牙本質(zhì)和牙骨質(zhì)的仿生修復(fù)與再生

王玨， 王倩， 吳佳， 李凌鋒， 隋欣， 李美慧， 張驍， 高穎， 楊柳青， 劉志輝

吉林大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科，吉林 長春（130021）

牙體硬組織缺乏完善的自我修復(fù)能力［1］。在牙本質(zhì)和牙骨質(zhì)中，羥磷灰石（hydroxyapatite，HA）可存在于膠原纖維外，也可存在于纖維內(nèi)［2］。如何在膠原纖維存在的情況下，修復(fù)或再生出具有高度有序定向排列的HA 是牙本質(zhì)和牙骨質(zhì)修復(fù)和再生的難點(diǎn)。牙本質(zhì)是人類牙齒的硬組織基礎(chǔ)，約70%的牙本質(zhì)由板狀不規(guī)則HA 納米晶組成，并存在少量的Na+、Mg2+和Zn2+等無機(jī)離子，并具有一定的再生能力［3］。牙骨質(zhì)礦化度約為50%，其無機(jī)相為納米HA 顆粒，并存在Na+、Mg2+和F?等無機(jī)離子，其中F?高于其他任何礦化組織［4］。牙骨質(zhì)分為無細(xì)胞牙骨質(zhì)和細(xì)胞牙骨質(zhì)［5］。無細(xì)胞牙骨質(zhì)包含Sharpey 纖維和纖維之間平行排列于牙根表面的固有膠原纖維，其生長是Sharpey 纖維逐漸礦化的過程，具有Sharpey 纖維的無細(xì)胞牙骨質(zhì)是懸掛固定牙齒的重要功能結(jié)構(gòu)［4，6］。

1 源于纖維礦化機(jī)制的仿生礦化體系

將礦物質(zhì)重新引入膠原纖維并部分或全部恢復(fù)牙本質(zhì)和牙骨質(zhì)組織特性稱為功能性再礦化［2］。膠原蛋白（collagen，COL）的間隙區(qū)域內(nèi)存在帶正、負(fù)電荷的氨基酸簇，形成了能協(xié)調(diào)Ca2+、PO43?的三維環(huán)境以提供成核位點(diǎn)。而牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白（dental matrix protein 1，DMP1）、牙骨質(zhì)蛋白1（ce?mentum protein 1，CEMP1）等非膠原蛋白（non?col?lagenous proteins，NCPs）可自組裝并誘導(dǎo)無定型磷酸鈣（amorphous calcium phosphate，ACP）于COL 的成核位點(diǎn)定向礦化，使得HA 的C 軸與膠原纖維的C 軸一致［6?8］。

含有COL 的硬組織在脫礦時(shí)，纖維外礦物質(zhì)先被去除；再礦化時(shí)則相反，適當(dāng)條件下，ACP 先滲入纖維內(nèi)進(jìn)行礦化，達(dá)到一定程度的纖維內(nèi)礦化后，纖維間會發(fā)生纖維外礦化。如果優(yōu)先形成的是纖維外礦化，則將阻止纖維內(nèi)礦化，從而導(dǎo)致較差的機(jī)械性能［2，9］。

在體外纖維內(nèi)礦化過程中，非膠原蛋白、聚合物陽離子或陰離子在溶液中抑制磷酸鈣成核，形成并穩(wěn)定無定型磷酸鈣［10］。無定型磷酸鈣通過以下幾種機(jī)制進(jìn)入纖維內(nèi)：①毛細(xì)作用擴(kuò)散，但該假說中液態(tài)礦化前體的存在目前無法通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；②聚合物?礦物復(fù)合物與膠原蛋白特定部位的靜電作用；③Gibbs?Donnan滲透平衡機(jī)制，聚電解質(zhì)引起膠原蛋白的收縮和重新溶脹，收縮的膠原蛋白重新溶脹使無定型磷酸鈣滲透到膠原蛋白間隙區(qū)域［7，9?11］。其中，靜電作用可增強(qiáng)滲透，即二者共同為無定型磷酸鈣進(jìn)入纖維內(nèi)提供了驅(qū)動力［7，10?11］。

1.1 牙本質(zhì)

在礦化溶液中添加帶電荷的聚合物已廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)纖維內(nèi)礦化［12］。含有天冬氨酸（poly?as?partic acid，PASP）的聚合物誘導(dǎo)液體前體（polymer?induced liquid precursor，PILP）可滲透到由不同的酸（模擬由不同細(xì)菌產(chǎn)生）導(dǎo)致的脫礦牙本質(zhì)中，且滲透深度基本相同，即PILP 可能可使得不同細(xì)菌導(dǎo)致的脫礦牙本質(zhì)功能性再礦化［9］。由于脫礦后膠原網(wǎng)絡(luò)仍然保留，因此再礦化過程重建了管間牙本質(zhì)，又因管周牙本質(zhì)不含膠原，故而再礦化后的牙本質(zhì)小管變寬，但隨著再礦化的進(jìn)行，可能會出現(xiàn)脫礦牙本質(zhì)表面沉淀，這會堵塞裸露表面附近的小管［9］。在修復(fù)充填治療前，使用20 μL PILP 對脫礦牙本質(zhì)濕潤，溶液中的納米無定型磷酸鈣將快速滲透到脫礦牙本質(zhì)中，用改性的玻璃離子將PILP 密封在病變內(nèi)；2 周后，牙本質(zhì)機(jī)械強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，尤其是脫礦最嚴(yán)重的外層區(qū)域，其彈性模量基本恢復(fù)［2］。但單獨(dú)應(yīng)用PILP 再礦化后的牙本質(zhì)的彈性模量僅為天然牙本質(zhì)的50%左右，這可能是因?yàn)镻ILP 雖誘導(dǎo)形成了大量的纖維內(nèi)礦物質(zhì)，但缺乏足夠的纖維外礦物。為增加纖維外礦物質(zhì)的形成，可以向體系中加入F?，F(xiàn)?可加速Ca2+沉積并促進(jìn)前體相轉(zhuǎn)化為晶體相［10，12］。含氟HA較HA 尺寸更大，故而在PILP 中添加F?可能可使前體相不易進(jìn)入膠原蛋白，從而增加了纖維外礦物質(zhì)的量［10］。將摻入F?的PILP 應(yīng)用于牙本質(zhì)再礦化時(shí)，再礦化效果與F?的濃度正相關(guān)，但在摻氟PILP中存在F?的濃度閾值，低于該閾值，增加氟含量可促進(jìn)纖維內(nèi)、外礦化；超過該閾值，可能使得溶液中沒有足夠的聚合物來穩(wěn)定ACP，使其沒有足夠的時(shí)間進(jìn)入纖維內(nèi)，僅產(chǎn)生纖維外礦化［10，12］；未來可以通過仿照牙本質(zhì)中無機(jī)成分改進(jìn)PILP 中的無機(jī)成分來改善PILP 的仿生礦化后牙本質(zhì)的理化特性。

1.2 牙骨質(zhì)

牙骨質(zhì)具有由與根表面平行的多層幾微米厚的薄片組成的獨(dú)特交替層狀結(jié)構(gòu)，含氟礦化膠原纖維在單層薄片中高度對齊，而薄片之間具有一定的角度。因此，構(gòu)建仿生牙骨質(zhì)的關(guān)鍵在于模仿交替層狀結(jié)構(gòu)的膠原纖維排列；Yang 等［12］通過生物刮除技術(shù)獲得鼠肌腱脫細(xì)胞的膠原蛋白薄片，將其按照一定的角度堆疊以構(gòu)建牙骨質(zhì)樣交替層狀結(jié)構(gòu)，并將其浸泡于由殼聚糖穩(wěn)定的含氟的無定型磷酸鈣溶液中以構(gòu)建仿生牙骨質(zhì)支架。當(dāng)F?濃度為2.5 mM 時(shí)，其形態(tài)與人牙骨質(zhì)高度相似。該仿生材料可促進(jìn)成牙骨質(zhì)細(xì)胞的分化、生長和黏附。但如何將其粘附到暴露的牙本質(zhì)上仍待解決。為進(jìn)一步模擬成牙骨質(zhì)細(xì)胞的微環(huán)境，Yoo 等［13］向膠原蛋白支架中加入重組的人CEMP1，發(fā)現(xiàn)能促進(jìn)細(xì)胞附著、分化，并能影響HA 的形態(tài)。Chen 等［1］用聚乙二醇［poly（ethylene glycol），PEG］穩(wěn)定的無定型磷酸鈣納米粒子裝載rhCEMP1進(jìn)行控釋，將其與由聚（ε?己內(nèi)酯）［poly（ε?capro?lactone），PCL］、COL?1 一起經(jīng)靜電紡絲技術(shù)形成rhCEMP1/ACP/PCL/COL 多相支架。無定型磷酸鈣既保護(hù)了半衰期短的CEMP1，又參與了生物礦化的過程，該支架能抑制牙周膜干細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化，并在骨缺損處形成了牙骨質(zhì)樣組織。

2 以HA 為主要成分的仿生礦化體系

2.1 牙本質(zhì)

HA 可以促進(jìn)成牙本質(zhì)分化，納米HA 可阻塞原本開放的牙本質(zhì)小管，并促進(jìn)脫礦的牙本質(zhì)再礦化［14］。Zhang 等［15］將載有牙髓干細(xì)胞的HA/絲素蛋白支架與牙齒碎片一起植入裸鼠的皮下，發(fā)現(xiàn)該支架可促進(jìn)牙髓干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化，并形成非典型的管狀牙本質(zhì)，但不具有特殊結(jié)構(gòu)或性質(zhì)的HA 本身難以修復(fù)或再生出牙本質(zhì)小管樣結(jié)構(gòu)。Panseri 等［16］以摻鎂的HA 和明膠通過冷凍干燥與藻酸鹽交聯(lián)獲得的具有類似牙本質(zhì)小管結(jié)構(gòu)的定向微管3D 支架，有助于細(xì)胞黏附、定植，摻入Mg2+更好地模仿了天然牙本質(zhì)組織的化學(xué)組成，且Mg2+會阻礙HA 的過度結(jié)晶，而明膠則能穩(wěn)定Ca2+并引發(fā)HA 成核。

脫礦牙本質(zhì)（demineralized dentin matrix，DDM）因其可緩慢釋放膠原蛋白和多種非膠原蛋白的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)被應(yīng)用于仿生礦化。DDM 含有HA，并保留了牙本質(zhì)小管樣結(jié)構(gòu)和功能，其管間和管周牙本質(zhì)的纖維變得疏松，黏附于其上的各種生物因子可通過該通道持續(xù)釋放［17］。體外實(shí)驗(yàn)證明，DDM可增加牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSCs）的黏附、遷移和誘導(dǎo)分化的能力［17?18］。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，載有DPSCs 的DDM 中形成了典型的牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)，且能在其中檢測到成牙本質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物的mRNA 表達(dá)［17］。

2.2 牙骨質(zhì)

用靜電紡絲技術(shù)將HA 與醋酸纖維素物理結(jié)合獲得薄層牙骨質(zhì)樣支架，其磷灰石相結(jié)晶度約為50%，并具有無序結(jié)構(gòu)和低孔隙度［5］。另外在固化后的樹脂表面形成具有板狀結(jié)構(gòu)的HA 涂層有可能在恰當(dāng)?shù)囊Ш县?fù)載下通過牙周膜樣組織的再生促進(jìn)牙周組織重建，并且未來可以考慮通過在涂層中加入鋅等元素來改善其生物學(xué)特性［19］。具有微米和納米級別的棒狀雜化表面結(jié)構(gòu)的HA（mi?cro?nano?hybrid structured hydroxyapatite，mnHA）較表面平坦內(nèi)部致密的HA 相比，更能促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞細(xì)胞黏附、增殖甚至通過Wnt 信號通路促進(jìn)成骨/成牙骨質(zhì)相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，因此具有這樣雜化表面結(jié)構(gòu)的HA 可以作為牙骨質(zhì)再生的支架材料［20］。此外，有學(xué)者將無定型磷酸鈣與結(jié)晶磷酸鈣交替組裝，并在最外層包裹BMP?2，用于牙周缺損模型中，發(fā)現(xiàn)再生出較其他實(shí)驗(yàn)組更多的牙骨質(zhì)，在合成HA 中加入生物活性因子可進(jìn)一步提高HA 的再生潛能［21］。但上述方法均未形成含有膠原纖維的結(jié)構(gòu)，故而難以實(shí)現(xiàn)牙骨質(zhì)的功能。

煅燒牛骨羥基磷灰石（bovine hydroxyapatite，BHA）是一種天然的多孔礦物質(zhì)，其主要成分之一為HA，其可被宿主組織部分代替［22］。將BHA 單獨(dú)植入牙周缺損模型中時(shí)會出現(xiàn)不可吸收的BHA 顆粒從而干擾牙骨質(zhì)的修復(fù)，故而向BHA 中加入軟性的聚合物（例如殼聚糖），二者可能通過靜電作用相互結(jié)合，增加材料的可吸收性，同時(shí)聚合物也可抑制成核、穩(wěn)定無定型磷酸鈣，從而更好地礦化。殼聚糖（chitosan，CS）/BHA 支架具有多孔結(jié)構(gòu)，將其用于牙周缺損模型中可形成細(xì)胞混合纖維的牙骨質(zhì)［23］。

目前再生牙骨質(zhì)的策略常會得到不必要的細(xì)胞化牙骨質(zhì)，并且新形成的牙骨質(zhì)中缺乏有序排列的膠原纖維，即無法獲得功能性的再生牙骨質(zhì)［5］。另外，牙骨質(zhì)再生與牙周膜、牙槽骨的再生密不可分，因此在探索牙骨質(zhì)再生時(shí)應(yīng)同時(shí)關(guān)注牙周膜和牙槽骨生理形成和再生［5，21?22］。迄今為止，牙骨質(zhì)再生的方法研究仍處于起步階段。

3 天然材料和合成材料的應(yīng)用前景

雖然聚合物誘導(dǎo)液體前體（PILP）已能較好形成纖維內(nèi)礦化，但其不具有天然牙本質(zhì)、牙骨質(zhì)中膠原指導(dǎo)離子成核、調(diào)節(jié)晶體大小及性狀、促進(jìn)定向排列的立體化學(xué)特征以及缺乏膠原結(jié)合大分子和膠原間的交聯(lián)，膠原交聯(lián)后膠原分子間的間距增加，可使無定型磷酸鈣更易擴(kuò)散進(jìn)入膠原，從而促進(jìn)纖維內(nèi)礦化［7］。且合成體系中缺乏了天然體系中與膠原蛋白起協(xié)同作用的非膠原蛋白，以及非膠原蛋白對細(xì)胞的生物活性。

就對細(xì)胞行為和功能的影響而言，天然生物材料較合成支架更適合體內(nèi)的牙本質(zhì)形成［17］。但DDM 仍存在一些問題。①鹽酸、乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）酸蝕、超聲處理酸蝕是常見的DDM 處理方式，但不同的處理方式可能會影響DDM 的性能；例如有學(xué)者認(rèn)為10%EDTA 可通過釋放牙本質(zhì)基質(zhì)生物活性成分來影響與牙本質(zhì)修復(fù)和再生有關(guān)的細(xì)胞事件［18］；又如經(jīng)乳酸和乙酸酸蝕后的牙本質(zhì)的彈性模量和硬度也不同［9］，故而，未來需確認(rèn)最佳的DDM 處理方式。②隨著酸蝕時(shí)間的延長，脫礦牙本質(zhì)顯示出不斷降低的硬度和密度，過長時(shí)間的脫礦將導(dǎo)致纖維內(nèi)脫礦從而可能導(dǎo)致無效的支架［18］，因此需尋找最佳的脫礦時(shí)間，有研究顯示用鹽酸酸蝕6 h后的牙本質(zhì)為適合用于硬組織再生的半剛性生物材料［24］。③DDM 中膠原蛋白和非膠原蛋白在酸蝕過程中降解，所產(chǎn)生的裂解物可被其內(nèi)源性基質(zhì)金屬蛋白酶降解，從而降低了DDM 促進(jìn)礦化的能力和生物活性［9］。有研究發(fā)現(xiàn)，髓腔周圍的繼發(fā)牙本質(zhì)和管間牙本質(zhì)富含Zn2+，且Zn2+可抑制牙本質(zhì)基質(zhì)中的基質(zhì)金屬蛋白酶和組織蛋白酶的活性［4，25］。因此，未來可探索如何使用Zn2+穩(wěn)定DDM中的生物因子。

BHA 是牛股骨經(jīng)過燒結(jié)后形成的以HA 為主要成分的礦物支架［22，26］，將BHA 應(yīng)用于牙體硬組織再生時(shí)仍存在一些問題。①BHA 與人類牙體硬組織之間存在化學(xué)成分及HA 晶體大小上的差異，并且異種移植物具有疾病傳播和免疫排斥的潛在風(fēng)險(xiǎn)［27?28］。②不同的燒結(jié)溫度和時(shí)間將影響B(tài)HA的理化性質(zhì)：隨著溫度升高，HA 的密度和硬度增加；低溫（130 ℃）比高溫（1 200 ℃）燒結(jié)的HA 具有更大的表面積和更小的晶體尺寸，這可能對再吸收率有重要影響［29］。即BHA 適宜的燒結(jié)溫度和時(shí)間還應(yīng)進(jìn)一步探索。

與BHA 相比，合成HA 因其低免疫原性不會導(dǎo)致免疫排斥，且價(jià)格便宜，并且可通過定制形狀、改變細(xì)胞分化特性和改善機(jī)械化學(xué)特性，尤其是強(qiáng)度、孔的特性和降解率，使之適合預(yù)期應(yīng)用［20］。且納米HA 可發(fā)揮以下作用：①納米粒徑的HA 可阻塞開放的牙本質(zhì)小管［30］；②可直接在硬組織表面釋放Ca2+和PO43+使其達(dá)到局部飽和狀態(tài)從而再礦化［30?31］；③使得細(xì)胞的接觸面積隨之增大，使細(xì)胞的偽足延伸鋪展從而增強(qiáng)了細(xì)胞功能［20］；④可能通過激活生長因子促進(jìn)其增殖［32］。但合成HA中缺乏牙體硬組織的生長代謝中至關(guān)重要的微量素。其中Mg2+可能會抑制HA 晶體的生長，形成納米級HA 晶體［16］；Zn2+的含量也與硬度高度相關(guān)［4］，F(xiàn)?增加牙齒的耐酸性［10］。此外單純使用合成HA 作為再生硬組織的支架時(shí)僅為細(xì)胞生長提供了結(jié)構(gòu)支持［22］。盡管將其與聚合物復(fù)合可提高HA 的再生潛能，但仍不如天然材料，這主要是由于合成HA 與聚合物組分之間缺乏天然硬組織中HA 與膠原蛋白之間的特殊空間位置關(guān)系、天然材料中可能含有的生物因子對細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)、以及天然材料的細(xì)胞黏附位點(diǎn)［16，33?34］。故而，未來應(yīng)在合成HA 與聚合物的相互作用、在合成HA 中增加生物因子、通過化學(xué)修飾來提高細(xì)胞黏附力等方面來拓寬合成HA 的應(yīng)用前景。

4 小 結(jié)

目前牙本質(zhì)和牙骨質(zhì)的仿生礦化主要從模仿其生物形成過程和其生理結(jié)構(gòu)兩個(gè)方面來進(jìn)行，天然材料和合成材料具有各自獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。因此，未來應(yīng)通過將天然材料與合成材料相結(jié)合，應(yīng)用再礦化溶液?HA 釋放磷酸鈣離子來模仿生物礦化前沿等生物仿生的方式來促進(jìn)牙本質(zhì)和牙骨質(zhì)的修復(fù)與再生。