Siva-1在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義*

孔凡彪，鄧洪強(qiáng)，徐勝，王曉通，麥威，龐黎明

（廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院1.結(jié)直腸肛門外科，2.胃腸疝腸瘺外科，廣西 南寧530023）

胃癌是我國常見的消化道腫瘤之一，每年新發(fā)病例約41 萬[1]，嚴(yán)重威脅我國人民的生命健康。隨著分子生物學(xué)研究的深入，分子靶點及分子標(biāo)志物的相關(guān)研究逐漸成為腫瘤研究的熱點。凋亡誘導(dǎo)因子Siva-1 已被證實在多種腫瘤中發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長的功能[2-4]，而其與胃癌相關(guān)的報道甚少。因此中筆者通過分析Siva-1 在胃癌組織中的表達(dá)，為探討Siva-1 在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月—2018年12月廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除的胃癌組織及癌旁組織各54例。其中，男性37例，女性17例；年齡24～76 歲，中位年齡60 歲。胃癌臨床分期參照美國腫瘤聯(lián)合委員會（AJCC）第7 版指南標(biāo)準(zhǔn)[5]，患者均未接受術(shù)前放療、化療。鼠抗人Siva-1 抗體購于美國Proteintech 公司，免疫組織化學(xué)試劑盒購自福州邁新技術(shù)開發(fā)有限生物公司。Trizol 試劑、引物及PCR 試劑盒購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 檢測Siva-1 表達(dá)采用SP 法檢測Siva-1 的表達(dá)。將石蠟標(biāo)本進(jìn)行包埋并連續(xù)切片，每片厚度約4 μm，利用二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟，酒精脫水，3%雙氧水滅活，并在枸櫞酸鈉緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)。然后根據(jù)SP 法對石蠟標(biāo)本進(jìn)行一抗（鼠抗人Siva-1 抗體）、二抗孵育，染色后在光鏡下觀察計數(shù)。磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.2.2 Siva-1陽性結(jié)果判斷Siva-1 蛋白主要表達(dá)于胃癌細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)里出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒，即說明Siva-1 在該細(xì)胞中陽性表達(dá)。采用雙盲法在顯微鏡下對染色的細(xì)胞進(jìn)行觀察和計數(shù)。根據(jù)細(xì)胞的染色程度進(jìn)行評分：未染色計0 分，淡黃色計1 分，棕黃色計2 分，棕褐色計3 分。另根據(jù)染色細(xì)胞占視野細(xì)胞總數(shù)的百分比進(jìn)行評分，陽性細(xì)胞＜1%計0 分，1%～＜25%計1 分，25%～＜50%計2 分，50%～＜75%計3 分，75%～100%計4 分。陽性細(xì)胞強(qiáng)度得分與陽性細(xì)胞百分比得分的乘積即為SP法總分，其中0分為陰性，1～4分為弱陽性，5～8 分為中陽性，9 分以上為強(qiáng)陽性。本實驗將中陽性以上定義為細(xì)胞染色陽性表達(dá)。

1.2.3 qRT-PCR采用qRT-PCR 檢測胃癌及癌旁組織中Siva-1 mRNA 相對表達(dá)量。在液氮中研磨組織，按Trizol 說明書提取組織總RNA 后，利用Thermo BioMate 3S 紫外/可見光分光光度儀測定RNA純度（OD 值）和蛋白質(zhì)濃度。OD260/OD280 范圍為1.8～2.1。按qRT-PCR 試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。反應(yīng)參數(shù)為：16℃、30 min，42℃、30 min，90℃、5 min。反應(yīng)結(jié)束后短暫離心，置于冰上冷卻。然后進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，70℃延伸30 s，共40 個循環(huán)。PCR 引物設(shè)計合成由上海吉凱基因公司完成（見表1）。采用2-△△ct法測定目標(biāo)基因mRNA相對表達(dá)量，用Data Assist（V3.01）軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

表1 PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以構(gòu)成比表示，比較用χ2檢驗，相關(guān)性分析用Pearson 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌及癌旁組織中Siva-1的陽性表達(dá)

Siva-1 在胃癌組織中的陽性表達(dá)率為25.93%（14/54），癌旁組織為94.44%（51/54），經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=52.900，P=0.000），胃癌組織中Siva-1 的陽性表達(dá)低于癌旁組織。見圖1。

圖1 Siva-1蛋白在各組織中的表達(dá) （免疫組織化學(xué)法×400）

2.2 胃癌組織與癌旁組織中Siva-1 mRNA 表達(dá)水平

Siva-1 mRNA 在胃癌組織中相對表達(dá)量為（6.97±1.32），癌旁組織為（78.06±2.98），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-362.450，P=0.000），Siva-1 mRNA 在胃癌組織中低表達(dá)。

2.3 不同臨床病理特征胃癌患者Siva-1陽性表達(dá)率比較

不同年齡、性別、腫瘤分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯、脈管內(nèi)癌栓患者Siva-1 陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；不同腫瘤直徑、腫瘤分期患者Siva-1 陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 不同臨床病理特征的胃癌患者Siva-1陽性表達(dá)率比較 例（%）

2.4 Siva-1表達(dá)水平與腫瘤直徑的相關(guān)性分析

經(jīng)Pearson 相關(guān)性分析，Siva-1 mRNA 相對表達(dá)量與腫瘤直徑呈負(fù)相關(guān)（r=-0.376，P=0.003）。

3 討論

凋亡誘導(dǎo)因子Siva-1 定位在染色體14q（32-33）上，含有175 個氨基酸，在正常組織中均有表達(dá)。有研究表明Siva-1 在乳腺癌和結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平均低于癌旁正常組織，與本研究結(jié)果一致[6-8]，說明Siva-1 作為凋亡因子，可能在腫瘤中扮演著促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的作用，提示Siva-1在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著抑制作用，是一個抑癌基因。

本研究發(fā)現(xiàn)Siva-1 陽性表達(dá)率在不同年齡、性別、腫瘤分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯脈管內(nèi)癌栓患者無差異，在不同腫瘤直徑及腫瘤分期患者有差異；且Siva-1 mRNA 相對表達(dá)量與腫瘤直徑呈負(fù)相關(guān)。即腫瘤直徑越大，mRNA 相對表達(dá)量越低。提示Siva-1 存在作為胃癌臨床病理分期標(biāo)志物的可能。但Siva-1 mRNA 相對表達(dá)量可能與胃癌細(xì)胞的侵犯能力無關(guān)。

細(xì)胞凋亡遵循自身的程序，凋亡的調(diào)節(jié)對維持體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)及正常細(xì)胞形態(tài)至關(guān)重要，腫瘤的發(fā)生一方面由于腫瘤的過度增生，另一方面是由于細(xì)胞凋亡受阻。凋亡過程發(fā)生異常也可造成腫瘤增生[9]。近年來，細(xì)胞凋亡已成為生物醫(yī)學(xué)的研究熱點之一。本研究結(jié)果顯示：相比癌旁組織，胃癌組織中Siva-1 陽性表達(dá)率降低，其促凋亡作用減弱，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞異常增生，表現(xiàn)為腫瘤體積增大，腫瘤分期級別增高。Siva-1 在體內(nèi)外均能與抑癌基因讀碼框移位蛋白發(fā)生直接作用，促進(jìn)抑癌基因讀碼框移位蛋白的泛素化或降解，從而影響P53 的穩(wěn)定性，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞增殖[10]。Siva-1 還可與多種受體結(jié)合，通過其N 末端與CD27、Bcl-2 或Bcl-xl 的C 末端相結(jié)合而發(fā)生相互作用，從而調(diào)控多條信號通路并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在乳腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤細(xì)胞中，具有抑制腫瘤細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移的作用[7]，同時還可以作為化療藥順鉑的增效劑，為腫瘤的靶向治療提供新的思路[8-10]。通過慢病毒干擾人為下調(diào)Siva-1 的表達(dá)后，胃癌細(xì)胞的增殖活性增強(qiáng)，并且胃癌細(xì)胞的對化療藥DDP 的耐藥性也得以提高，與本課題組前期體外實驗結(jié)果一致[13-15]。Siva-1 陽性表達(dá)率在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中無差異，說明Siva-1 陽性表達(dá)率與腫瘤的轉(zhuǎn)移關(guān)系不密切，主要是與腫瘤凋亡關(guān)系相關(guān)，可作為臨床分期標(biāo)志物。

綜上所述，本研究提示Siva-1 的表達(dá)可能與胃癌細(xì)胞個體的生長及凋亡相關(guān)，而與細(xì)胞侵襲運動無關(guān)，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步探索，但隨著對Siva-1 分子機(jī)制的深入研究，其作為潛在的靶向治療靶點的應(yīng)用前景非常廣泛，尤其是其作為化療藥的增效劑將為腫瘤治療提供新的思路。