脂肪因子Vaspin在非酒精性脂肪性肝病中的表達(dá)及其臨床意義*

陳香梅，張亮，齊立明，孫磊，王鵬

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院 病理科，北京100015）

我國肝臟疾病中非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD）患病率僅次于病毒性肝炎，已成為第一大慢性疾病及肝功異常的首要原因，且患病年齡逐漸年輕化，嚴(yán)重威脅人們的身體健康[1]。在NAFLD 發(fā)生機制中，脂肪組織特別是內(nèi)臟脂肪組織有著重要作用[2]。NAFLD 患者血清內(nèi)臟脂肪組織來源的Vaspin 水平明顯升高，是機體針對胰島素抵抗的一種代償機制，也可以抑制促炎脂肪因子抗胰島素蛋白、瘦素和腫瘤壞死因 子-α （tumor necrosis factor-α, TNF-α） 的 表達(dá)[3-4]。目前，Vaspin 是緩解肥胖、降低胰島素抵抗的新靶點，其研究多集中在肥胖人群、2 型糖尿病人群血清學(xué)和高脂飲食誘導(dǎo)的動物模型[5-7]。鑒于脂肪因子主要通過胰島素抵抗、肝脂肪變性、肝炎癥及肝纖維化4 個方面來參與NAFLD 的病程進展[8]，本研究初步探索Vaspin 在NAFLD 不同病理分級肝臟中的表達(dá)及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧分析2016年10月—2019年10月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院收治的78例NAFLD 患者臨床病理資料。其中，男性41 例，年齡（38±13）歲；女性37 例，年齡（48±12）歲?；颊呔M行超聲引導(dǎo)下肝臟組織細(xì)針穿刺手術(shù)，并對肝臟標(biāo)本進行病理分析。其中，脂肪肝患者52例（脂肪肝組），非脂肪肝患者26例（非脂肪肝組）。

1.2 主要儀器及試劑

多功能自動染色機ST5050（德國Leica 公司）。Gomori 網(wǎng)狀纖維染色試劑盒（上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司），免疫組織化學(xué)試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），山羊血清一抗Vaspin（英國Abcam公司，ab238745），轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）（英國Abcam 公司，ab66043），二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，PV-6000D）。

1.3 方法

1.2.1 HE 染色將NAFLD 患者的肝臟組織蠟塊連續(xù)切片6 張，每張切片厚4 μm。取其中一張切片采用多功能自動染色機進行HE 染色。操作步驟：烤片約30 min，二甲苯脫蠟，100% 乙醇、100%乙醇、95%乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇各5 min，水洗，蘇木精5 min，水洗，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，水洗，1%氨水返藍(lán)，水洗，伊紅3 min，梯度酒精（低濃度至高濃度）脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.2 網(wǎng)織Gomori 銀染色常規(guī)脫蠟至水，0.5%高錳酸鉀水溶液氧化5 min，水洗，1%草酸漂白至無色（1～2 min），水洗，2%鐵明礬溶液媒染5 min，蒸餾水沖洗，浸銀氨液40～60 s，蒸餾水沖洗，10%甲醛還原10 s，蒸餾水沖洗，5%硫代硫酸鈉溶液固定2 min，水洗，脫水、透明、封片。網(wǎng)狀纖維呈黑色，膠原纖維呈棕色。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育10min，pH 6.0 檸檬酸鹽抗原修復(fù)緩沖液熱高壓修復(fù)抗原2 min，山羊血清封閉室溫孵育10 min，一抗Vaspin（1∶400 稀釋）和TGF-β（1∶200稀釋）4℃孵育過夜，二抗30 min，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片。

1.2.4 結(jié)果判讀①肝臟炎癥程度：依據(jù)炎癥程度分為3 級（G 0～3）：G0 為無炎癥；G1 為腺泡3 帶呈少數(shù)氣球樣肝細(xì)胞，腺泡內(nèi)散在個別點灶狀壞死；G2為腺泡3帶明顯氣球樣肝細(xì)胞，腺泡內(nèi)點灶狀壞死增多，匯管區(qū)輕、中度炎癥；G3為腺泡3帶廣泛的明顯氣球樣肝細(xì)胞，腺泡內(nèi)點灶狀壞死明顯，匯管區(qū)輕、中度炎癥伴/或匯管區(qū)周圍炎癥。②肝臟纖維化程度：依據(jù)纖維化范圍和形態(tài)分為4級（S 0～4）：S0為無纖維化；S1 為腺泡3 帶局灶性或廣泛的竇周/細(xì)胞周纖維化；S2 為纖維化擴展到匯管區(qū)，局灶性或廣泛的匯管區(qū)星芒狀纖維化；S3 為纖維化擴展到匯管區(qū)周圍，局灶性或廣泛的橋接纖維化；S4 為肝硬化。③免疫組織化學(xué)結(jié)果判讀：隨機采集10 個高倍視野，染色顯示胞漿棕黃色顆粒即為抗原陽性物，無著色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3分；無陽性細(xì)胞為0分；陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分，＞10%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分；兩項計分相乘，結(jié)果0分為陰性（-），1～4分為弱陽性（+），5～8分為陽性（++），9～12分為強陽性（+++）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）或中位數(shù)和四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，比較用方差分析或秩和檢驗，兩兩比較用LSD-t檢驗或χ2檢驗；計數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗；等級資料以等級表示，比較用秩和檢驗；相關(guān)性分析用Spearman法，影響因素的分析用多因素逐步Logistic 回歸模型，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組患者的臨床病理特征

依據(jù)肝細(xì)胞脂肪變性占據(jù)小葉面積的范圍分為5級：F0 ≤5%，F(xiàn)1 ＞5%～30%，F(xiàn)2 ＞30%～50%，F(xiàn)3 ＞50%～75%，F(xiàn)4 ＞75%。肝臟HE染色和Gomori銀染色見圖1。

圖1 各組肝臟組織病理切片 （HE染色×100）

各級NAFLD 患者性別比較，經(jīng)χ2檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各級NAFLD 患者年齡、身高、體重、體重指數(shù)（BMI）、血清總膽固醇（TCHO）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶（GGT）、總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、空腹血漿葡萄糖（FPG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）比較，經(jīng)方差分析，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

各級NAFLD 患者炎癥程度和纖維化程度比較，經(jīng)秩和檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各級NAFLD 患者Vaspin 和TGF-β 表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），NAFLD 分級越高，Vaspin和TGF-β 表達(dá)水平越低。見表2。

2.2 各組患者肝臟組織Vaspin和TGF-β的表達(dá)

Vaspin 在正常肝臟組織肝細(xì)胞漿中會有少量表達(dá)，隨著NAFLD 肝臟脂肪變性的增加（F 1～3），其表達(dá)也會升高；F4患者的脂滴在肝組織中越來越多，占肝細(xì)胞胞漿的體積越來越大，Vaspin 表達(dá)似有降低。TGF-β 主要表達(dá)在肝細(xì)胞膽管面的胞膜上，隨著肝臟脂肪變性的增加，其表達(dá)降低。見表2和圖2。

表2 各組患者肝臟組織炎癥、纖維化程度及Vaspin、TGF-β表達(dá)水平比較 例

2.3 肝臟組織Vaspin 和TGF-β 表達(dá)分級與其他各項指標(biāo)的相關(guān)性

Vaspin表達(dá)分級與炎癥程度、纖維化程度、TCHO、HDL-C、ALT、AST、ALP、GGT、TBIL、DBIL、HbA1c無相關(guān)性（P＞0.05）。Vaspin表達(dá)分級與TG呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與LDL-C、FPG呈正相關(guān)（P＜0.05）。Vaspin陽性表達(dá)水平越高，TG越低，LDL-C和FPG越高。見表3。

TGF-β表達(dá)分級與炎癥程度、纖維化程度、TG、TCHO、HDL-C、LDL-C、AST、ALP、GGT、TBIL、DBIL、FPG、HbA1c 無相關(guān)性（P＞0.05）。TGF-β 表達(dá)分級與ALP呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），TGF-β表達(dá)水平越高，ALP越低。見表3。

2.4 NAFLD的危險因素分析

脂肪肝組與非脂肪肝組患者的Vaspin 和TGF-β表達(dá)分級，以及ALT、AST、ALP、GGT、TBIL、DBIL、FPG、HbA1c 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），脂肪肝組高于非脂肪肝組。兩組TCHO、TG比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

以是否患脂肪肝為因變量，將單因素分析中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的指標(biāo)（Vaspin表達(dá)分級、TGF-β表達(dá)分級、ALT、AST、ALP、GGT、TBIL、DBIL、FPG、HbA1c）為自變量，進行多因素逐步Logistic回歸，α入=0.05，α出=0.10。結(jié)果顯示，Vaspin表達(dá)分級[=2.987（95%CI：1.065，8.379）]、ALT[=1.062（95%CI：1.014，1.112）]、TBIL [=1.502 （95% CI：1.147，1.967）]、FPG[=13.111（95%CI：1.430，120.195）]是發(fā)生NAFLD的獨立危險因素。見表5。

圖2 各組患者肝臟組織Vaspin和TGF-β的表達(dá) （免疫組織化學(xué)染色×200）

表3 Vaspin、TGF-β表達(dá)分級與其他指標(biāo)的相關(guān)性

表4 脂肪肝組與非脂肪肝組患者的臨床資料比較

表5 NAFLD危險因素的多因素Logistic回歸分析參數(shù)

3 討論

在NAFLD 發(fā)生機制中，脂肪組織特別是內(nèi)臟脂肪組織發(fā)揮著重要的作用。肥胖者身體脂肪分布位置的不同與NAFLD 發(fā)生有關(guān)，脂肪分布于腹腔內(nèi)臟比分布于腹壁具有更大的NAFLD 發(fā)病風(fēng)險[2]。脂肪組織是一個代謝活躍的內(nèi)分泌器官，可通過自分泌/旁分泌分泌多種脂肪因子，包括激素、細(xì)胞因子、補體、生長因子、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白等，參與調(diào)節(jié)飲食、能量平衡及糖脂代謝等[9]。脂肪因子分兩類：一類是脂肪細(xì)胞分泌的激素類，如脂連蛋白等；另一類是脂肪組織中的免疫細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分泌的炎癥免疫相關(guān)的細(xì)胞因子，如TNF-α、白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6, IL-6）等[10]。脂肪因子不僅影響脂肪細(xì)胞的功能，而且可通過循環(huán)系統(tǒng)運送至其他器官及組織來影響代謝。脂連蛋白在NAFLD 進展過程中發(fā)揮代償作用，可以降低胰島素抵抗，減少脂肪變性，有抗炎作用[11]；而TNF-α、IL-6 增加胰島素抵抗，有促炎作用，可使NAFLD 病程惡化[12-13]。尤其高表達(dá)TNF-α 聯(lián)合低表達(dá)脂連蛋白可致胰島素抵抗和NAFLD[14]。有研究證實，脂肪組織擴張可引起脂肪因子改變，進而導(dǎo)致肝單純脂肪變性、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis, NASH）及NASH 相關(guān)肝硬化。脂肪因子作用的失衡是發(fā)生NAFLD或NASH，甚至肝纖維化的重要因素[15]。

目前，脂肪因子瘦素、脂連蛋白、抗胰島素蛋白、內(nèi)脂素、Chemerin 等已在NAFLD 人群、脂肪肝動物模型和2 型糖尿病動物模型中被廣泛研究[16-17]，其在NAFLD 的發(fā)病機制基本清晰，但仍有很多脂肪因子與NAFLD 發(fā)病的關(guān)系不清楚。脂肪因子對NAFLD 的作用機制研究大多是在人群血清學(xué)水平，而人群肝臟組織的脂肪因子表達(dá)研究相對較少。肝臟中脂肪因子直接作用于肝臟，參與NAFLD 進程，很多情況下與血液中脂肪因子的作用不一致，即脂肪因子的肝臟效應(yīng)常常不能通過其在血液中的表達(dá)水平來反映[8]。

Vaspin 是內(nèi)臟脂肪組織來源的絲氨酸蛋白酶抑制劑，是一種從2 型糖尿病大鼠的內(nèi)臟脂肪組織中發(fā)現(xiàn)并分離的脂肪因子[18]。OLETF 大鼠肥胖達(dá)到頂峰并出現(xiàn)胰島素抵抗時，內(nèi)臟脂肪和血漿Vaspin 水平都明顯升高，隨著糖尿病病程惡化并伴隨體重減輕，內(nèi)臟脂肪和血漿Vaspin 水平均明顯下降，因此Vaspin 是胰島素敏感型脂肪因子[19]。Vaspin 廣泛表達(dá)于脂肪、肝臟、胃、下丘腦等組織。內(nèi)臟脂肪組織來源的Vaspin 可以抑制促炎脂肪因子的表達(dá)，如抗胰島素蛋白、瘦素和TNF-α。人體血清Vaspin 水平升高與BMI、胰島素抵抗相關(guān)，低水平血清Vaspin 是2 型糖尿病進展的危險因素[20]。在高脂喂養(yǎng)小鼠模型中，血漿和肝臟Vaspin 表達(dá)水平升高，這可能是機體對高脂飲食誘導(dǎo)的糖脂代謝負(fù)荷的代償性調(diào)節(jié)，外源性Vaspin 蛋白輸注能夠抑制高脂模型肝臟脂肪合成關(guān)鍵酶（脂肪酸合成酶、乙酰輔酶A 羧化酶）的mRNA 表達(dá)，促進脂肪分解限制酶（激素敏感性脂肪酶、肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶）的mRNA 表達(dá)[21]。本研究結(jié)果也顯示，Vaspin 在NAFLD患者肝臟組織中表達(dá)升高，并與血清LDL-C、FPG 呈正相關(guān)，同時也是NAFLD 的獨立危險因素。Vaspin 在正常肝臟組織肝細(xì)胞胞漿中有少量表達(dá)，隨著NAFLD 的進展，Vaspin 表達(dá)進一步升高，并與肝臟組織纖維化呈正相關(guān)。在本研究中由于樣本量較小，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。有研究表明，肥胖人群血液中的Vaspin 與TG、LDL-C 密切相關(guān)[11]，這與本研究中肝臟組織高表達(dá)的Vaspin 與血清LDL-C 呈正相關(guān)一致。肥胖與NAFLD 均為代謝綜合征的表現(xiàn)，因而血液與肝臟中的Vaspin 水平可能具有一致性。