健脾補腎方治療肌萎縮側(cè)索硬化的機制研究

朱 瑋，王明哲，李婷婷，劉 云，潘衛(wèi)東

1.海軍醫(yī)科大學(xué)附屬公利醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 200135

2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院腦病科，上海 201203

肌萎縮側(cè)索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是以脊髓前角細胞、腦干運動神經(jīng)核及錐體束受累為主的運動神經(jīng)元?。╩otor neuron disease，MND），是一種發(fā)病后快速進展的致命性神經(jīng)退行性變性疾病，其中主要為散發(fā)性ALS，而家族性ALS 僅占約5%。由于目前尚缺少針對ALS 的確切有效的化學(xué)藥物或生物藥物，因此該病的預(yù)后極差，患者在發(fā)病后2～5 年可因多系統(tǒng)衰竭而死亡[1]。

無論是散發(fā)性ALS 還是家族性ALS，因其表現(xiàn)為漸進性的肌肉痿軟無力甚至萎縮，而歸為中醫(yī)學(xué)的“痿癥”。現(xiàn)代中醫(yī)醫(yī)家認為ALS 的病機多以本虛為主或虛實夾雜，其中本虛以脾腎陽虛為主，而夾雜胃、肝和肺等虧虛，因此多施以健脾益氣補腎之法治療ALS，取得了一定的臨床療效[2]。本課題組基于“脾主四肢肌肉”“腎為作強之官”的中醫(yī)理論，對近300 例ALS 患者進行隨訪，發(fā)現(xiàn)ALS 病程初期多以脾腎陽虛為主證，同時夾雜胃、肝和肺等虧虛；而病程中晚期則除脾腎陽虛之外，還多表現(xiàn)為虛實夾雜兼瘀血痰濕[3-4]。通過明確ALS 的基本病機為脾腎陽虛，并且確立治則為健脾補腎后，制定健脾補腎方（又稱溫腎四君子湯或加味四君子湯），已治療超過500 例ALS患者，取得了較好的臨床療效。

盡管通過施以溫腎健脾法能夠延緩ALS 的病程進展并且改善臨床癥狀，但是尚不清楚其作用機制。研究發(fā)現(xiàn)，無論是在散發(fā)性ALS 還是超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1，SOD1）相關(guān)家族性ALS 動物模型中，含有離子型谷氨酸受體亞基的α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑丙酸受體（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isox-azolepropionic acid receptor，AMPAR）的亞單位谷氨酸受體2（glutamic acid receptor 2，GluR2）所介導(dǎo)的毒性作用均在ALS 的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[1]。

本課題組采用潘衛(wèi)東和KWAK Shin 等[5]建立的模擬ALS 發(fā)生與進展的AR2 小鼠模型，觀察中藥健脾補腎方對AR2 小鼠模型運動功能的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 健脾補腎方

健脾補腎方（即加味四君子湯）為《太平惠民和劑局方》所載四君子湯加黃芪、肉蓯蓉和淫羊藿所組成：人參15 g，茯苓15 g，白術(shù)15 g，甘草10 g，黃芪30 g，肉蓯蓉30 g，淫羊藿25 g。中藥由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院提供。用500 mL蒸餾水煎藥1 h，過濾后取上清液；再加入500 mL蒸餾水煎藥1 h，過濾后取上清液；合并2 次的上清液，用微火煮成50 mL 濃縮藥液；冷卻后，加入無水乙醇，磁力攪拌器上攪拌過夜，25 000g離心20 min；取上清液，恒溫條件下待乙醇蒸發(fā)完全后，用蒸餾水調(diào)整藥液濃度為1 g/mL；高壓滅菌后，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）對中藥的主要成分進行分析和鑒定。

1.2 實驗動物

建立條件性ADAR2（adenosine deaminase acting on RNA 2）基因敲除AR2 小鼠模型[5]，選擇保留部分運動神經(jīng)元功能的AR2 小鼠[3]。

1.3 隨機分組與干預(yù)

將48 只保留部分運動神經(jīng)元功能的AR2 小鼠隨機分為4 組：健脾補腎方低劑量組（12 只），健脾補腎方中劑量組（12 只），健脾補腎方高劑量組（12 只），對照組（12 只）。

4 組小鼠均自由進食和飲水。對照組小鼠除正常飲食外，不給予其他干預(yù)。補腎健脾方低、中、高劑量組小鼠接受補腎健脾方灌胃1 次/d（按人體用藥劑量的1/20 進行配制，低劑量組為15 mg/kg，中劑量組為30 mg/kg，高劑量組為45 mg/kg），連續(xù)干預(yù)9 個月。

1.4 觀察指標[6]

采用單盲法，由不知曉小鼠鼠齡、基因型和分組情況的研究人員對各組小鼠進行觀察。

1.4.1 一般情況

每個月觀察各組小鼠的體質(zhì)量、姿勢、活動度和生存情況。每3 個月檢測各組小鼠的血常規(guī)和肝腎功能。

1.4.2 運動和平衡能力

分別于干預(yù)前以及干預(yù)1、3 和6 個月后對各組小鼠進行疲勞轉(zhuǎn)棒實驗（型號為RD1123-RS-M，上海移數(shù)信息科技有限公司產(chǎn)品）、爬桿實驗（自制實驗器材）、平衡木實驗（自制實驗器材）和跑步機實驗（型號為FT-2000，成都泰盟軟件有限公司產(chǎn)品）。每次實驗一般均在連續(xù)的3 個工作日內(nèi)完成，前2 d 為訓(xùn)練日，第3 天為正式實驗日。每次實驗之前，提前30 min 將小鼠從飼養(yǎng)室轉(zhuǎn)運至實驗場所，以促使小鼠適應(yīng)環(huán)境。

疲勞轉(zhuǎn)棒實驗用于檢測小鼠的動作協(xié)調(diào)性和抗疲勞特性。轉(zhuǎn)軸以20 轉(zhuǎn)/min 的恒定速度轉(zhuǎn)動，記錄小鼠從開始運動至掉落的時間（重復(fù)測試3 次），最長測試時間為300 s，如果小鼠能夠在300 s 內(nèi)不掉落，則無需重復(fù)測試。

爬桿實驗用于檢測小鼠的運動協(xié)調(diào)能力。將小鼠頭朝上放置于高60 cm 爬桿的頂端處，記錄小鼠從頭朝上轉(zhuǎn)為頭朝下所用的時間（桿上掉頭時間），以及從測試開始至小鼠四肢全部著地所用的全程時間（爬桿實驗的全程時間），以評估小鼠的運動協(xié)調(diào)能力。

平衡木實驗用于檢測小鼠的平衡能力、肌力以及運動協(xié)調(diào)力。平衡木一端放置在黑色方盒內(nèi)，將小鼠放置在平衡木另一端。記錄小鼠通過平衡木進入黑色方盒內(nèi)的時間（從開始至小鼠四肢全部進入黑盒中所用的時間）。

跑步機實驗用于檢測小鼠的運動體能和耐力。實驗裝置為變速皮帶跑步機，由一個速度可調(diào)節(jié)的傳送帶以及電擊裝置所組成。傳送帶被分隔成5條跑道，可以同時對6 只小鼠進行測試；電擊裝置的電壓恒定設(shè)為50 V。跑步機實驗分為適應(yīng)階段和測試階段。在適應(yīng)階段，跑步機的傳送帶速度為5 m/min，傳送帶的傾斜角度為0°，將小鼠放入跑道，先進行5 min 的適應(yīng)運動；隨后進入測試階段，將小鼠放入跑道，跑步機的傳送帶速度從5 m/min 緩慢提升至20 m/min（每隔15 min 增加3 m/min），同時將傳送帶的傾斜角度由0°緩慢提升至12°（每隔15 min 增加3°），直至小鼠在傳送帶上的運動時間達到90 min 或其運動能力達到極限，則結(jié)束實驗。如果小鼠被連續(xù)電擊20 s 后仍不能進入正常跑步狀態(tài)，則認為該小鼠的運動能力已達極限。記錄運動時間和運動路程。

1.4.3 脊髓前角神經(jīng)元數(shù)

對條件性ADAR2 基因敲除后AR2 小鼠模型在不同鼠齡時的ADAR2 免疫反應(yīng)性以及缺失免疫反應(yīng)性脊髓前角神經(jīng)元的數(shù)量進行檢測。同時，在干預(yù)1 和3 個月后，檢測補腎健脾方各劑量組小鼠的脊髓前角細胞數(shù)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 15.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。多組均數(shù)的比較采用單因素方差分析，方差不齊采用非參數(shù)檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

4 組小鼠均存活24 周以上。24 周齡時，4組小鼠的體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），肝腎功能的差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 運動和平衡能力

干預(yù)前，4 組小鼠的疲勞轉(zhuǎn)棒實驗、爬桿實驗的桿上掉頭時間與爬桿實驗的全程時間、平衡木實驗以及跑步機實驗的運動時間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

4 組小鼠從干預(yù)第3 個月起，均出現(xiàn)不同程度的運動能力減退。隨著干預(yù)的進行，補腎健脾方各劑量組小鼠的運動和平衡能力均較對照組小鼠有所改善（圖1）。干預(yù)3 個月后，補腎健脾方中劑量組的疲勞轉(zhuǎn)棒實驗、平衡木實驗和跑步機實驗結(jié)果均顯著優(yōu)于對照組（P＜0.05）。干預(yù)6 個月后，補腎健脾方各劑量組的疲勞轉(zhuǎn)棒實驗、平衡木實驗和跑步機實驗的結(jié)果均顯著優(yōu)于對照組（P＜0.05）；補腎健脾方中劑量組和高劑量組爬桿實驗的全程時間均顯著短于對照組（P＜0.05）。

圖1 各組小鼠干預(yù)前以及干預(yù)1、3 和6 個月后的疲勞轉(zhuǎn)棒實驗（A）、爬桿實驗（B）、平衡木實驗（C）以及跑步機實驗（D）結(jié)果的比較。15、30 和45 分別為補腎健脾方低、中和高劑量組。

2.3 脊髓前角神經(jīng)元數(shù)量

干預(yù)3 個月后，小鼠的ADAR2 免疫反應(yīng)性以及缺失免疫反應(yīng)性脊髓前角神經(jīng)元的數(shù)量開始減少，與ALS 的病程進展一致（圖2A）。干預(yù)1 個月和3 個月后，小健脾補腎方中劑量組和高劑量組小鼠的脊髓前角神經(jīng)元數(shù)量均多于對照組（圖2B）。

圖2 選擇性ADAR2 敲除后AR2 小鼠模型在不同鼠齡時的ADAR2 免疫反應(yīng)性（灰色）以及缺失免疫反應(yīng)性（白色）脊髓前角神經(jīng)元的數(shù)量（A）（與Ctl 比較，*P ＜0.05）。在干預(yù)1 和3 個月后，補腎健脾方各劑量組小鼠的脊髓前角細胞數(shù)量（B）（與V 比較，*P ＜0.05，**P＜0.01）。A：Ctl 為對照組，1m、3m、6m、9m、12m 分別為1 個月、3 個月、6 個月、9 個月和12 個月；B：AR2H 為雜合子小鼠模型，AR2 為純合子小鼠模型，V 為溶劑對照組，15、30 和45 分別為補腎健脾方低、中和高劑量組，1m 和3m 分別為1 個月和3 個月，NS 為差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

ALS 是一類病因和發(fā)病機制尚未明確的神經(jīng)退行性變性疾病，呈慢性進展病程。在ALS 早期，基于不同的發(fā)病部位和癥狀而被分成許多亞型，反映出病程進展速度和主要癥狀的差異。大多數(shù)的ALS 患者隨著病程的進展，最后均會出現(xiàn)咽肌、舌肌、口輪匝肌以及頸部以下全部肌肉的無力和萎縮，需要接受呼吸機輔助通氣，以及通過鼻飼管或胃造瘺進食，必須依靠外部輔助手段而存活。目前在國際上已獲得批準的ALS 治療藥物如利魯唑和依達拉奉等的療效并不顯著。也有學(xué)者嘗試采用抗癲癇藥物吡侖帕奈以及間充質(zhì)干細胞治療ALS[7]，但是絕大多數(shù)患者的病情依然無法得到控制。

ALS 在中醫(yī)屬于“痿癥”范疇，中醫(yī)學(xué)認為其發(fā)生和進展應(yīng)分別責(zé)之于“先天”“后天”。中醫(yī)認為“先天因素”就是腎的功能，易患神經(jīng)退行性變性疾?。ㄈ缗两鹕『桶柎暮Ｄ〉龋┚c腎的先天不足有關(guān)?！澳I為作強之官”就是指腎是統(tǒng)帥，是掌管人類出生、生長、發(fā)育、代謝和衰老的指揮中心。中醫(yī)認為“后天”與脾相關(guān)，出生之后的生長發(fā)育和新陳代謝均需得到后天營養(yǎng)以及精氣神的支持，而其來源就是后天之本的脾（陽明經(jīng)絡(luò)）。脾功能正常，后天營養(yǎng)就充足。此外，中醫(yī)認為“脾主四肢肌肉”?！端貑枴吩疲骸罢撗灾勿粽撸毴￡柮骱我?？”《靈樞》云：“太陽為開，陽明為合，少陽為樞……合折則氣所止息，而痿疾起矣。故痿疾者，取之陽明”。因此，在治療ALS 患者的肌肉萎縮時，應(yīng)關(guān)注中醫(yī)脾的功能?！爸勿舄毴￡柮鳌本褪菑娬{(diào)脾胃在痿癥治療中的重要地位。因此，基于中醫(yī)理論，ALS 的發(fā)生和發(fā)展均與腎和脾相關(guān)，治療應(yīng)從補益脾腎入手。健脾補腎方是在傳統(tǒng)四君子湯基礎(chǔ)上增加黃芪、肉蓯蓉和淫羊藿3 味溫腎補氣之藥，以脾腎為中心治療ALS，符合大多數(shù)ALS 患者的證型，諸藥合用可溫腎健脾和胃，強五臟六腑之海，補益氣血，營養(yǎng)宗筋，從而達到“治痿獨取陽明”之目的。

本研究發(fā)現(xiàn)，干預(yù)1、3 和6 個月后，健脾補腎方各劑量組小鼠的運動和平衡能力均較對照組小鼠有所改善。與對照組相比，無論是低劑量、中劑量還是高劑量健脾補腎方，均可顯著延緩模型小鼠脊髓前角神經(jīng)元的衰退。其中，健脾補腎方中劑量組的療效相對優(yōu)于低劑量組和高劑量組。干預(yù)3、6 和9 個月后，健脾補腎方各劑量組小鼠的肝腎功能均未見明顯受損。

雖然在一些神經(jīng)退行性變性疾病如帕金森病的治療中，中醫(yī)藥無法完全替代西藥，但是基于中醫(yī)理論開展辨證論治，也取得了一定的療效[8-9]。本研究發(fā)現(xiàn)，健脾補腎方能夠緩解AR2 小鼠模型的體質(zhì)量下降，改善小鼠四肢的活動能力、肌肉活動的持久性、肌力以及身體的靈活性，這些作用可能與延緩脊髓前角神經(jīng)元的丟失和變性以及降低AR2 小鼠模型的ADAR2 免疫反應(yīng)性有關(guān)。今后需要進一步研究長期使用健脾補腎方是否能夠延緩ALS 的進展。此外，新的觀點認為包括帕金森病和阿爾茨海默病在內(nèi)的神經(jīng)退行性變性疾病的發(fā)病可能與腸道菌群失調(diào)有關(guān)[10-11]，尤其是腸道內(nèi)的一些特殊菌群，而中醫(yī)認為脾主運化水谷精微，因此從脾論治神經(jīng)退行性變性疾病可能會成為中醫(yī)治療的新靶點[12]。

總之，健脾補腎方能夠改善ALS 小鼠的運動和平衡能力，可能與延緩脊髓前角神經(jīng)元的丟失和變性以及降低AR2 小鼠模型的ADAR2 免疫反應(yīng)性有關(guān)，且安全性較高。在當前缺少能夠有效治療ALS 的西藥的情況下，采用健脾補腎方治療ALS 不啻是一種選擇。