單純機(jī)械治療對慢性牙周炎患者齦下菌群微生態(tài)的影響

王延峰， 曾佳駿， 袁喬， 欒慶先

1. 北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院牙周科，口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國家工程實(shí)驗(yàn)室，口腔數(shù)字醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京（100081）； 2. 北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院第二門診部，口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國家工程實(shí)驗(yàn)室，口腔數(shù)字醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京（100101）

牙周炎是以牙菌斑中的致病微生物為始動因素，宿主免疫反應(yīng)等多因素共同作用導(dǎo)致的感染性疾?。?］。齦下菌群微生態(tài)的失調(diào)，以及牙周致病相關(guān)微生物的出現(xiàn)，在牙周炎的發(fā)生和發(fā)展過程中起到了關(guān)鍵性作用［2］。牙周治療的主要方法圍繞減少或消除相關(guān)致病因素為目的，機(jī)械治療包括齦上潔治、齦下刮治及根面平整，作為牙周序列治療的第一步，已被證明可以有效清除菌斑和牙石，緩解局部炎癥，促進(jìn)牙周組織健康［3］。牙周炎的治療效果需要維持長期的穩(wěn)定，作為基礎(chǔ)治療手段，僅機(jī)械治療是否可以改善齦下菌群微生態(tài)的失調(diào)狀態(tài)并維持其長期穩(wěn)定值得關(guān)注。DNA 分子雜交技術(shù)［4］可以實(shí)現(xiàn)對特異DNA 序列的定量檢測，但是只能檢測已知序列的微生物，無法提供菌群的全面信息。基于細(xì)菌16S rRNA 的高通量測序技術(shù)將未知菌的序列與基因庫進(jìn)行相似性比對，在進(jìn)行半定量分析的同時(shí)，極大程度提高了對齦下菌群微生態(tài)的檢測深度和全面性［5］。既往研究中，高通量測序技術(shù)多用于比較牙周炎患者與健康人群齦下菌群微生態(tài)的差異來尋找牙周致病相關(guān)微生物，除了牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis）、齒垢密螺旋體（Treponema denticola）和福賽坦氏菌（Tannerella forsythia）等經(jīng)典牙周致病菌紅色復(fù)合體外，發(fā)現(xiàn)齦溝產(chǎn)線菌（Filifactor alo?cis）、牙髓卟啉單胞菌（Porphyromonas endodontalis）等多個(gè)菌種為牙周致病相關(guān)微生物，而副流感嗜血桿菌（Haemophiluspara influenzae）、內(nèi)氏放線菌（Actinomyces naeslundii）等菌種為牙周健康相關(guān)微生物。目前采用高通量測序技術(shù)比較牙周治療前后齦下菌群微生態(tài)差異的研究，多集中于侵襲性牙周炎且觀察時(shí)間不超過3 個(gè)月［6?8］。本研究采用16S rRNA 高通量測序技術(shù)，對慢性牙周炎單純機(jī)械治療前及之后6 個(gè)月內(nèi)齦下菌群微生態(tài)以及臨床指標(biāo)的變化進(jìn)行探討，為牙周炎的病因?qū)W研究以及機(jī)械治療的長期療效提供依據(jù)。

1 資料和方法

本研究的研究方案通過北京大學(xué)口腔醫(yī)院生物倫理委員會審核（倫理審批號：PKUSSIRB?201839128），符合赫爾辛基宣言倫理原則，并已在中國臨床試驗(yàn)注冊中心注冊（注冊號：ChiC?TR2000029831）。所有受試者納入研究前均已簽署知情同意書。

1.1 研究對象

本研究中，在北京大學(xué)口腔醫(yī)院牙周科就診的患者中篩選根據(jù)1999 年關(guān)于牙周病分類的國際研討會［9］診斷為廣泛型中重度慢性牙周炎的患者。本研究共納入12 名受試者（6 名男性，6 名女性），平均年齡（40.75 ± 9.1）歲，全部完成復(fù)查并進(jìn)入最終分析。納入標(biāo)準(zhǔn)：①全口牙中有附著喪失和骨吸收的位點(diǎn)占總位點(diǎn)數(shù)> 30%，為廣泛型慢性牙周炎；②臨床附著喪失≥3 mm 為中重度。排除標(biāo)準(zhǔn)：①吸煙者；②女性處于懷孕或哺乳期；③有全身系統(tǒng)性疾病，如高血壓病、糖尿病、心血管疾病等；④近半年口服或局部使用抗生素；⑤近半年接受過任何牙周治療；⑥除去第三磨牙后，全口可保留牙少于20 顆。隨機(jī)納入受試者除去第三磨牙和無望保留患牙的上頜單側(cè)區(qū)段，基線探診深度（probing depth，PD）≥4 mm 的患牙及位點(diǎn)。

1.2 臨床指標(biāo)

PD 每顆牙均記錄6 個(gè)位點(diǎn)（頰側(cè)遠(yuǎn)中、中央、近中及舌側(cè)近中、中央、遠(yuǎn)中），使用尖端直徑為0.5 mm 的Williams 牙周探針，采用標(biāo)準(zhǔn)力量以適宜的角度插入袋內(nèi)，遇到阻力之后停止，齦緣所在刻度為PD，取最接近的毫米刻度。出血指數(shù)（bleed?ing index，BI，Mazza，1981）和菌斑指數(shù)（plaque in?dex，PLI，Silness & Lo?e，1964）每顆牙記錄兩個(gè)位點(diǎn)（頰側(cè)、舌側(cè)），記錄指數(shù)分別為0～5 和0～3。

1.3 臨床操作流程

受試者納入研究后，接受口腔衛(wèi)生宣教，并同時(shí)進(jìn)行齦上潔治。齦上潔治后1 周復(fù)診，由檢查者記錄基線臨床指標(biāo)并采集齦下菌斑，受試者隨后轉(zhuǎn)至治療者對PD ≥4 mm 的位點(diǎn)在局麻下進(jìn)行齦下刮治及根面平整，首先超聲齦下刮治去除大塊牙石，再進(jìn)行手工齦下刮治及根面平整，至根面光滑堅(jiān)硬，最后進(jìn)行每顆牙約1 min 的超聲齦下刮治，治療時(shí)間約為30 min。治療后3 個(gè)月和6 個(gè)月，檢查者對受試者進(jìn)行復(fù)查，記錄臨床指標(biāo)并采集齦下菌斑。若在3 個(gè)月復(fù)查時(shí)仍有PD ≥4 mm 位點(diǎn)，轉(zhuǎn)至治療者繼續(xù)進(jìn)行每顆牙1 min 的超聲齦下刮治。

1.4 齦下菌斑采集及16S rRNA V3?4 區(qū)測序

根據(jù)基線臨床指標(biāo)，在受試者研究區(qū)段前磨牙或第一磨牙區(qū)選擇PD ≥4 mm 的最深位點(diǎn)，避開存在根分叉病變位點(diǎn)，采用紙尖法進(jìn)行齦下菌斑取樣。在去除齦上菌斑、軟垢并進(jìn)行隔濕后，將30號吸潮紙尖輕柔地插入牙周袋內(nèi)，遇到阻力時(shí)停止，30 s 后取出放入Eppendorf 管，放置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存。所有樣本送至北京奧維森基因科技有限公司進(jìn)行微生物16S rRNA V3?4 區(qū)測序分析。采用PowerSoil 微生物基因組提取試劑盒（MoBio Laboratories 公司，美國），按照說明書對樣本中的細(xì)菌DNA 進(jìn)行分離提取，隨后利用Illumina MiSeq 平臺進(jìn)行16S rRNA V3?4 區(qū)測序，引物序列（338F：5′?GTACTCCTACGGGAGGCAGCA?3′；806R：5′?GTG?GACTACHVGGGTWTCTAAT?3′）。測序后對有效序列進(jìn)行過濾并去除嵌合體，得到可以用于后續(xù)分析的優(yōu)質(zhì)序列。利用Qiime 軟件對優(yōu)質(zhì)序列按照相似度97%為閾值進(jìn)行聚類，獲得可操作性分類單元（operational taxonomic units，OTUs），并與人類口腔微生物數(shù)據(jù)庫（human oral microbiome data?base，HOMD）進(jìn)行比對，對每個(gè)OTU 進(jìn)行注釋，獲得分類學(xué)信息。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Statistical Product and Service Solutions 23.0 軟件（IBM 公司，美國）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。臨床指標(biāo)采用均值± 標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。對于所有納入位點(diǎn)，不同時(shí)間點(diǎn)兩兩比較采用的是配對樣本的t檢驗(yàn)；對于取樣位點(diǎn)，不同時(shí)間點(diǎn)兩兩比較采用的是Wilcoxon 符號秩檢驗(yàn)；P < 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

微生物Alpha 多樣性指數(shù)采用Mothur 計(jì)算，Turkey 檢驗(yàn)比較不同時(shí)間點(diǎn)間指數(shù)差異；Beta 多樣性分析采用Qiime 軟件進(jìn)行基于Unifrac 的主成分分析（principal coordinates analysis，PCoA），不同時(shí)間點(diǎn)微生物菌群差異的比較采用ANOSIM 相似性分析；微生物門水平、屬水平和種水平相對豐度的比較采用Wilcoxon 符號秩檢驗(yàn)；在組間具有差異的微生物基礎(chǔ)上，通過線性判別分析效應(yīng)（linear dis?criminant analysis effect size，LEfSe）尋找各組樣本間差異最明顯的生物標(biāo)志物，閾值設(shè)定3；P < 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)分析采用R 語言（Stats 包）處理。

2 結(jié) 果

2.1 臨床指標(biāo)

相較于基線，治療后3 個(gè)月和6 個(gè)月臨床指標(biāo)PD、BI、PLI 均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

表1 慢性牙周炎患者治療前后臨床指標(biāo)的變化Table 1 Changes in the clinical parameters of patients with chronic periodontitis before and after treatment

相較于治療后3 個(gè)月，治療后6 個(gè)月所有研究位點(diǎn)的PD 稍有增加，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；取樣位點(diǎn)趨勢相同，但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 微生物Alpha 多樣性及Beta 多樣性分析

對采集樣本進(jìn)行篩選，共有30 個(gè)樣本符合測序要求，基線水平及治療后3 個(gè)月各有12 個(gè)樣本，治療后6 個(gè)月有6 個(gè)樣本。所有滿足測序要求的樣本共產(chǎn)生1 682 483 條優(yōu)質(zhì)序列，經(jīng)過聚類后抽平共獲得700 個(gè)OTUs，平均每個(gè)樣本獲得258.1 個(gè)OTUs。

對各時(shí)間點(diǎn)樣本微生物Alpha 多樣性進(jìn)行分析，Chao 1 指數(shù)反映群落的豐富度，用以估計(jì)群落中的OTU 數(shù)目；Observed species 指數(shù)反映群落的豐富度，為物種的數(shù)量；Shannon 指數(shù)反映群落的多樣性，基線水平、治療后3 和6 個(gè)月的各組樣本之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

表2 治療前后齦下菌斑樣本的微生物多樣性指數(shù)Table 2 Microbial richness and diversity of subgingival samples before and after mechanical debridement

Beta 多樣性的主成分分析，每個(gè)點(diǎn)代表單個(gè)樣本，圖中點(diǎn)與點(diǎn)之間的bray?curtis 距離反映樣本微生物群落組成的相似性，距離越近說明差異越小。基線與治療后3 個(gè)月的樣本多位于不同象限（圖1），治療后3 個(gè)月與基線的樣本微生物群落結(jié)構(gòu)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.014）；治療后6 個(gè)月的樣本散落在上述兩組樣本之間（圖1），與基線、治療后3個(gè)月的微生物群落結(jié)構(gòu)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Figure 1 Principal coordinates analysis of subgingival samples before and after treatment圖1 機(jī)械治療前后齦下菌斑樣本的主成分分析

2.3 微生物群落特征分析

2.3.1 門水平的差異分析 基線時(shí)，樣本中的優(yōu)勢菌門（相對豐度>1%）依次為擬桿菌門（Bacteroide?tes）、變 形 菌 門（Proteobacteria）、厚 壁 菌 門（Fir?micutes）、梭桿菌門（Fusobacteria）、螺旋體門（Spiro?chaetes）和放線菌門（Actinobacteria）；治療后3 個(gè)月，樣本中的優(yōu)勢菌門依次為變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、梭桿菌門、放線菌門、螺旋體門和Saccharibacteria TM7；治療后6 個(gè)月，樣本中的優(yōu)勢菌門依次為變形菌門、梭桿菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門和螺旋體門，具體如圖2 所示。

Figure 2 Mean relative abun?dance of dominant phyla before and after treatment圖2 治療前后微生物群落優(yōu)勢菌門相對豐度圖

治療后3 個(gè)月，樣本中的螺旋體門（11.57% vs.2.19%）和 互 養(yǎng) 菌 門（Synergistetes）（0.33% vs.0.27%）的相對豐度顯著降低（P < 0.05），而Ab?sconditabacteria SR1 的相對豐度顯著升高（0.02%vs.0.08%，P< 0.05）。治療后6 個(gè)月，樣本中上述優(yōu)勢菌門的相對豐度與基線水平和治療后3 個(gè)月的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3.2 屬水平的差異分析 在各時(shí)間點(diǎn)樣本中平均相對豐度排名前25 的菌屬如圖3a 所示。

基線時(shí)，按照相對豐度排序前5 依次為卟啉單胞菌屬（Porphyromonas）15.96%、梭桿菌屬（Fuso?bacterium）14.81% 、密 螺 旋 體 屬（Treponema）11.57%、鏈球菌屬（Streptococcus）7.2%和奈瑟氏菌屬（Neisseria）6.74%。

治療后3 個(gè)月，按照相對豐度排序前5 依次為梭桿菌屬11.11%、嗜血桿菌屬（Haemophilus）10.81%、奈瑟氏菌屬10.0%、鏈球菌屬8.62%和卟啉單胞菌屬6.06%。

治療后6 個(gè)月，排序前5 依次為梭桿菌屬18.75%、奈瑟氏菌屬15.94%、鏈球菌屬6.66%、放線菌屬（Actinomyces）6.50%和卟啉單胞菌屬5.79%。在各時(shí)間點(diǎn)平均相對豐度排名前25 的菌屬中，卟啉單胞菌屬、密螺旋體屬、坦納氏菌屬（Tannerella）在治療后3 個(gè)月時(shí)樣本中的相對豐度顯著降低，產(chǎn)線菌屬（Filifactor）在治療后3 個(gè)月和6 個(gè)月時(shí)均顯著降低（P < 0.05）；二氧化碳噬纖維菌屬（Capnocy?tophaga）和金氏菌屬（Kingella）在治療后3 個(gè)月和6個(gè)月時(shí)相對豐度均顯著升高，而奧托氏菌屬（Ot?towia）在治療后3 個(gè)月時(shí)較基線水平相對豐度顯著升高，而在治療后6 個(gè)月時(shí)較基線顯著降低（P <0.05）。

治療前后樣本中相對豐度發(fā)生顯著性變化（P<0.05）的菌屬如圖3b 所示。

Figure 3 Mean relative abundance at the genus level before and after treatment圖3 治療前后微生物群落菌屬水平相對豐度圖

治療后3 個(gè)月共有13 個(gè)菌屬的相對豐度顯著降低，4 個(gè)菌屬的相對豐度顯著升高；治療后6 個(gè)月共有7 個(gè)菌屬的相對豐度顯著降低，其中伯杰氏菌屬（Bergeyella）在治療后3 個(gè)月時(shí)稍有升高，有7個(gè)菌屬的相對豐度顯著升高。治療后6 個(gè)月與治療后3 個(gè)月相比，樣本中未發(fā)現(xiàn)上述菌屬的相對豐度發(fā)生顯著性變化。

2.3.3 種水平的差異分析 各時(shí)間點(diǎn)樣本中平均相對豐度排名前25 的菌種如圖4a 所示。基線時(shí)，按照相對豐度排序前5 依次為具核梭桿菌（Fuso?bacterium nucleatum）14.81%、牙齦卟啉單胞菌8.26%、牙髓卟啉單胞菌4.23%、嗜沫聚集桿菌（Ag?gregatibactera phrophilus）3.87%和Streptococcus 071 3.71%。

治療后3 個(gè)月，按照相對豐度排序前5 依次為具核梭桿菌11.11%、副流感嗜血桿菌8.81%、Strep?tococcus 071 7.66%、黏液奈瑟菌（Neisseria mucosa）3.47%、天空羅氏菌（Rothiaaeria）3.19%。

治療后6 個(gè)月，排序前5 依次為具核梭桿菌18.75%、內(nèi)氏放線菌6.22%、黏液奈瑟菌6.15%、Streptococcus 071 5.18%和淺黃奈瑟菌（Neisseria sub?flava）4.78%。

在平均相對豐度排名前25 的菌種中，牙齦卟啉單胞菌、牙髓卟啉單胞菌、齒垢密螺旋體、齦溝產(chǎn)線菌在治療后3 個(gè)月和6 個(gè)月時(shí)樣本中的相對豐度均顯著降低，福賽坦氏菌和中間鏈球菌（Strep?tococcus intermedius）僅在治療后3 個(gè)月時(shí)顯著降低（P<0.05）；口金氏菌（Kingella oralis）在治療后3 個(gè)月時(shí)在樣本中的相對豐度均顯著升高，牙齦二氧化碳噬纖維菌（Capnocytophaga gingivalis）在治療后6 個(gè)月時(shí)相對豐度顯著升高，Ottowia 894 在治療后3 個(gè)月時(shí)較基線水平顯著升高，但在治療后6 個(gè)月時(shí)較基線顯著降低（P<0.05）。

治療前后樣本中相對豐度發(fā)生顯著性變化（P<0.05）的菌種如圖4b、4c 所示，治療后3 個(gè)月共有23 個(gè)菌種的相對豐度顯著降低，18 個(gè)菌種的相對豐度顯著升高；治療后6 個(gè)月共有11 個(gè)菌種的相對豐度顯著降低，11 個(gè)菌種的相對豐度顯著升高。治療后6 個(gè)月時(shí)與3 個(gè)月時(shí)相比，上述菌種中Desulfovibrio fairfieldensis、Granulicatella elegans 和非典型韋榮菌（Veillonella atypica）的相對豐度顯著降低，而中間鏈球菌相對豐度顯著升高。

Figure 4 Mean relative abundance at the species level before and after treatment圖4 治療前后微生物群落菌種水平相對豐度圖

2.4 生物標(biāo)志物

在治療前后各水平微生物差異分析的基礎(chǔ)上，通過LEfSe 分析各組樣本間差異最明顯的微生物作為生物標(biāo)志物（圖5）。

治療前，樣本齦下菌群的生物標(biāo)志物包括齒垢密螺旋體、Treponema 258、嗜麥芽密螺旋體（Treponema maltophilum）及其所在的屬、科、目（Spi?rochaetales）、綱和門，牙齦卟啉單胞菌、牙髓卟啉單胞菌，Peptostreptococcaceae XIG?9 brachy 及其所在的屬、Peptostreptococcaceae XIG?4 369 及其所在的屬、齦溝產(chǎn)線菌及其所在的屬、以上3 個(gè)菌屬所在的Peptostreptococcaceae XI 科，微小微單胞菌（Parvimo?nas micra）及其所在的屬及其與Peptostreptococcace?ae XI 科所在的梭菌目（Clostridiales）和梭菌綱（Clos?tridia），咽支原體（Mycoplasma faucium）及屬、科、目和綱，中間鏈球菌，昭和彎曲菌（Campylobacter showae），脫硫弧菌目（Desulfovibrionales）及其所在的δ?變形菌綱（Deltaproteobacteria），Bergeyella 907。

治療后3 個(gè)月時(shí)樣本中的生物標(biāo)志物包括Leptotrichia hofstadii、Leptotrichia 219，副流感嗜血桿菌，反硝化金氏菌（Kingella denitrificans）、Granulica?tella elegans，Capnocytophaga 336 及其所在的科、目和綱，Ottowia 894 及其所在的屬，Commamonadace?ae 科。治療后6 個(gè)月時(shí)樣本中的生物標(biāo)志物包括Neisseria 020 及其所在的科和目，金氏菌屬及其與奈瑟氏菌門共同所在的β?變形菌綱（Betaproteo bacteria）；Treponema pectinovorum 雖然為生物標(biāo)志物，但在所有樣本中僅1 次檢出。

Figure 5 Microbial analysis based on LEfSe method圖5 線性判別分析效應(yīng)圖

3 討 論

牙周炎是以菌斑生物膜為始動因素，宿主免疫反應(yīng)等多因素共同作用導(dǎo)致的感染性疾病，菌群失調(diào)是其發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。在健康人群中，齦上及齦下菌斑的量相對較低，主要由共生菌構(gòu)成，其通過宿主免疫反應(yīng)可以被有效調(diào)節(jié)。當(dāng)菌斑不斷堆積，引起牙周組織的慢性炎癥，致病微生物的數(shù)量增加，宿主免疫反應(yīng)失調(diào)，并在局部因素的刺激下，形成由致病微生物主導(dǎo)的微生態(tài)，促進(jìn)牙周組織破壞。

Socransky 等［4］的 研 究 通 過DNA 分 子 雜 交 技術(shù)，將齦下菌斑中的32 個(gè)菌種劃分為5 個(gè)微生物復(fù)合體，其中紅色復(fù)合體包括牙齦卟啉單胞菌、齒垢密螺旋體和福賽坦氏菌與牙周炎緊密相關(guān)，橙色復(fù)合體包括梭桿菌屬、普雷沃氏菌屬（Prevotel?la）、微小微單胞菌（Parvimonas micra）、彎曲菌屬（Campylobacter）等與牙周炎緊密相關(guān)的核心群，紅色復(fù)合體和橙色復(fù)合體均被認(rèn)為是經(jīng)典的牙周致病菌。雖然DNA 分子雜交技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對不可培養(yǎng)菌種的檢測，但是需要提前設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，無法獲得齦下菌群微生態(tài)的全貌。隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，基于細(xì)菌16S rRNA 保守性基因片段中9 個(gè)變異區(qū)的高通量測序，以未知菌的序列與基因庫中的已知序列進(jìn)行對比，根據(jù)相似性進(jìn)行分類鑒別，可以對菌斑中的所有細(xì)菌進(jìn)行檢測，提供了齦下菌群的全面信息［10］，本研究中微生物檢測采用的便是基于16S rRNA 的Illumina MiSeq 平臺第二代測序技術(shù)。

本研究中納入廣泛型中重度慢性牙周炎患者，在治療前即基線，所有位點(diǎn)的PD 均值為5.28 mm，BI 均值為2.73，牙周炎癥程度較重；PLI 均值為0.87，多數(shù)位點(diǎn)牙面存在菌斑附著，口腔衛(wèi)生控制不佳。同時(shí)，微生物結(jié)果顯示紅色復(fù)合體和橙色復(fù)合體及其所在屬、門為菌群中的主要成分，與既往研究的結(jié)果相一致［8，11］，同時(shí)，其它牙周致病相關(guān)微生物如牙髓卟啉單胞菌、齦溝產(chǎn)線菌及其所在的產(chǎn)線菌屬、嗜沫聚集桿菌及其所在的聚集桿菌屬（Aggregatibacter）等的相對豐度均較高（位于菌屬或菌種相對豐度排名前25）［12］。

治療后3 個(gè)月，Alpha 多樣性指數(shù)分析結(jié)果顯示齦下菌群中微生物豐富度和多樣性均無明顯變化，但與治療前相比，主成分分析圖示樣本分別位于不同的象限，ANOSIM 相似性分析顯示組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在治療后3 個(gè)月時(shí)菌斑生物膜已經(jīng)發(fā)生了再植，但是其群落組成卻發(fā)生了明顯的變化，目前相關(guān)研究的觀察時(shí)間多較短，但部分長達(dá)3 個(gè)月的研究中也觀察到了相似的結(jié)果［6，13］。治療后3 個(gè)月，螺旋體門相對豐度都顯著降低，而其在菌群失調(diào)過程中發(fā)揮著重要作用［14］。在屬水平和種水平，紅色復(fù)合體所在的卟啉單胞菌屬、密螺旋體屬、坦納氏菌屬，橙色復(fù)合體所在的微單胞菌屬（Parvimonas）及屬內(nèi)多個(gè)致病相關(guān)菌種的相對豐度均顯著降低，如牙齦卟啉單胞菌的相對豐度從8.26%降至0.68%、齒垢密螺旋體的相對豐度從2.55%降至0.54%、福賽坦氏菌的相對豐度從1.83%降至0.48%、微小微單胞菌的相對豐度從0.66%降至0.12%，同時(shí)齦溝產(chǎn)線菌、Peptostreptococcaceae XIG?4 369 及其所在屬、Myco?plasma faucium 及其所在屬、Peptostreptococcaceae XIG?9 brachy、Fretibacterium 360 及其所在屬等牙周致病相關(guān)微生物也顯著降低［5，15?16］，經(jīng)LEfSe 分析這些致病相關(guān)微生物為基線樣本菌群的生物標(biāo)志物。治療后3 個(gè)月，二氧化碳噬纖維菌屬及其下菌種如Capnocytophaga 336 等、金氏菌屬及其下菌種如口金氏菌、反硝化金氏菌（Kingella denitrificans）、Granulicatella elegans、Leptotrichia hofstadii 等既往研究中［17］報(bào)道的牙周健康相關(guān)微生物相對豐度顯著升高。治療后3 個(gè)月，菌群微生態(tài)中牙周炎致病相關(guān)微生物的比例下降，占主要成分的為嗜血桿菌屬、奈瑟氏菌屬、鏈球菌屬等牙周健康相關(guān)微生物。值得注意的是，梭桿菌屬在治療前后相對豐度無明顯變化，這可能與其在菌斑生物膜中的作用密切相關(guān)，梭桿菌屬下的菌種具核梭桿菌（Fuso?bacterium nucleatum）作為共生菌，既可以與早期定植菌如鏈球菌屬等，也可以與晚期定植菌如牙齦卟啉單胞菌等共聚［18?19］，這也與既往研究結(jié)果相似［6，13］。與齦下菌群微生態(tài)的變化相一致，無論是在所有納入位點(diǎn)還是取樣位點(diǎn)，PD、BI 和PLI 等臨床指標(biāo)均得到了顯著改善。

治療后6 個(gè)月的臨床指標(biāo)，所有位點(diǎn)的PD 稍有回升，與3 個(gè)月時(shí)相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對于取樣位點(diǎn)也觀察到了一樣的趨勢，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對樣本進(jìn)行ANOSIM 相似性分析的結(jié)果顯示，治療后6 個(gè)月與基線的群落組成差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。門水平分析也未發(fā)現(xiàn)與基線的顯著性差異，屬水平分析紅色復(fù)合體所在卟啉單胞菌屬和密螺旋體屬的相對豐度與3 個(gè)月時(shí)相近，但與基線比較無顯著性差異，而坦納氏菌屬（Tannerel?la）的相對豐度稍升高，同樣與基線無顯著性差異。產(chǎn)線菌屬、支原體（Mycoplasma）和Peptostrepto?coccaceae XIG?6 等與牙周炎相關(guān)的菌屬以及與牙周健康相關(guān)的大部分菌屬仍保持與基線水平的顯著性差異［9］。種水平分析可以觀察到6 個(gè)月時(shí)，雖然牙齦卟啉單胞菌、齒垢密螺旋體、齦溝產(chǎn)線菌等菌種仍較基線顯著減低，但部分牙周致病微生物相關(guān)菌種與基線的顯著性差異消失，福賽坦氏菌的相對豐度從0.48%上升至1.21%，微小微單胞菌的相對豐度從0.11%上升至0.26%。與治療后3 個(gè)月相比，Granulicatella elegans 和非典型韋榮菌等牙周健康相關(guān)微生物的相對豐度顯著降低，而中間鏈球菌顯著升高，優(yōu)勢菌種中Streptococcus 071 的相對豐度為5.18%，這些菌種均為牙周致病相關(guān)微生物［17，20］，同時(shí)生物標(biāo)志物中牙周健康相關(guān)微生物減少。Haffajee 等［21］的研究中提到非手術(shù)治療對臨床指標(biāo)和齦下菌群微生態(tài)改善效果最顯著的時(shí)間為治療后3 個(gè)月，之后可能會因致病微生物的再次定植引起牙周炎癥的復(fù)發(fā)。需要說明的是，本研究中研究對象為廣泛型中重度慢性牙周炎患者，其牙周炎癥程度較重，單純機(jī)械治療具有局限性，尤其是對于深牙周袋內(nèi)或解剖因素復(fù)雜的位點(diǎn)，可能無法完全清除菌斑牙石等致病因素，同時(shí)部分牙周致病菌可以進(jìn)入牙周組織內(nèi)，這些均可能導(dǎo)致治療后的致病微生物的再植［22?23］，在本研究中也可以看到治療后3 個(gè)月和6 個(gè)月Saccharibacteria TM7 的相對豐度較高，SaccharibacteriaTM7 G?5 及其下Saccharibacteria TM7 G?5 356 在治療后3 個(gè)月顯著升高，而其根據(jù)既往研究與牙周炎癥密切相關(guān)［15?16］。本研究在治療后6 個(gè)月時(shí)僅有6 個(gè)樣本產(chǎn)生的序列符合測序要求，雖然其檢驗(yàn)效能可能受到影響，需要增加樣本量進(jìn)一步證實(shí)，但上述結(jié)論仍提示僅單純機(jī)械治療對于慢性牙周炎臨床指標(biāo)和齦下菌群微生態(tài)維持長期穩(wěn)定可能存在局限性，而藥物治療及手術(shù)治療對于齦下菌群微生態(tài)的改善是否具有更加顯著的效果需要未來研究驗(yàn)證。