)中 吳菁

摘要：【目的】明確不同水域黃河高原鰍群體免疫基因多樣性水平和遺傳組成，為黃河高原鰍自然種質(zhì)資源現(xiàn)狀的評(píng)估、保護(hù)及合理開發(fā)提供理論依據(jù)。【方法】采集黃河中上游不同河段的黃河高原鰍自然群體[青海循化（XH）群體、青海大通（DT）群體及甘肅景泰（JT）群體]樣品，基于重組激活基因（Rag1）序列對(duì)不同黃河高原鰍群體的遺傳多樣性水平和遺傳組成差異進(jìn)行研究?！窘Y(jié)果】在不同黃河高原鰍群體的Rag1基因序列中共檢測(cè)到8個(gè)單倍型（H1～H8），其中有5個(gè)單倍型（H1、H2、H3、H4和H6）在2個(gè)以上的群體間相互共享，尤其是單倍型H1、H4和H6在所有群體中均有分布。黃河高原鰍總?cè)后w的單倍型多態(tài)性為0.742，核苷酸多態(tài)性為0.003，在3個(gè)黃河高原鰍群體中共檢測(cè)到28個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。不同黃河高原鰍種群間的單倍型多態(tài)性范圍在0.575～0.872，核苷酸多態(tài)性范圍在0.002～0.003。XH群體與JT群體間的遺傳分化系數(shù)（Fst）為0.037，XH群體與DT群體間的Fst為-0.041，JT群體與DT群體的Fst為-0.022;不同黃河高原鰍群體的分子遺傳變異主要發(fā)生在群體內(nèi)（占99.56%）。單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖及NJ聚類樹和ML聚類樹均顯示，不同黃河高原鰍自然種群個(gè)體相互混合在一起，未按照采樣河段地理位置形成明顯的聚類結(jié)構(gòu)，即黃河高原鰍不同單倍型間呈現(xiàn)混合的分布格局?！窘Y(jié)論】黃河高原鰍群體遺傳多樣性水平中等，不同自然群體間的遺傳多樣性水平存在一定差異，但并未檢測(cè)到顯著的遺傳差異，建議在野外進(jìn)行管理和保護(hù)時(shí)仍可視為一個(gè)整體。

關(guān)鍵詞： 黃河高原鰍;Rag1基因;自然種群;遺傳結(jié)構(gòu);單倍型

中圖分類號(hào)： S965.199? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）12-3237-07

Genetic structure of Triplophysa pappenheimi populations

based on Rag1 gene sequence

XIE Jia-yan， YAN Yuan， YANG Yu-hui， YAN Da-zhong， WU Jing

（School of Life Science and Technology， Wuhan Polytechnic University， Wuhan? 430023， China）

Abstract：【Objective】Studying the population immune gene diversity and genetic structure could effectively assess the current status， and provide a theoretical basis for conservation and rational exploitation of the wild resources of Triplophysa pappenheimi. 【Method】The genetic diversity and structure of the natural populations of T. pappenheimi， sampled from different reaches of the middle and upper reaches of the Yellow River， Xunhua （XH） and Datong （DT） in Qinghai Province， and Jingtai （JT） in Gansu Province， were analyzed by using the recombination activating gene 1 （Rag1） sequences. 【Result】Eight unique haplotypes （H1-H8）? were identified in Rag1 sequence from all individuals of T. pappenheimi. Five haplotypes （H1， H2， H3， H4 and H6） shared between any two of populations， and three of them （H1， H4 and H6） shared among all populations. The haplotype and nucleotide diversities of T. pappenheimi were 0.742 and 0.003， respectively. Twenty eight polymorphic sites were detected in three populations. Haplotype diversity ranged from 0.575 to 0.872 and nucleotide diversity ranged from 0.002 to 0.003 among populations. The genetic differentiation coefficient（Fst） value between XH and JT， between XH and DT， and between JT and DT were 0.037， -0.041， and -0.022， respectively. The molecular variation analysis （AMOVA） revealed high genetic variation within populations （99.56%）. Both NJ and ML phylogenetic tree and haplotype network analysis showed that individuals from different populations were mixed together and did not form obvious cluster according to phylogeographic structure. Mixed distribution patterns were presen-ted between the different haplotypes in T. pappenheimi. 【Conclusion】It is suggested that these natural populations of T. pappenheimi have the middle level of genetic diversity. Different levels of genetic diversity are found among these wild populations. Moreover， it is not obviously identified genetic divergence among the populations of T. pappenheimi. It is suggested that management and conservation of these populations in the field can be regarded as a whole.

Key words： Triplophysa pappenheimi; Rag1 gene; wild population; genetic structure; haplotype

Foundation item： State Foundation for Studying Abroad（201808420365）; Collaborative Education Project of Industry University Cooperation of the Ministry of Education （202102102111）; Scientific Research Project of Education Department of Hubei （B2017076）

0 引言

【研究意義】高原鰍屬（Triplophysa）隸屬于鯉形目（Cypriniformes）條鰍科（Nemacheilinae），是適應(yīng)于高原高寒及高海拔環(huán)境的青藏高原主體魚類群體（陳宜瑜，1998）。高原鰍屬魚類是鯉形目中物種最豐富的屬，目前記錄有近150個(gè)有效種，我國(guó)分布有126個(gè)種（He et al.，2020），主要分布在青藏高原及其鄰近地區(qū)的河流或湖泊。高原魚類的起源及演化與青藏高原形成過程中導(dǎo)致周邊氣候環(huán)境的激烈演變密切相關(guān)（何德奎等，2006;He et al.，2016;Feng et al.，2019）。因此，系統(tǒng)開展高原鰍屬魚類的進(jìn)化及其適應(yīng)性研究，對(duì)挖掘高原生物多樣性的起源問題具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】黃河為我國(guó)的第二大河流，分布有淡水魚類物種165種（He et al.，2020），其上游魚類區(qū)系以高原魚類為主（陳宜瑜，1998）。然而，隨著人類活動(dòng)的加劇及外來物種的快速入侵等，致使水體生態(tài)環(huán)境日益遭到破壞，黃河上游魚類生物多樣性正面臨著持續(xù)喪失的威脅，許多魚類資源逐漸衰竭，且瀕危程度和范圍不斷加?。ㄈ爿x軍等，2010;Xie et al.，2018）。黃河高原鰍[T. pappenheimi （Fang，1935）]是高原鰍屬中體型較大的條鰍科物種，主要分布在蘭州以上黃河上游的干支流激流河段及其附屬湖泊，是適應(yīng)于高原季節(jié)極端性寒冷環(huán)境的代表性魚類種群之一（朱松泉，1989）。目前，黃河高原鰍已被列入《中國(guó)脊椎動(dòng)物紅色名錄》，屬于瀕危魚類（Endangered，EN）（曹亮等，2016;蔣志剛等，2016），已陸續(xù)在黃河上中游設(shè)立3個(gè)國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)及3個(gè)國(guó)家級(jí)水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)區(qū)，重點(diǎn)保護(hù)包括黃河高原鰍在內(nèi)的黃河上游特有魚類（水利部黃河水利委員會(huì)，2007）;同時(shí)在龍羊峽下游建設(shè)有2個(gè)魚類增殖站，對(duì)黃河特有魚類物種種群數(shù)量的維持和增長(zhǎng)具有重要意義（洪歡，2016）。移植馴化、人工繁育和增殖放流等是進(jìn)行種質(zhì)資源保護(hù)的重要措施，但人工增殖放流物種或個(gè)體是否對(duì)自然種群的遺傳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，進(jìn)而導(dǎo)致不同地理種群遺傳結(jié)構(gòu)同質(zhì)化，是種群補(bǔ)充過程中必須密切關(guān)注的問題。因此，在人工增殖放流前對(duì)自然種群遺傳多樣性及其遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入研究，有助于指導(dǎo)選擇人工繁殖親魚來源和放流河段，評(píng)估增殖放流對(duì)物種或種群遺傳多樣性的影響，提高對(duì)瀕危物種的有效保護(hù)效果（楊君興等，2013）。重組激活基因（Recombination activating genes，RAGs）普遍存在于脊椎動(dòng)物的核基因組中，是脊椎動(dòng)物受異原物質(zhì)刺激后進(jìn)行特異性免疫響應(yīng)的主要基因（Schatz et al.，1989），現(xiàn)已發(fā)展成為研究動(dòng)物遺傳進(jìn)化和遺傳多樣性的典型核基因分子標(biāo)記（Yu et al.，2014;Hague and Routman，2016;Silva-Santos et al.，2018）。方冬冬等（2018）基于Rag2基因探討淮河源區(qū)[]（Hemiculter leucisculus）種群遺傳多樣性及其群體遺傳結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)由于近期群體擴(kuò)張和頻繁的基因交流，導(dǎo)致淮河源區(qū)[]群體間尚未形成明顯的遺傳結(jié)構(gòu)和譜系格局。Eldridge等（2018）基于Rag 1基因評(píng)估蘇拉威西島特有鼩鼱（Crocidura elongata）的遺傳結(jié)構(gòu)組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該地區(qū)的鼩鼱種群具有較高的遺傳多樣性，其多樣性結(jié)構(gòu)的形成與特有地區(qū)領(lǐng)域邊界、海拔高度及領(lǐng)域內(nèi)的地理隔離有關(guān)。Wu等（2019）基于Rag1基因分析香港異鱲（Parazacco spilurus）的遺傳結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)相鄰水域中具有2個(gè)高度分歧的譜系，且譜系間的分歧超過了鯉科近緣屬間的物種分化，即這2個(gè)譜系可能代表2個(gè)不同的物種。【本研究切入點(diǎn)】至今，有關(guān)黃河高原鰍的研究主要涉及其物種訂正及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析等領(lǐng)域（何德奎等，2006;Wang et al.，2016;Li et al.，2017;Feng et al.，2019），而針對(duì)其自然種群遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)分析的研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采集黃河中上游不同河段的黃河高原鰍自然群體樣品，通過測(cè)定其Rag1基因序列，分析不同河段黃河高原鰍群體免疫基因多樣性水平和遺傳組成，以期為黃河高原鰍自然種質(zhì)資源現(xiàn)狀的評(píng)估、保護(hù)及合理開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 樣本采集

黃河高原鰍樣本分別采自黃河流域的青海和甘肅河段，共3個(gè)群體[青海循化（XH）群體、青海大通（DT）群體及甘肅景泰（JT）群體]。收集黃河高原鰍個(gè)體的新鮮肌肉樣品置于95%乙醇中固定，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 黃河高原鰍Rag1基因克隆及測(cè)序分析

采用標(biāo)準(zhǔn)酚—氯仿法提取黃河高原鰍基因組DNA，然后參照Li和Ortí（2007）的方法，利用引物RAG1-2510F和RAG1-4063R擴(kuò)增黃河高原鰍Rag1基因序列。PCR擴(kuò)增體系50.0 μL：10×PCR擴(kuò)增緩沖液5.0 μL，dNTP（200 μmol/L）1.0 μL，上、下游引物（0.15 μmol/L）各0.75 μL，DNA模板1.0 μL，Taq DNA聚合酶0.6 μL，三蒸水補(bǔ)足至50.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 50 s，52 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，送至武漢艾康健生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1. 3 數(shù)據(jù)分析

采用ClustalX 1.83和SeaView分別對(duì)黃河高原鰍Rag1基因序列進(jìn)行比對(duì)分析（Thompson et al.，1997）;利用DnaSP v5進(jìn)行單倍型識(shí)別（Librado and Rozas，2009）;運(yùn)用Arlequin 3.5程序包完成群體遺傳多樣性、遺傳距離和基因流計(jì)算及分子變異方差分析（Analysis of molecular variance，AMOVA）（Excoffier and Lischer，2010）;采用Network 10.1以Median-joining法構(gòu)建不同黃河高原鰍單倍型間的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖（Bandelt et al.，1999）。從GenBank下載條鰍科北方須鰍（Barbatula barbatula，EU711107）、背紋南鰍（Schistura balteata，EU711131）及長(zhǎng)尾軟鰭條鰍（Paracobitis longicauda，EU711124）的Rag基因序列，并與黃河高原鰍Rag1基因序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析;基于Kimuras 2-parameter模型，采用MEGA 6.0構(gòu)建黃河高原鰍不同單倍型的NJ（Neighbor-joining）聚類樹和ML（Maximum-likelihood）聚類樹（Tamura et al.，2013），其置信度采用Bootstrap為1000次進(jìn)行重復(fù)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 黃河高原鰍Rag1基因的核苷酸組成特點(diǎn)

對(duì)黃河高原鰍樣本的Rag1基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果獲得Rag1基因外顯子長(zhǎng)度為1485 bp的同源序列。在3個(gè)黃河高原鰍群體45個(gè)樣本中共檢測(cè)到28個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)（表1），包括16個(gè)堿基轉(zhuǎn)換位點(diǎn)和12個(gè)堿基顛換位點(diǎn);Rag1基因序列中無堿基插入或缺失現(xiàn)象。黃河高原鰍Rag1基因序列中堿基A、T、G和C的含量無明顯差異，分別為24.8%、22.7%、28.1%和24.4%。

2. 2 黃河高原鰍單倍型及群體遺傳多樣性

對(duì)黃河高原鰍Rag1基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，均獲得清晰單一的目的基因條帶（圖1），測(cè)序后進(jìn)行比對(duì)分析共識(shí)別到8個(gè)Rag1基因序列單倍型（表2），其中，有3個(gè)單倍型（H5、H7和H8）為單個(gè)種群所特有（占11.6%），其余5個(gè)單倍型出現(xiàn)在黃河高原鰍的不同種群中。單倍型H1、H4和H6在所有黃河高原鰍群體中均有分布，占76.7%，且單倍型H6的數(shù)目占總個(gè)體數(shù)的46.5%。由單倍型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖（圖2）可看出，除單倍型H8外，黃河高原鰍Rag1基因的所有單倍型均以單倍型H3為中心和起點(diǎn)，呈星狀分布態(tài)勢(shì)或進(jìn)化形成新的不同分支。黃河高原鰍Rag1基因不同單倍型間的變異步數(shù)分別為1～4步，表明黃河高原鰍各單倍型并未依據(jù)采樣河段的地理位置而形成獨(dú)立分支。

對(duì)黃河高原鰍不同群體Rag1基因的遺傳多樣性水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，黃河高原鰍總?cè)后w的單倍型多態(tài)性為0.742，核苷酸多態(tài)性為0.003。不同黃河高原鰍群體的遺傳多樣性呈中等水平，其種群間的單倍型多態(tài)性范圍在0.575～0.872，核苷酸多態(tài)性范圍在0.002～0.003（表2）。其中，JT群體的單倍型多態(tài)性明顯高于其余2個(gè)黃河高原鰍群體，但其核苷酸多態(tài)性在不同群體中基本相似。

2. 3 黃河高原鰍群體遺傳結(jié)構(gòu)

運(yùn)用Arlequin 3.5程序包對(duì)不同黃河高原鰍群體進(jìn)行群體遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，XH群體與JT群體間的遺傳分化系數(shù)（Fst）為0.037，XH群體與DT群體間的Fst為-0.041，JT群體與DT群體的Fst為 -0.022。經(jīng)Global test檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，僅JT群體和DT群體間存在顯著差異（P<0.05）。對(duì)不同黃河高原鰍群體間的基因流進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)整個(gè)自然群體的基因流為17.79。AMOVA分析結(jié)果也表明，不同黃河高原鰍群體的分子遺傳變異主要發(fā)生在群體內(nèi)，占99.56%。

2. 4 黃河高原鰍單倍型聚類分析結(jié)果

基于Kimuras 2-parameter模型，以北方須鰍（EU711107）、背紋南鰍（EU711131）及長(zhǎng)尾軟鰭條鰍（EU711124）的Rag基因序列為外群，構(gòu)建不同黃河高原鰍群體Rag1基因單倍型的NJ聚類樹和ML聚類樹，結(jié)果顯示構(gòu)建獲得的NJ聚類樹（圖3）和ML聚類樹（圖4）基本一致，黃河高原鰍與北方須鰍、背紋南鰍及長(zhǎng)尾軟鰭條鰍的親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)。不論是在NJ聚類樹還是在ML聚類樹中，3個(gè)黃河高原鰍群體的8個(gè)單倍型均先聚類成獨(dú)立分支，然后與北方須鰍聚類成一支，而背紋南鰍與長(zhǎng)尾軟鰭條鰍聚類成另一分支。黃河高原鰍不同單倍型間呈現(xiàn)混合的分布格局，其中單倍型H8在NJ聚類樹和ML聚類樹中均位于所有高原鰍單倍型分支的最底部，且未發(fā)現(xiàn)黃河高原鰍單倍型與采樣地點(diǎn)對(duì)應(yīng)的分支，與單倍型的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖相似。

3 討論

物種個(gè)體間的遺傳多態(tài)性能為其適應(yīng)環(huán)境改變的生命進(jìn)化過程提供主要的多態(tài)性來源，可同時(shí)反映并影響物種、群落及生態(tài)系統(tǒng)等更高組織水平的多態(tài)性過程（Frankham，2005），因此，遺傳多樣性也被認(rèn)為是監(jiān)測(cè)生物圈完整性所必需、最基本的生物多樣性變量（Steffen et al.，2015）。種內(nèi)遺傳多樣性的保持有助于物種繁衍和維持整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)多樣性，而遺傳均質(zhì)化或多樣性貧乏將威脅物種或群體的持續(xù)生存（Frankham，2005）。單倍型多樣性和核苷酸多樣性是評(píng)價(jià)遺傳多樣性水平的2個(gè)重要參數(shù)，其閾值分別為0.5和0.005（Grant and Bowen，1998）。本研究基于Rag1基因序列對(duì)黃河高原鰍群體樣本進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，黃河高原鰍總?cè)后w的單倍型多態(tài)性為0.742，核苷酸多態(tài)性為0.003，其遺傳多樣性水平并不高，可能與近年來黃河流域生境遭到破壞、水體污染嚴(yán)重及過度捕撈等因素致使天然水域中黃河高原鰍資源嚴(yán)重衰退有關(guān)（茹輝軍等，2010;唐文家和何德奎，2013）。在自然水體中黃河高原鰍種群已萎縮或呈破碎化，種群數(shù)量極速下降，而改善黃河高原鰍的生境是維持其種群遺傳多樣性高水平的有效措施。

雖然在天然水域中黃河高原鰍種群數(shù)量萎縮明顯，但本研究的AMOVA分析結(jié)果表明黃河高原鰍的分子遺傳變異主要來自群體內(nèi)（占99.56%），群體間的Fst為-0.041～0.037，僅JT群體與DT群體間存在顯著差異;黃河高原鰍不同單倍型間呈現(xiàn)混合的分布格局，群體間共享單倍型所占比例較高（88.4%），不同高原鰍群體間仍保持一定的基因交流。棲息地流域上中游間的相互連通，也可能促進(jìn)水系流域上下游不同高原鰍群體間的相互交流，進(jìn)而削弱因地理隔離導(dǎo)致的群體間差異，致使不同黃河高原鰍群體間未檢測(cè)到明顯的單倍型地理分布格局。近年來，黃河干支流上已完成多處梯級(jí)水利設(shè)施的大規(guī)模構(gòu)建，且在上游已規(guī)劃構(gòu)建多個(gè)級(jí)聯(lián)水壩，致使急流水體逐漸向靜水水體過渡，而水文條件的改變可加速破壞水體生境原有的異質(zhì)性，影響上游群體與干流中下游群體間的雙向遷移和基因交流，從而加速河流棲息地水生物種群體間的地理隔離和片段化，促使種群間的遺傳差異相互積累（唐文家和何德奎，2013;Xie et al.，2018）。本研究未檢測(cè)到不同黃河高原鰍群體間存在明顯的遺傳差異，可能是當(dāng)前棲息地河段中已建成或蓄水大壩的構(gòu)建時(shí)間較短，尚未對(duì)大壩上、下游河段中的種群基因交流產(chǎn)生明顯阻隔所致。但已有研究證實(shí)，級(jí)聯(lián)水利設(shè)施的構(gòu)建易促使河流魚類區(qū)系中土著魚類與外來魚種的組成發(fā)生明顯變化，且?guī)靺^(qū)上、下游河段中的總體物種遺傳多樣性水平下降（茹輝軍等，2010;楊成等，2011;Xie et al.，2018）。因此，開展地區(qū)土著魚類遺傳多樣性水平的長(zhǎng)期研究，鑒別其自然種群中的關(guān)鍵遺傳單元（Critical genetic units），對(duì)有效保護(hù)瀕危土著魚類物種具有重要意義。

4 結(jié)論

黃河高原鰍群體遺傳多樣性水平中等，不同自然群體間的遺傳多樣性水平存在一定差異，但并未檢測(cè)到顯著的遺傳差異，建議在野外進(jìn)行管理和保護(hù)時(shí)仍可視為一個(gè)整體。

參考文獻(xiàn)：

曹亮，張鶚，臧春鑫，曹文宣. 2016. 通過紅色名錄評(píng)估研究中國(guó)內(nèi)陸魚類受威脅現(xiàn)狀及其成因[J]. 生物多樣性，24（5）：598-609. [Cao L，Zhang E，Zang C X，Cao W X. 2016. Evaluating the status of Chinas continental fish and analyzing their causes of endangerment through the red list assessment[J]. Biodiversity Science，24（5）：598-609.] doi：10.17520/biods.2015331.

陳宜瑜. 1998. 中國(guó)動(dòng)物志·硬骨魚綱·鯉形目（中卷）[M]. 北京：科學(xué)出版社. [Chen Y Y. 1998. Fauna Sinica，Osteichthyes Cypriniformes II[M]. Beijing：Science Press.]

方冬冬，顧錢洪，周傳江，孟曉林，李學(xué)軍，聶國(guó)興. 2018. 淮河源區(qū)[]群體遺傳多樣性研究[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，37（5）：665-673. [Fang D D，Gu Q H，Zhou C J，Meng X L，Li X J，Nie G X. 2018. Genetic diversity of Hemiculter leucisculus in fountainhead area of Huihe River[J]. Fisheries Scien-ce，37（5）：665-673.] doi：10.16378/j.cnki.1003-1111.2018. 05.014.

何德奎，陳詠霞，陳毅峰. 2006. 高原鰍屬Triplophysa魚類的分子系統(tǒng)發(fā)育和生物地理學(xué)研究[J]. 自然科學(xué)進(jìn)展， 16（11）：1395-1404. [He D K，Chen Y X，Chen Y F. 2006. Biogeography and molecular phylogeny of the genus Triplophysa in China[J]. Progress in Natural Science，16（11）：1395-1404.] doi：10.3321/j.issn：1002-008X.2006.11.005.

洪歡. 2016. 黃河源干流梯級(jí)水電開發(fā)對(duì)河流形態(tài)及魚類多樣性的可能影響[D]. 昆明：云南大學(xué). [Hong H. 2016. Influence of cascade hydroppwer development on fluvial morphology and fish diversity in the mainstream of the Yellow River source zone[D]. Kunming：Yunnan University.]

蔣志剛，江建平，王躍招，張鶚，張雁云，李立立，謝鋒，蔡波，曹亮. 2016. 中國(guó)脊椎動(dòng)物紅色名錄[J]. 生物多樣性，24（5）：500-551. [Jiang Z G，Jiang J P，Wang Y Z，Zhang E，Zhang Y Y，Li L L，Xie F，Cai B，Cao L. 2016. Red list of Chinas vertebrates[J]. Biodiversity Science，24（5）：500-551.] doi：10.17520/biods.2016076.

茹輝軍，王海軍，趙偉華，沈亞強(qiáng)，王勇，張曉可. 2010. 黃河干流魚類群落特征及其歷史變化[J]. 生物多樣性，18（2）：169-174. [Ru H J，Wang H J，Zhao W H，Shen Y Q，Wang Y，Zhang X K. 2010. Fishes in the mainstream of the Yellow River：Assemblage characteristics and historical changes[J]. Biodiversity Science，18（2）：169-174.]

水利部黃河水利委員會(huì). 2007. 黃河流域綜合規(guī)劃（2012—2030年）概要[R/OL]. https：//max.book118.com/html/2021/0819/6154234230003233.shtm. [Yellow River Conservancy Commission of the Ministry of Water Resour-ces. 2007. Summary of the comprehensive planning of the Yellow River Basin （2012-2030）[R/OL]. https：//max.book118.com/html/2021/0819/6154234230003233.shtm.]

唐文家，何德奎. 2013. 黃河上游茨哈峽至積石峽段魚類資源調(diào)查（2005—2010年）[J]. 湖泊科學(xué)，25（4）：600-608. [Tang W J，He D K. 2013. Fish resource survey on Cihaxia to Jishixia stretches in the upper reaches of Yellow River（2005–2010）[J]. Journal of Lake Science，25（4）：600-608.] doi：10.18307/2013.0419.

楊成，申志新，王國(guó)杰，晁燕，祁得林. 2011. 基于Cyt b基因序列的擬硬刺高原鰍遺傳多樣性研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，39（25）：15395-15396. [Yang C，Shen Z X，Wang G J，Chao Y，Qi D L. 2011. Study on genetic diversity of Triplophysa pseudoscleroptera based on Cyt b gene sequence[J]. Journal of Anhui Agricultural Science，39（25）：15395- 15396.] doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2011.25.079.

楊君興，潘曉賦，陳小勇，王曉愛，趙亞鵬，李建友，李再云. 2013. 中國(guó)淡水魚類人工增殖放流現(xiàn)狀[J]. 動(dòng)物學(xué)研究，34（4）：267-280. [Yang J X，Pan X F，Chen X Y，Wang X A，Zhao Y P，Li J Y，Li Z Y. 2013. Overview of the artificial enhancement and release of endemic freshwater fish in China[J]. Zoological Research，34（4）：267-280.] doi：10.11813/j.issn.0254-5853.2013.4.0267.

朱松泉. 1989. 中國(guó)條鰍志[M]. 南京：江蘇科學(xué)技術(shù)出版社. [Zhu S Q. 1989. The locahes of the subfamily Nemacheilinae in China（Cypriniformes：Cobitidae）[M]. Nanjing：Jiangsu Science and Technology Press.]

Bandelt H J，F(xiàn)orster P，R?hl A. 1999. Median-joining networks for inferring intraspecific phylogenies[J]. Molecular Biological and Evolution，16（1）：37-48. doi：10.1093/oxfordjournals.molbev.a026036.

Eldridge R A，Achmadi A S，Giarla T C，Rowe K C，Esselstyn J A. 2018. Geographic isolation and elevational gradients promote diversification in an endemic shrew on Sulawesi[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution，118：306-317. doi：10.1016/j.ympev.2017.09.018.

Excoffier L，Lischer H E L. 2010. Arlequin suite ver 3.5：A new series of programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows[J]. Molecular Ecology Resources，10（3）：564-567. doi：10.1111/j.1755-0998.2010. 02847.x.

Feng C G，Zhou W W，Tang Y T，Gao Y，Chen J M，Tong C，Liu S J，Wanghe K，Zhao K. 2019. Molecular systematics of the Triplophysa robusta（Cobitoidea） complex：Extensive gene flow in a depauperate lineage[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution，132：275-283. doi：10.1016/j.ympev.2018.12.009.

Frankham R. 2005. Genetics and extinction[J]. Biological Conservation，126（2）：131-140. doi：10.1016/j.biocon.2005. 05.002.

Grant W A S，Bowen B W. 1998. Shallow population histories in deep evolutionary lineages of marine fishes：Insights from sardines and anchovies and lessons for conservation[J]. Journal of Heredity，89（5）：415-426. doi：10.1093/jhered/89.5.415.

Hague M T J，Routman E J. 2016. Does population size affect genetic diversity ？ A test with sympatric lizard species[J]. Heredity，116（1）：92-98. doi：10.1038/hdy.2015.76.

He D K，Chen Y F，Liu C L，Tao J，Ding C Z，Chen Y Y. 2016. Comparative phylogeography and evolutionary history of schizothoracine fishes in the Changtang Plateau and their implications for the lake level and Pleistocene climate fluctuations[J]. Ecology and Evolution，6（3）：656-674. doi：10.1002/ece3.1890.

He D K，Sui X Y，Sun H Y，Tao J，Ding C Z，Chen Y F，Chen Y Y. 2020. Diversity，pattern and ecological drivers of freshwater fish in China and adjacent areas[J]. Reviews in Fish Biology and Fisheries，30（345）：387-404. doi：10. 1007/s11160-020-09600-4.

Li C H，Ortí G. 2007. Molecular phylogeny of Clupeiformes （Actinopterygii） inferred from nuclear and mitochondrial DNA sequences[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution，44（1）：386-398. doi：10.1016/j.ympev.2006.10.030.

Li J X，Wang Y，Jin H F，Li W J，Yan C C，Yan P F，Zhang X Y，He S P，Song Z B. 2017. Identification of Triplophysa species from the Qinghai-Tibetan Plateau（QTP） and its adjacent regions through DNA barcodes[J]. Gene，605：12-19. doi：10.1016/j.gene.2016.11.045.

Librado P，Rozas J. 2009. DnaSP v5：A software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data[J]. Bioinformatics，25（11）：1451-1452. doi：10.1093/bioinformatics/btp187.

Schatz D G，Oettinger M A，Baltimore D. 1989. The V（D）J recombination activating gene，Rag-1[J]. Cell，59（6）：1035-1048. doi：10.1016/0092-8674（89）90760-5.

Silva-Santos R，Ramirez J L，Galetti Jr P M，F(xiàn)reitas P D. 2018. Molecular evidences of a hidden complex scenario in Leporinus cf. friderici[J]. Frontiers in Genetics，9：47. doi：10.3389/fgene.2018.00047.

Steffen W，Richardson K，Rockstr?m J，Cornell S E，F(xiàn)etzer I，Bennett E M，Biggs R，Carpenter S R，de Vries W，de Wit C A，F(xiàn)olke C，Gerten D，Heinke J，Mace G M，Persson L M ，Ramanathan V，Reyers B，S?rlin S. 2015. Sustainability. Planetary boundaries：Guiding human development on a changing planet[J]. Science，347（6223）：1259 855. doi：10.1126/science.1259855.

Tamura K，Stecher G，Peterson D，F(xiàn)ilipski A，Kumar S. 2013. MEGA6：Molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J]. Molecular Biology and Evolution，30（12）：2725-2729. doi：10.1093/molbev/mst197.

Thompson J D，Gibson T J，Plewniak F，Jeanmougin F，Higgins D G. 1997. The CLUSTAL_X windows interface：Flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]. Nucleic Acids Research，25（24）：4876-4882. doi：10.1093/nar/25.24.4876.

Wang Y，Shen Y J，F(xiàn)eng C G，Zhao K，Song Z B，Zhang Y P，Yang L D，He S P. 2016. Mitogenomic perspectives on the origin of Tibetan loaches and their adaptation to high altitude[J]. Scientific Reports，6：29690. doi：10.1038/srep 29690.

Wu T H，Tsang L M，Chow L H，Chen I S，Chu K H. 2019. Cryptic lineages and hybridization of the predaceous chub Parazacco spilurus（Actinopterygii，Cypriniformes，Xenocyprididae） in Hong Kong[J]. Hydrobiologia，826（1）：99-111. doi：10.1007/s10750-018-3720-y.

Xie J Y，Tang W J，Yang Y H. 2018. Fish assemblage changes over half a century in the Yellow River，China[J]. Ecology and Evolution，8（8）：4173-4182. doi：10.1002/ece3.3890.

Yu D，Chen M，Tang Q Y，Li X J，Liu H Z. 2014. Geological events and Pliocene climate fluctuations explain the phylogeographical pattern of the cold water fish Rhynchocypris oxycephalus（Cypriniformes：Cyprinidae） in China[J]. BMc Evolutionary Biology，14（1）：225. doi：10.1186/s12862-014-0225-9.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）