間充質(zhì)干細(xì)胞胞外囊泡的研究及應(yīng)用進(jìn)展*

郭春，葉小康

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院1.公共技術(shù)平臺(tái)，2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，浙江 杭州310012）

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSC）是一類具有自我更新和多向分化潛能的多能干細(xì)胞，因其獨(dú)特的分化潛能、造血支持和免疫調(diào)控等特性，MSC 已作為一種細(xì)胞治療手段被廣泛的應(yīng)用于多種疾病。最初，MSC 被認(rèn)為可巢居到受損部位后，通過定向分化成靶細(xì)胞和直接的細(xì)胞間相互作用來發(fā)揮功能[1]。然而，有研究表明MSC 巢居到損傷部位的比例和分化為靶細(xì)胞的數(shù)量都是非常有限，且移植后產(chǎn)生治療效應(yīng)的時(shí)間與其所需的漫長的遷移分化時(shí)間不符，后續(xù)研究表明MSC通過旁分泌攜帶活性的蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子和核酸類物質(zhì)的細(xì)胞外囊泡（EVs）方式發(fā)揮對(duì)器官的修復(fù)、保護(hù)及治療功能[2]。盡管極具應(yīng)用潛力，但由于對(duì)MSC-EVs 的研究尚在摸索階段，且缺乏靈敏的EVs 制備和分析技術(shù)，所以在臨床轉(zhuǎn)化上仍有障礙。

1 EVs的分類命名及分子組成

EVs 由細(xì)胞主動(dòng)釋放到細(xì)胞外環(huán)境中的納米級(jí)膜性囊泡，根據(jù)EVs 大小和來源的不同將其大致分為3 類：①凋亡小體800～5000 nm，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)從細(xì)胞脫落而產(chǎn)生；②微囊泡（MVs）200～1 000 nm，由質(zhì)膜以直接出牙的方式產(chǎn)生，MVs 產(chǎn)生過程與胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度的增加和細(xì)胞膜骨架的重構(gòu)有關(guān)；③外泌體（Exos）30～150 nm，由多囊體分泌，主要通過胞吐過程釋放，與細(xì)胞骨架的激活和鈣離子濃度相關(guān)[3]。

EVs 富含脂類、胞漿蛋白、核酸等物質(zhì)，且其蛋白組成在一定程度上可以指示生物來源和分類[4]。MSC-EVs 有著與其他細(xì)胞EVs 相似的內(nèi)容物，如TSPAN 蛋白超家族CD63、CD9、CD81 和熱休克蛋白HSP70、HSP90 等，這些是分析鑒定EVs的重要標(biāo)志物。此外，MSC-EVs 還有其特異的標(biāo)志物及獨(dú)特的內(nèi)容物：一方面MSC-EVs 可表達(dá)其母細(xì)胞表面特異性分子如CD44、CD90 等[5]；另一方面MSC-EVs 富含與其修復(fù)再生功能密切相關(guān)的miRNA、白細(xì)胞介素、核因子κB 信號(hào)通路及多種生長因子，這些獨(dú)特的物質(zhì)使其在維持組織穩(wěn)態(tài)和平衡中扮演著重要的角色[6]。如在一項(xiàng)急性腎損傷模型研究中發(fā)現(xiàn)，MSC-EVs 可以降低CX3C 趨化因子配體1 的表達(dá)，減少巨噬細(xì)胞浸潤，進(jìn)一步的研究顯示MSC-EVs 中所含與CX3C 趨化因子配體1相關(guān)的miRNA 發(fā)揮了抗炎作用[7]。

2 EVs分離方法

EVs 在大小、起源及分子組成上都存在較大的異質(zhì)性，此外，其還存在于不同的復(fù)雜生物液體中。因此，EVs 的分離和純化被認(rèn)為是生物醫(yī)學(xué)研究和臨床轉(zhuǎn)化的必要前提。

差超速離心法是目前EVs 分離中應(yīng)用最廣泛的方法，此方法獲得的EVs 量多，但純度不足。為了進(jìn)一步改善超速離心法分離的純度，研究者提出了基于梯度介質(zhì)的密度梯度離心法，該法較差速離心法提得的EVs 純度更純，但是操作更為繁瑣，離心耗時(shí)也更長。最近，基于聚合物共沉淀技術(shù)的商品化試劑盒也被廣泛用于EVs 分離。但其缺點(diǎn)在于這樣分離到的EVs 可能會(huì)受到聚合物和一些蛋白質(zhì)的污染，從而對(duì)后續(xù)的功能性分析產(chǎn)生影響。免疫親和法是將磷脂酰絲氨酸與磁珠結(jié)合，利用親和原理捕獲EVs 的磷脂酰絲氨酸。該方法獲得的EVs 形態(tài)完整，純度最高。不過該法成本較高，不適合從大樣本中提取EVs，使用該方法前需多樣本進(jìn)行濃縮。

此外，還有一些隨著納米技術(shù)發(fā)展而興起的新型富集方法?；谖⒘骺丶夹g(shù)的分離檢測(cè)具有所需樣本小、檢測(cè)速度快及純度高等優(yōu)點(diǎn)，因此研究人員在微流控技術(shù)的基礎(chǔ)上結(jié)合聲波[8]、介電電泳、微流體黏彈性[9]等特性成功發(fā)展了多種新穎EVs 分離方法，但微流控技術(shù)仍然存在通量低，回收量少的缺點(diǎn)。流式分選法基于流式分析和分選技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)單顆粒、多參數(shù)及高通量分選，但需先對(duì)EVs 進(jìn)行特異性熒光抗體標(biāo)記。此外還需高精度的納米流式儀器、專業(yè)的技術(shù)調(diào)試，故應(yīng)用受到一定限制。

綜上所述，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、特異高效的方法就目前而言似乎不存在，但是未來卻有無限可能。就目前來看，將多種分離方法聯(lián)合使用就是不錯(cuò)的選擇。DAVIES 等[10]結(jié)合微流體和過濾2 種方法，將納米多孔膜整合到微流控芯片上，形成微流控過濾系統(tǒng)。相對(duì)于常規(guī)的過濾方法，這種裝置可以通過改變致孔溶劑與預(yù)聚物溶液的比例控制納米孔的尺寸，使其適合于外泌體的提取和分離。并且此方法采用電泳驅(qū)動(dòng)過濾，消除了一些可溶性蛋白的干擾，從而提高了純度。另外值得注意的是，牛血清白蛋白因本身含有一定功能效應(yīng)的囊泡，會(huì)對(duì)MSC-EVs 蛋白的定量和定性檢測(cè)造成干擾，并直接影響下游功能驗(yàn)證，建議整個(gè)分離過程不要使用[11]。

3 EVs鑒定方法

目前對(duì)EVs 的鑒定主要從其物理特征和表面特異性標(biāo)志物兩方面進(jìn)行。顯微鏡觀察法已被廣泛應(yīng)用于EVs 表征分析，包括掃描電子顯微鏡技術(shù)（SEM）、透射電子顯微鏡技術(shù)（TEM）及冷凍電子顯微鏡技術(shù)（Cryo-SEM）等。SEM 是在真空條件下進(jìn)行，因固定和干燥使EVs 在鏡下成扭曲的杯狀梭型。TEM 較SEM 具有更高的分辨率，且還能與免疫金標(biāo)技術(shù)聯(lián)合使用進(jìn)行EVs 分子分析鑒定，得到其表面特征分子的信息[12]。Cryo-SEM 是一種在極低溫度環(huán)境下進(jìn)行樣本分析的電鏡技術(shù)，其的最大優(yōu)勢(shì)在于避免了固定和干燥處理對(duì)EVs 物理形態(tài)和化學(xué)特性的影響。此外，原子力顯微鏡技術(shù)也可用于EVs 的表面結(jié)構(gòu)及性質(zhì)分析[13]。納米粒子跟蹤分析技術(shù)是表征EVs 大小及分布的另一常用方法。其原理是基于光散射和布朗運(yùn)動(dòng)的性質(zhì)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)50～1000 nm 直徑范圍內(nèi)特定的EVs 和MVs逐個(gè)直接成像和觀察，得到與之相關(guān)的高分辨率的粒度分布和濃度信息。同樣基于布朗運(yùn)動(dòng)的還有動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)，但該技術(shù)是對(duì)EVs 進(jìn)行整體分析，而非逐一單個(gè)的分析。上述方法均有樣本量小、快速、易用等優(yōu)點(diǎn)。但存在通量低，不能同時(shí)獲得多參數(shù)信息、無法區(qū)分粒徑相同的蛋白聚集體等局限。因此，需聯(lián)合使用其他“定性”技術(shù)以獲得更為準(zhǔn)確的結(jié)論。

傳統(tǒng)的EVs 定性方法主要有Western blotting 和ELISA，其可對(duì)細(xì)胞外囊泡中總蛋白表達(dá)量及特異性標(biāo)志物進(jìn)行分析。但因所需樣本量大、耗時(shí)、操作過程繁瑣等缺點(diǎn)，在EVs 臨床研究中并不適用，對(duì)一些低表達(dá)或稀有樣本的EVs 分析尤其不適用。流式細(xì)胞術(shù)因其高通量、多參數(shù)、單顆粒的特性贏得了越來越多研究者青睞。雖然EVs 的亞微米直徑、非均質(zhì)性特點(diǎn)讓流式檢測(cè)EVs 依然面臨諸多挑戰(zhàn)[14]，但隨著高敏感性納米流式儀的推出，設(shè)備本身的分辨率和敏感性將不會(huì)成為流式分析EVs的瓶頸，目前困擾流式技術(shù)分析外泌體的問題主要集中在樣品的前處理、流式方法的標(biāo)準(zhǔn)化及EVs標(biāo)志物尋找。MSC-EVs 因同時(shí)表達(dá)MSCs 表面特異性的分子，可作為特異性標(biāo)志物鑒定的依據(jù)。此外，MSCs 還具有分泌能力強(qiáng)、分泌量多的特點(diǎn)，這使得MSC-EVs 的分析鑒定具有其他EVs 無可比擬的優(yōu)勢(shì)。

4 MSC-EVs生物學(xué)功能

雖然因來源及所處的微環(huán)境不同，MSC-EVs內(nèi)含物的種類和數(shù)量有所差異，但其作用于靶細(xì)胞的方式基本相同，主要包括3 大類[15-16]：①識(shí)別靶細(xì)胞表面的特異性受體，通過受體-配體相互作用激活或者抑制靶細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；②直接與受體細(xì)胞的質(zhì)膜相互融合，將細(xì)胞膜表面受體分子和脂質(zhì)體傳遞給受體細(xì)胞；③通過內(nèi)吞或靶向傳遞其內(nèi)含的生物活性物質(zhì)。MSC-EVs 的主要生物學(xué)功能將在下文進(jìn)行闡述。

4.1 組織損傷修復(fù)

早在2009年BRUNO 等[17]通過復(fù)制甘油誘導(dǎo)的小鼠急性腎衰竭模型證實(shí)了MSC-EVs 在急性腎損傷中的治療潛力。此后MSC-EVs 便被廣泛的應(yīng)用于多種組織損傷動(dòng)物模型中。在心肌梗死模型中，用轉(zhuǎn)染了GATA-4基因的MSC-Exos 對(duì)小鼠心肌內(nèi)注射治療發(fā)現(xiàn)，MSC-Exos 能有限縮小梗死面積，增強(qiáng)心肌保護(hù)作用并促進(jìn)其功能修復(fù)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明MSC-Exos 的修復(fù)功能主要與其攜帶的microRNAs 介導(dǎo)的抗凋亡作用相關(guān)[18]。LONATI 等[19]以大鼠模型來研究MSC-EVs 對(duì)肺損傷的修復(fù)作用，其首先復(fù)制了1 個(gè)180 min 的肺灌注大鼠模型，隨后采集灌注樣品進(jìn)行氣體分析評(píng)估和肺活檢分析，發(fā)現(xiàn)MSC-EVs 可以有效緩解因肺缺血引起的ATP 降低，上調(diào)參與炎癥和氧化應(yīng)激的相關(guān)基因，且生物學(xué)分布分析顯示，MSC-EVs 在肺組織內(nèi)被保留并在肺細(xì)胞內(nèi)被內(nèi)化。該研究表明非細(xì)胞的EVs 治療可能是修復(fù)受損肺的一個(gè)有價(jià)值的策略。LEE 等[20]的在另一項(xiàng)肺缺氧損傷模型中得出了類似的結(jié)論，該研究發(fā)現(xiàn)MSC-Exos 可以通過抑制STAT3 信號(hào)通路的活化和miRNA-17 超家族簇的上調(diào)，增加miR-204 這一關(guān)鍵microRNA 在肺內(nèi)的表達(dá)，從而修復(fù)缺氧組織，緩解缺氧引起的肺動(dòng)脈高壓。

4.2 神經(jīng)性保護(hù)和再生

SHEN 等[21]的一項(xiàng)腦內(nèi)出血大鼠模型研究證實(shí)，miR-133b 修飾的MSC-Exos 能通過抑制腦出血后ras同源基因家族成員A 的表達(dá)及激活ERK1/ERK2/CREB 信號(hào)通路來抑制腦梗死后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的自我修復(fù)。FAN 等[22]將20 周齡的糖尿病小鼠用作糖尿病周圍神經(jīng)病變（DPN）模型，對(duì)其進(jìn)行為期8 周的MSC-Exos 尾靜脈注射，結(jié)果顯示MSC-Exos 治療DPN 可以顯著降低糖尿病小鼠的熱刺激和機(jī)械刺激閾值，并提高神經(jīng)傳導(dǎo)速度。進(jìn)一步的microRNA（miRNA）芯片和生物信息學(xué)分析表明MSC-Exos 包含大量靶向Toll 樣受體TLR4/NF-κB 信號(hào)通路的miRNA，并通過抑制促炎基因來減輕DPN 小鼠的神經(jīng)血管功能障礙，改善周圍神經(jīng)病變。ZHANG 等[23]用MSC-Exos 對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷進(jìn)行治療后發(fā)現(xiàn)，大鼠腦病變邊緣區(qū)的新生上皮細(xì)胞及新生神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量均有顯著增加，神經(jīng)炎癥狀有明顯緩解。這一研究成功證實(shí)了通過促進(jìn)內(nèi)源性血管及神經(jīng)生成，MSC-Exos 可有效促進(jìn)腦功能恢復(fù)和神經(jīng)血管重構(gòu)。

4.3 免疫調(diào)節(jié)

MSC-EVs 可以發(fā)揮MSC 的多種免疫調(diào)節(jié)功能，其參與免疫調(diào)控作用的機(jī)制及在免疫相關(guān)疾病中的治療潛能引起了研究者的廣泛關(guān)注。LI 等[24]研究發(fā)現(xiàn)人臍帶MSC-Exos 通過其高表達(dá)的miR-181c 下調(diào)TLR4 通路，并降低血漿細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β的含量，提高抑炎因子IL-10 水平，從而有效減輕免疫應(yīng)答反應(yīng)，發(fā)揮抗炎作用。ZHANG 等[25]的移植物抗宿主反應(yīng)研究同樣證實(shí)MSC-EVs 的免疫活性，MSC-Exos 能夠通過激活單核細(xì)胞MyD88 依賴的信號(hào)通路誘導(dǎo)產(chǎn)生M2 表型的單核細(xì)胞，從而極化活化的CD4+T 細(xì)胞向Tregs 轉(zhuǎn)化，增加受體小鼠的Tregs，延遲同種異體皮膚移植排斥反應(yīng)，提高移植的存活率。ZHAO 等[26]的最新研究發(fā)現(xiàn)脂肪MSC-Exos 可從脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)移至巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)M2 型巨噬細(xì)胞極化，緩解炎癥反應(yīng)，這些發(fā)現(xiàn)有望為肥胖和糖尿病等疾病的治療提供潛在方案。此外，MSC-EVs 還表達(dá)程序性死亡配體1 和乳糖凝集素，兩者是CD4+CD25+T 細(xì)胞介導(dǎo)調(diào)控的關(guān)鍵效應(yīng)分子，可以促進(jìn)Treg 細(xì)胞增殖，同時(shí)MSCEVs 還參與誘導(dǎo)活化的細(xì)胞毒性T 細(xì)胞凋亡，并含有重要的負(fù)性免疫調(diào)控因子TGFβ1，可有效抑制自身免疫反應(yīng)引起的組織損傷[27]。

4.4 自噬調(diào)節(jié)

MSC 來源的外泌體可通過mTOR 通路和p53-Bnip3 通路調(diào)控宿主細(xì)胞自噬，從而對(duì)疾病起到治療作用。XIAO 等[28]復(fù)制小鼠心肌梗死模型，并在心肌梗死后肌肉注射骨BMSCs，之后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BMSCs 的移植能有效減少心肌梗死后心肌細(xì)胞的凋亡，改善心臟功能。而進(jìn)一步的研究證實(shí)是BMSCs分泌的BMSC-Exos 發(fā)揮了調(diào)控作用。BMSC-Exos 中的miR-125b 作用于心肌細(xì)胞，介導(dǎo)p53-Bnip3 信號(hào)通路下調(diào)心肌細(xì)胞的自噬水平，減少心肌細(xì)胞自噬性死亡。LO 等[29]將大鼠腎上皮細(xì)胞（NRK-52E）與人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體（hucMSC-Exos）共培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)hucMSC-Exos 可增加NRK-52E 中自噬標(biāo)志性蛋白LC3B 的表達(dá)，并上調(diào)自噬相關(guān)基因atg5、atg7。進(jìn)一步腎毒性大鼠模型研究結(jié)果顯示，hucMSC-Exos 移植對(duì)腎損傷有治療作用，由此可以推測(cè)hucMSC-Exos 可通過mTORC1通路介導(dǎo)的自噬來緩解大鼠腎臟損[29]。EBRAHIM等[30]在糖尿病腎病大鼠模型研究中也得出了一致的結(jié)論。

MSC-EVs 攜帶大量miRNA、mRNA 及各類因子，在組織損傷修復(fù)及疾病診療領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，總結(jié)其作用機(jī)制主要有抗炎、抗凋亡、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)、自噬調(diào)節(jié)及促血管生成等方面。見表1。

表1 MSC-EVs的應(yīng)用領(lǐng)域及作用機(jī)制

5 MSC-EVs的應(yīng)用前景

近年來EVs 特別是Exos 受到了廣泛的關(guān)注，已成為精準(zhǔn)醫(yī)療時(shí)代的一個(gè)臨床熱點(diǎn)領(lǐng)域。MSC 作為一種EVs 分泌能力最強(qiáng)的細(xì)胞類型，更是贏得了科研工作者的青睞。有研究發(fā)現(xiàn)MSC-EVs 在輻射損傷救治領(lǐng)域具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，MSC-EVs 除具備MSC 相當(dāng)?shù)拇僭煅到y(tǒng)重建及組織修復(fù)功能外，還避免了治療過程中異常分化，增殖、阻塞血管等MSC 內(nèi)在的缺陷[31]。MSC-EVs 有較母體小的多的體積、更易透過血腦等生物屏障、性質(zhì)穩(wěn)定、可進(jìn)行大規(guī)模制備等特性，這些優(yōu)勢(shì)使MSC-EVs 有望取代MSCs，在組織修復(fù)再生及免疫調(diào)節(jié)領(lǐng)域發(fā)揮重要作。

MSC-EVs 除本身可以用于疾病治療外，還可作為天然的基因和藥物載體。EVs 的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)在靶向運(yùn)輸?shù)倪^程中可有效保護(hù)其搭載的藥物及內(nèi)容物，防止被稀釋或酶類降解。EVs 的類似于細(xì)胞膜的組成和結(jié)構(gòu)使其可以有效降低自身免疫反應(yīng)，具有較好的生物相容性，使得搭載的藥物能與靶細(xì)胞進(jìn)行高效結(jié)合并發(fā)揮效應(yīng)。已有一些相關(guān)研究證實(shí)了外泌體載藥的可行性及高效性。如已有研究報(bào)道利用電穿孔方法將藥物轉(zhuǎn)入MSCExos，實(shí)現(xiàn)MSC-Exos 對(duì)藥物的運(yùn)載[32]。PASCUCCI等[33]首次證實(shí)了干細(xì)胞來源的微泡具有搭載并運(yùn)輸藥物至靶細(xì)胞的能力。將包含有紫杉醇的MSCMVs 與胰腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)MSC-MVs 的抗腫瘤增殖效果顯著增強(qiáng)，這說明MSC-MVs 靶向運(yùn)輸紫杉醇至胰腺癌細(xì)胞發(fā)揮了抗腫癌效應(yīng)。此外，還可將感興趣的基因或RNA 整合至EVs，然后以膜融合方式將其釋放至靶細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。LOU等[34]的研究就為這一潛在應(yīng)用提供有力的證據(jù)，將miR-122 包裹入脂肪來源的MSC-Exos 中，miR-122修飾的MSC-Exos 可以介導(dǎo)miR-122 在脂肪MSC 與肝癌細(xì)胞之間的通訊，改變miR-122靶基因在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)，使癌細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感。

MSC-EVs 的應(yīng)用前景毋庸置疑，但是就目前的水平而言，MSC-EVs 的深入研究及臨床轉(zhuǎn)化仍存在很多限制：①M(fèi)SC-EVs 的獲取方法是第一大瓶頸，至今尚無一種能集經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、簡(jiǎn)單高效、高純無損于一體的EVs 提取方法，EVs 的產(chǎn)量和純度均無法保證；②MSC-EVs 的分析鑒定尚無標(biāo)準(zhǔn)化流程，不同來源的EVs 的標(biāo)志物并不十分明確，EVs 的數(shù)量無法標(biāo)準(zhǔn)量化給臨床研究帶來更大的挑戰(zhàn)；③MSC-EVs 的組織修復(fù)，免疫調(diào)控等生物學(xué)功能的機(jī)制闡述尚不十分清楚，部分功能還存在爭(zhēng)議，故還需更多體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，尤其是臨床轉(zhuǎn)化的安全性需進(jìn)一步評(píng)估。

綜上所述，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，MSCEVs 成分及功能的研究越發(fā)成熟，MSC-EVs 作為一種非細(xì)胞性治療方式，有著廣闊的應(yīng)用前景。