腹膜透析患者腹主動脈鈣化與外周血淋巴細胞亞群的相關研究

任彩霞 韓昆 劉媛 邢文秀 鹿恩邦 鞏雪 萬美燕

1青島大學 266071；2青島市市立醫(yī)院腎內科 266011

鈣化是慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)的一個顯著特征，與心血管疾病和全因死亡率密切相關[1]。尿毒癥毒素、代謝紊亂、微量元素異常等對腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)患者免疫系統(tǒng)造成很大影響[2]。慢性腎衰竭特別是尿毒癥患者整個免疫系統(tǒng)均發(fā)生復雜的變化，包括天然性免疫和獲得性免疫，既有免疫激活(細胞因子和急性期蛋白增高)，又有免疫抑制(對感染和腫瘤免疫反應障礙，疫苗接種后抗體生成率低)。近來發(fā)現，免疫炎癥通過誘導血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)向成骨細胞轉化、調節(jié)骨代謝因子的表達在血管鈣化(vascular calcification，VC)的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。盡管大量證據表明巨噬細胞是引發(fā)VC的關鍵成分，但天然性免疫細胞和獲得性免疫細胞之間的相互作用尚未得到充分論證[3]。本研究以PD患者為研究對象，分析影響腹主動脈鈣化(abdominal aortic calcification，AAC)的相關因素以及淋巴細胞亞群與AAC的關系，并進一步探討天然性和獲得性免疫在AAC發(fā)病中的作用。

資料與方法

一、研究對象

納入2018年9月至2019年10月在青島市市立醫(yī)院腎內科確診為尿毒癥并進行PD治療的患者作為研究對象。入選標準：持續(xù)不臥床腹膜透析(continuous ambulatory peritoneal dialysis，CAPD)至少3個月且年齡大于18歲，所有患者均使用廣州百特醫(yī)療用品有限公司生產的低鈣腹膜透析液(Na+132 mmol/L，Cl-95 mmol/L，Mg2+0.25 mmol/L，Ca2+1.24 mmol/L，乳酸根40 mmol/L)，透析方式為CAPD，每天換液4次，每次2000 mL，透析劑量為8 L/d，透析齡為44.10(13.20，54.00)個月。排除標準：(1)近3個月內發(fā)生感染或使用抗生素；(2)近3個月內使用激素或免疫抑制劑；(3)近3個月內有過手術或創(chuàng)傷史；(4)有精神疾患或無法配合者；(5)其他嚴重疾病，如惡性腫瘤、嚴重營養(yǎng)不良[4]、動脈瘤、主動脈夾層、肺動脈高壓等。本研究經青島市市立醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

二、方法

1.一般資料收集 記錄患者性別、年齡、透析齡、原發(fā)病(高血壓腎病、糖尿病腎病、慢性腎小球腎炎等)、用藥情況、透析前血壓等。

2.血標本收集 所有入選的患者抽血檢查前禁食8 h，于PD治療前留取血標本，送至我院檢驗科檢測各項血生化指標包括血紅蛋白、白蛋白、血清肌酐、尿素氮、甲狀旁腺激素、血磷、血鈣、堿性磷酸酶、超敏 C 反應蛋白、總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白等。

3.淋巴細胞亞群檢測 所有入選的患者抽血檢查前禁食8 h，于PD治療前留取血標本，送至我院檢驗科使用流式細胞儀檢測，分別得出CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD19+、CD16+CD56+、Treg淋巴細胞比例及CD8+DR+淋巴細胞計數、CD4+/CD8+比值。

4.AAC評分測定 按照改善全球腎臟病預后組織(kidney disease improving global outcomes，KDIGO)指南建議，用側位腹部X線片檢測患者VC情況[5]。由放射科醫(yī)師對患者進行腹部側位X線平片檢查，側位片上以L1～L4范圍內對應的主動脈為腹主動脈，以腰椎間隙為界分為L1～L4段，分別評價AACs。AACs的評定：采用Kauppla等[6]報道的半定量積分系統(tǒng)評分方法，分別評價L1～L4每個節(jié)段腹主動脈前壁、后壁鈣化的嚴重程度，根據該節(jié)段鈣化累及范圍給予1分(范圍<1/3)、2分(范圍1/3～2/3)和3分(范圍>2/3)，累積各節(jié)段的總得分即為該患者的AACs(0～24分)。分別由兩位有經驗的放射科醫(yī)生對腹部側位X平片進行評分，取平均值；若相差5分，則請第3位醫(yī)生對其評分，取3個評分的平均值作為AACs。AACs分為無和輕度鈣化組(0≤AACs≤4分)、中度鈣化組(5≤AACs≤15分)和重度鈣化組(16≤AACs≤24)。

三、統(tǒng)計學方法

采用SPSS22軟件進行統(tǒng)計分析，對計量資料進行正態(tài)性及方差齊性檢驗，正態(tài)分布的數據資料以Mean±SD表示，若方差齊，多組間數據比較采用F檢驗，組間兩兩比較采用LSD檢驗；若方差不齊，多組間數據比較采用Kruskal-WallisH檢驗，組間兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗；非正態(tài)分布數據采用以M(1/4，3/4)表示，采用秩和檢驗。計數資料采用卡方檢驗或者精確概率法。相關性研究采用Spearman相關性分析。Logistic回歸分析患者AAC的危險因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、病例資料

本研究納入腹膜透析患者86例，年齡為(61.6±12.6)歲，其中男52例(60.50%)，39例(75%)發(fā)生AAC；女34例(39.53%)，29例(85.29%)發(fā)生AAC。原發(fā)病包括：糖尿病腎病35例(40.7%)，慢性腎小球腎炎34例(39.5%)，高血壓腎病10例(11.6%)，其他原因7例(8.1%)。

二、不同程度AAC組間臨床資料比較

86例PD患者中無和輕度鈣化41例、中度鈣化28例、重度鈣化17例。3組患者年齡、原發(fā)疾病為糖尿病腎病、慢性腎小球腎炎以及白蛋白、血磷、堿性磷酸酶水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其余生化指標比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。(表1)

表1 不同程度AAC組間臨床資料比較

三、不同程度AAC組間外周血淋巴細胞亞群的比較

3組患者外周血CD8+DR+淋巴細胞計數、Treg細胞百分率、NK淋巴細胞百分率、CD4+/CD8+比值組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其余指標比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。(表2)

表2 不同程度AAC組間外周血淋巴細胞亞群的比較(Mean±SD)

四、AAC與各臨床資料的相關性分析

PD患者AAC與年齡(r=0.352，P<0.05)、透析齡(r=0.284，P<0.05)、甲狀腺激素(r=0.226，P<0.05)、血磷(r=0.299，P<0.05)、堿性磷酸酶(r=0.265，P<0.05)、超敏C反應蛋白(r=0.285，P<0.05)呈正相關，與白蛋白呈負相關(r=-0.222，P<0.05)。(表3)

五、AAC與淋巴細胞亞群的相關性分析

PD患者AAC與CD8+DR+淋巴細胞計數(r=0.292，P<0.05)、NK淋巴細胞百分率(r=0.228，P<0.05)、CD4+/CD8+比值(r=0.236，P<0.05)呈正相關，與Treg細胞百分率(r=-0.354，P<0.05)呈負相關，其余變量與AAC相關系數差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。(表4)

表4 AACs與外周血淋巴細胞亞群的相關性

六、中重度AAC影響因素的多因素Logistic回歸分析

以是否發(fā)生中重度AAC(AACs>4分)為因變量，將年齡、透析齡、甲狀旁腺激素、血磷、堿性磷酸酶、超敏C反應蛋白、白蛋白、CD8+DR+淋巴細胞計數、CD4+/CD8+比值、Treg細胞百分率、NK淋巴細胞百分率作為自變量行二元Logistic回歸分析，結果顯示：高齡(OR=1.060，P=0.024)、CD4+/CD8+(OR=25.441，P=0.023)、Treg(OR=0.427，P=0.001)是AAC的獨立預測因素。(表5)

表5 中重度AAC影響因素的多因素Logistic回歸分析

討 論

在CKD病程發(fā)展中，一系列病理反應如氧化應激、高磷血癥、氮質血癥以及透析等均會導致患者免疫功能改變，T淋巴細胞大量減少，表現出免疫功能下降的狀態(tài)。當CKD發(fā)展至尿毒癥，因毒素潴留、代謝紊亂等影響，免疫激活和免疫抑制兩種狀態(tài)并存[7]。雖然終末期腎衰竭患者存在T淋巴細胞激活，但T淋巴細胞免疫功能是不健全的[8]。免疫系統(tǒng)的慢性激活狀態(tài)加速動脈粥樣硬化、VC和誘發(fā)心功能不全[9]。淋巴細胞是構成免疫系統(tǒng)和執(zhí)行免疫功能的主要細胞群體，進行淋巴細胞亞群分析對于了解機體免疫功能狀態(tài)有重要意義。人體主要的淋巴細胞亞群可以分為T淋巴細胞亞群、B淋巴細胞亞群和NK淋巴細胞亞群。本研究證實了淋巴細胞亞群改變可能與PD患者的AAC有一定的關聯性，為CKD患者AAC防治提供重要的線索及理論依據。

T淋巴細胞(CD3+)介導適應性細胞免疫應答，誘導體液免疫發(fā)揮輔助性作用。Th細胞(CD3+CD4+)即輔助性T細胞、Ts細胞(CD3+CD8+)即殺傷性T細胞，是來自兩個不同亞群的功能性T淋巴細胞，在免疫應答中分別起著正向和負向調節(jié)作用。在機體中，CD8+淋巴細胞決定細胞免疫殺傷功能和組織損傷情況，而CD4+淋巴細胞影響細胞免疫分泌功能。所以，CD4+、CD8+淋巴細胞占據的百分率以及CD4+/CD8+比值是衡量人體細胞免疫功能的重要指標，只有在CD4+/CD8+比值正常，才確保機體免疫功能的正常，一旦出現比值下降或者倒置情況，就表明機體免疫功能出現紊亂[10]。Treg細胞(CD4+CD25+)即調節(jié)性T細胞，在調節(jié)免疫耐受和預防自身免疫性疾病中起著至關重要的作用。Treg細胞除了廣為人知的抑制CD4+和CD8+淋巴細胞的活化功能，還抑制天然免疫細胞諸如單核細胞、巨噬細胞和嗜中性粒細胞等[11-12]。本研究發(fā)現，PD患者AAC與活化的Ts細胞(CD8+DR+)計數、NK淋巴細胞百分率、CD4+/CD8+比值呈正相關，與Treg細胞百分率呈負相關，且多因素Logistic回歸分析提示CD4+/CD8+、Treg細胞百分率為AAC的獨立危險因素。有研究發(fā)現，激活的T淋巴細胞可產生細胞因子如γ-干擾素、轉化生長因子(tumour necrosin factor,TGF)-β、腫瘤壞死因子(turnor necrasis factor,TNF)-α等炎性細胞因子，促進VSMC表達骨堿性磷酸酶和向成骨樣表型轉化，參與VC的調控[13]。通過檢測骨堿性磷酸酶的活性和礦化基質發(fā)現，T細胞分泌TNF-α激活cAMP，誘導VSMC向成骨樣細胞分化[14]。新近的研究發(fā)現，激活的T細胞表達核因子-κB 受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)可直接促進骨保護素的生成，骨保護素在抑制破骨細胞生成和VC中有重要作用，提示T細胞通過RANKL調節(jié)VC的發(fā)生[15]。Treg細胞通過產生TGF-β和IL-10抗炎細胞因子來降低免疫應答[16]。對間充質干細胞的研究表明，TGF-β促進VSMC分化，但在高磷酸鹽條件下降低BMP2的表達[17]。還有研究表明，維持性血液透析患者冠狀動脈鈣化積分與Treg細胞百分率呈負相關[18]。

B淋巴細胞(CD3-CD19+)產生抗體發(fā)揮特異性體液免疫功能。B細胞通過分泌抗體和細胞因子參與鈣化。既往研究證實，較高的血漿自身免疫性疾病相關抗體水平與較高的冠狀動脈鈣化水平相關[19]。本研究發(fā)現，3組不同程度AAC患者中B淋巴細胞百分率無明顯差異，且AAC與B淋巴細胞百分率無明顯相關性。與既往研究不一致，其原因可能是樣本量不足，研究具有一定局限性和缺陷，仍需擴大樣本量做進一步的深入研究。

NK淋巴細胞(CD3-/CD16+CD56+)即自然殺傷細胞，具有識別被病毒感染的細胞表面相應配體后施加殺傷的作用。NK細胞激活，釋放細胞毒性分子、顆粒酶和穿孔素或通過死亡受體配體，導致靶細胞凋亡，參與VC發(fā)生、發(fā)展[20]。另一方面，NK細胞可通過釋放γ-干擾素，TNF或IL-10等炎性細胞因子間接發(fā)揮作用。本研究發(fā)現，PD患者重度鈣化和中度鈣化組NK淋巴細胞百分率高于無和輕度鈣化組，且NK淋巴細胞百分率與AAC呈正相關?？傮w而言，這些觀察結果表明心血管鈣化通過先天性和適應性免疫反應來綜合調節(jié)。

導致CKD患者VC因素較多，傳統(tǒng)危險因素有：老化、吸煙、高血壓、高膽固醇血癥和糖尿病等。除此之外，還有礦物質代謝紊亂、心血管組織過早衰老、炎癥、氧化應激等非傳統(tǒng)危險因素。本研究發(fā)現，AAC與年齡、透析齡、甲狀旁腺激素、血磷、堿性磷酸酶、超敏C反應蛋白呈正相關(P<0.05)，與白蛋白呈負相關(P<0.05)。多因素Logistic回歸分析提示患者年齡為AAC的獨立危險因素，充分說明諸多因素在VC形成中的重要作用，與相關報道一致[21]。研究證實，衰老的VSMC中Runt相關轉錄因子2和堿性磷酸酶的表達顯著上調，細胞向成骨細胞表型轉化，同時年齡也是影響成骨細胞生長和礦化的獨立因素，衰老內皮釋放的囊泡可能通過沉積在胞外基質中促進基質礦化，或者進入血管平滑肌內部促進其發(fā)生成骨樣轉化[22]

綜上所述，本研究表明，PD患者外周血淋巴細胞亞群構成比例與AAC程度密切相關，天然性和獲得性免疫均參與了VC發(fā)生、發(fā)展，免疫治療可能成為PD患者AAC的潛在治療靶點。本研究為小樣本單中心橫斷面研究，今后需加大樣本量，多中心、前瞻性及回顧性研究來進一步探討。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突