華南虎母乳成分分析及虎代乳粉的研制

許衛(wèi)華 林開雄 林煒明* 陳騰騰 劉 丹 傅文源,4*

(1.龍巖學院生命科學學院，龍巖364000；2.福建梅花山華南虎繁育研究所，上杭364201；3.黑龍江東北虎林園，哈爾濱150027；4.龍巖市地質(zhì)公園保護發(fā)展中心，龍巖364000 )

我國是全球虎的發(fā)源地，也是世界虎亞種分布最多的國家[1]。作為全球生物多樣性保護的旗艦物種，虎種群的有效保護和可持續(xù)生存對中國乃至全球生態(tài)安全具有深遠意義，是實現(xiàn)“生態(tài)文明建設”的重要組成部分。

我國現(xiàn)有4個虎亞種(印支虎、孟加拉虎、華南虎和東北虎)，其中，華南虎是我國特有的虎亞種，亦稱中國虎，被認為是所有虎的祖先，也是最為瀕危的虎亞種。目前存在于中國動物園中的人工種群是拯救華南虎的唯一基礎。由于近交衰退、雌虎母性不強、帶仔能力差甚至產(chǎn)后或哺乳期遺棄幼崽等原因，幼虎死亡率普遍較高，其中華南虎幼虎在3個月內(nèi)死亡率高達46%[2]，因此，人工育幼是包括華南虎在內(nèi)的所有虎亞種保存的重要手段之一。

對幼虎進行人工哺育是提高種群繁殖率、擴大種群數(shù)量的重要手段。國內(nèi)外眾多虎飼養(yǎng)單位經(jīng)過多年摸索，已經(jīng)建立了人工育幼的基本方法，然而沒有虎專用的代乳粉，大多是用犬貓寵物配方奶粉或嬰兒奶粉[3-5]，究其原因是缺乏對虎母乳營養(yǎng)成分的了解。為此，本研究收集了產(chǎn)后6～10 d華南虎母乳，對乳中氨基酸、脂肪酸、乳糖、常量礦物元素和微量礦物元素等營養(yǎng)成分含量進行了詳細的檢測和分析，并根據(jù)結(jié)果開發(fā)了虎專用代乳粉，在18只東北虎幼虎和1只華南虎幼虎人工育幼工作中取得了成功，為我國虎人工育幼和虎種群的有效保護提供了理論和實踐參考。

1 材料與方法

1.1 母虎乳樣的采集與測定

母虎乳樣采集對象：3只飼養(yǎng)于福建梅花山華南虎繁育研究所(福建省龍巖市上杭縣)的健康成年華南虎母虎，母虎胎次分別為第3胎、第4胎和第5胎，分別于產(chǎn)后第6、7和9天麻醉擠奶。

母虎的麻醉及乳樣采集：首先麻醉保定，按照每100千克體重300 mg鹽酸賽拉嗪(100 mg/mL)和200 mg鹽酸氯胺酮劑量配制麻醉藥液，吹管肌肉注射。保定好后，剃除乳房周邊的被毛，清潔乳房，用熱毛巾按摩乳房2～3 min，徒手擠壓乳房，若擠不出乳，再次用熱毛巾按摩乳房直至擠奶成功。擠完乳后，按照每100 kg體重120 mg鹽酸苯噁唑(30 mg/mL)劑量肌肉注射以加速蘇醒。每只母虎收集30～40 mL母乳，收集在50 mL DNase/RNase-Free離心管。采集到的母乳先4 ℃降溫30 min，再于-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆?，冷凍儲存條件下1 d之內(nèi)送至通標標準技術(shù)服務有限公司廈門分公司進行測定。

測定指標及方法：測定乳中氨基酸、脂肪酸、乳糖、常量和微量礦物質(zhì)元素等營養(yǎng)成分含量，其中氨基酸(除色氨酸外)含量采用GB 5009.124—2016方法檢測，色氨酸含量采用堿水解的方法，用氨基酸分析儀(日立L-8900全自動氨基酸分析儀)檢測；脂肪酸含量采用AOAC(2008)996.06方法檢測；乳糖含量采用GB 5009.8—2016方法檢測；鈣、磷、鈉、鎂、鉀、鐵、鋅和錳含量采用GB 5009.268—2016方法檢測，鉻、鈷、銅、硒、鉬含量采用GB 5009.268—2016方法檢測。

1.2 幼虎人工代乳粉的配制

虎代乳粉是按照人工采集母虎乳營養(yǎng)成分測定結(jié)果(尤其是氨基酸)研制而成的。因采集的虎母乳含量有限，只能優(yōu)先檢測氨基酸、脂肪酸、乳糖、礦物元素等含量，本研究未能檢測虎母乳中維生素含量，代乳粉中(風干基礎)維生素含量是根據(jù)NRC(2006)[6]中貓推薦飼糧中(風干基礎)相應值乘以1.5倍的安全系數(shù)進行配制?；⒋榉劢M成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 幼虎的人工育幼試驗

1.3.1 幼虎來源

福建梅花山華南虎繁育研究所(福建省龍巖市上杭縣)華南虎幼虎1只；東北虎林園(黑龍江省哈爾濱市)東北虎幼虎18只；19只幼虎從第1天開始完全采用人工配制的代乳粉進行飼喂直至斷奶。

表1 虎代乳粉組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1.3.2 代乳粉的飼喂方案

根據(jù)虎人工育幼飼養(yǎng)管理要求，奶水溫度控制在38 ℃左右(奶水滴至手腕有輕微熱感即可)，喂奶前后用溫濕毛巾模仿母虎對幼虎進行護理，梳理幼虎皮毛。30日齡前每天給幼虎刺激排便1～2次，30日齡后，一般不主動刺激排便，如連續(xù)2～4 d不排便，需進行輔助刺激排便，逐步讓幼虎自主排便。代乳粉飼喂方法見表2。

表2 虎代乳粉飼喂方法

1.3.3 仔虎處置

仔虎取出后應進行如下處理：1)檢查體表，處理傷口，判定雌雄；2)恢復體溫，干毛巾擦拭或吹風機吹干被毛后放置育嬰箱；3)處理臍帶，檢查臍帶是否感染，將臍帶扎好并用碘酒進行消毒；4)聽診心肺、稱量體重、測體溫。

1.3.4 人工育幼環(huán)境設置

27日齡以內(nèi)，冬季環(huán)境下，幼虎使用育嬰箱來維持恒定育幼環(huán)境，1日齡時溫度為30 ℃，之后每天下降0.2 ℃，最后保持在25 ℃；夏季根據(jù)實際適當縮短使用育嬰箱的天數(shù)，同時，起始溫度降至28 ℃。28～34日齡，白天將虎轉(zhuǎn)移至育嬰室木板隔欄活動，夜間在育嬰箱內(nèi)，木板隔欄長2 100 mm×寬900 mm×高1 100 mm，活動面積約為1.89 m2，并用木板拼接作隔板；隔欄底面距地面300 mm，用角鋼和鋼網(wǎng)做支撐，上面用木板拼接鋪設，這樣便于清掃，同時可從底部對隔欄進行環(huán)境加溫取暖；育嬰室上方為敞開式，可與外室形成空氣對流，保持育嬰室內(nèi)通風換氣。35～60日齡，完全在育幼室隔欄活動，在溫度較低時利用暖風機進行環(huán)境溫度輔助，維持在25 ℃左右。在氣溫允許條件下，60日齡后，根據(jù)實際情況適時將幼虎移出育嬰室，轉(zhuǎn)為虎舍籠養(yǎng)環(huán)境。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)基本處理用Excel 2010進行，采用卡方檢驗(χ2test)檢測不同組間計數(shù)型數(shù)據(jù)(百分比)的顯著性，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 華南虎母乳成分檢測結(jié)果

對產(chǎn)后第6、7和9天的3只華南虎進行麻醉擠奶,分別對3份虎母乳樣品中氨基酸、脂肪酸、乳糖、常量礦物元素和微量礦物元素含量和組成進行了檢測，結(jié)果見表3至表6。

由表3、表4和表6可以看出，華南虎母乳中總氨基酸、總脂肪酸、乳糖含量分別為(10.85±0.80)%、(8.94±1.14)%和(2.70±0.14)%，以絕干基礎計算，總氨基酸和總脂肪酸含量之和為85.86%，為母乳中最主要的兩大營養(yǎng)物質(zhì)，乳糖為母乳中第三大營養(yǎng)物質(zhì)，含量為11.71%。

由表3可以看出，母乳中油酸、亞油酸和棕櫚酸含量分別為41.13%、21.03%和20.88%，為含量最高的3類脂肪酸；飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸含量分別為26.137%、48.434%和25.168%；多不飽和脂肪酸中，亞油酸和亞麻酸含量分別為21.029%和1.230%，為最主要的ω-6多不飽和脂肪酸和ω-3多不飽和脂肪酸脂肪酸，ω-6脂肪酸多不飽和/ω-3多不飽和脂肪酸為15.36∶1.00。

由表5可以看出，新鮮母乳中鈣、磷、鈉和鉀含量分別為0.156%、0.179%、0.117%和0.088%，為含量最高的4個礦物質(zhì)元素，鈣/磷為1.00∶1.15。

表3 華南虎新鮮母乳中氨基酸組成

表4 華南虎新鮮母乳中脂肪酸組成

續(xù)表4項目Items 脂肪酸含量Fatty acid content占總脂肪酸比例Proportion of total fatty acids二十二碳六烯酸 C22∶6 cis-4,7,10,13,16,19 0.010±0.0000.112總脂肪酸 Total fatty acids8.940±1.144 飽和脂肪酸 SFAs2.337±0.22026.137單不飽和脂肪酸 MUFAs4.330±0.57548.434多不飽和脂肪酸 PUFAs2.250±0.33825.168ω-6多不飽和脂肪酸 ω-6PUFAs2.113±0.32623.639ω-3多不飽和脂肪酸 ω-3PUFAs0.137±0.0211.529ω-6多不飽和脂肪酸/ω-3多不飽和脂肪酸 ω-6PUFA/ω-3PUFA15.46∶1.00

表5 華南虎新鮮母乳中常量和微量礦物元素組成

表6 華南虎母乳營養(yǎng)成分分析

2.2 幼虎代乳粉的配制

首先確定幼齡虎代乳粉應以乳蛋白為主，乳蛋白原料包括：牛全乳粉(全乳蛋白)、牛乳清濃縮蛋白(乳清蛋白)和牛乳酪蛋白3種最主要的乳蛋白來源。將虎全乳蛋白(3份母乳平均值)和上述3個乳蛋白以及大豆蛋白的氨基酸進行比對，乳蛋白原料和大豆蛋白氨基酸數(shù)據(jù)摘自NRC(2012)[7]動物營養(yǎng)數(shù)據(jù)庫。

A：虎母乳、3種牛乳蛋白原料和大豆蛋白氨基酸譜對比；B：不添加任何晶體氨基酸條件下，代乳粉和虎母乳氨基酸譜比對；C：補充4種缺乏氨基酸后，代乳粉和虎母乳氨基酸譜比對。

從圖1可以看出，在乳蛋白為主的代乳粉中(分離大豆蛋白添加量限量為3%，表1)，蛋氨酸、精氨酸、亮氨酸和組氨酸4種氨基酸構(gòu)成代乳粉的限制性氨基酸(圖1-A、圖1-B)，必須通過晶體氨基酸額外補平(圖1-B、圖1-C)。

2.3 幼虎代乳粉的飼喂效果

對18只新生東北虎幼虎和1只華南虎幼虎進行了全代乳粉人工育幼試驗跟蹤，幼虎基本信息、生長發(fā)育、采食情況和消化吸收情況等結(jié)果見表7、表8和圖2、圖3。

表7 虎代乳粉飼喂效果

續(xù)表7編號No.1)性別Sex初重 Birth weight/kg末重 Final weight/kg飼喂日齡Feeding days of age增重 Weight gain/kg平均日增重Average daily gain/(g/d)代乳粉采食量 Intake of milk replacer/kg2)增重效率Gain efficiency3)增重回歸曲線Regression curve of weight gain1718-1母♀1.404.081～312.6886.451.8780.701y=0.082 4x+1.40 (R2=0.966)M36-14)公1.303.001～281.7060.711.6700.982y=0.061 2x+1.30 (R2=0.98)平均值±標準差Mean±SD5)80.89±10.110.59±0.09

圖2 19只幼虎(來源于10只母虎)在完全代乳粉飼喂下體重變化曲線

如表7和圖2可知，18只東北虎幼虎和1只華南虎在純代乳粉喂養(yǎng)的前1個月內(nèi)，呈現(xiàn)線性生長趨勢(R2=0.96)，除了編號為1614-1和1614-2的2只幼虎初生重偏小(1 kg初生重)、生長緩慢以外，其他17只幼虎生長狀況良好，該17只幼虎平均日增重為(80.89±10.11) g/d；增重效率為0.59±0.09，接近每攝食1單位代乳粉獲得2單位的體增重。如圖3可知，初生第1天，幼虎代乳粉體重采食比例為(1.35±0.42)%，變異系數(shù)為31.11%，這反映了不同個體采食能力存在較大的差別。第2～15天體重采食比例在2%以上[(2.24±0.19)%]，變異系數(shù)為8.65%，幼虎采食能力明顯提高。第16～31天穩(wěn)定在(1.80±0.06)%，變異系數(shù)為3.53%。由表8可知，對代乳粉飼喂條件下幼虎糞便形狀進行了監(jiān)測，幼虎糞便形態(tài)以糊狀(54.55%)和條狀(41.23%)為主，糊狀和糊條狀均為正常的幼虎糞便，腹瀉情況較少出現(xiàn)(1.48%)。

圖3 19只幼虎在完全代乳粉飼喂下代乳粉采食量/體重的變化曲線

表8 代乳粉飼喂條件下幼虎糞便形狀分析

3 討 論

本研究對6～10日齡華南虎母乳中氨基酸、脂肪酸、乳糖、常量礦物元素和微量礦物元素等營養(yǎng)物質(zhì)進行了較為全面的成分檢測和分析，提出了蛋氨酸、精氨酸、亮氨酸和組氨酸為“乳蛋白-乳糖”幼虎代乳粉的4種限制性氨基酸，發(fā)現(xiàn)母乳具有低乳糖、高蛋白質(zhì)、高脂肪、脂肪酸結(jié)構(gòu)接近1∶2∶1(飽和脂肪酸：單不飽和脂肪酸：多不飽和脂肪酸)、鈣磷比例接近1∶1(實際檢測結(jié)果為1.00∶1.15，表5)等組成特點，這些發(fā)現(xiàn)為幼虎代乳粉的科學開發(fā)提供了重要的理論參考。受限于一次麻醉取樣有限(通常低于50 mL)以及研究中測定的項目較多，本研究中磷元素含量來自1只母虎的母乳樣本，其他礦物元素含量均來自2只母虎的母乳樣本，礦物元素中鈣、鉀、銅、鋅等礦物元素含量穩(wěn)定(CV值小于5%)，然而，鎂、鐵等礦物元素含量差異相對較大(CV值大于10%)，提示需要進一步跟蹤虎乳中這些元素含量的變化。值得注意的是，賴氨酸通常是畜禽(如豬)飼糧中第一或第二限制性氨基酸，而本研究發(fā)現(xiàn)賴氨酸在虎母乳蛋白質(zhì)中的含量均低于3種牛乳蛋白(全乳蛋白、乳清蛋白、乳酪蛋白)和大豆蛋白(圖1-A)，因此，本研究中代乳粉并沒有額外補充晶體賴氨酸，結(jié)合該代乳粉能夠完全替代虎母乳的結(jié)果，本研究未將賴氨酸列為“乳蛋白-乳糖”型幼虎代乳粉的限制性氨基酸。

具體而言，華南虎母乳中氨基酸和脂肪酸含量非常高，二者之和為85.86%(絕干基礎計算)，與非洲獅相近(乳蛋白+乳脂肪=90.43%)[8]。華南虎母乳中乳糖含量[(2.70±0.14)%，鮮乳計]低于家貓[9]、獵豹[10]、人以及奶牛、山羊、綿羊等常見經(jīng)濟動物鮮乳中乳糖含量(≥4%)[11]，而與非洲獅鮮乳中乳糖含量相近(2.65%)[8]。此外，脂肪酸中，飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸含量分別為26.137%、48.434%和25.168%，接近1∶2∶1的脂肪酸結(jié)構(gòu)，而非洲獅母乳脂肪酸三者比例為3.2∶5.8∶1.0[8]，華南虎母乳中多不飽和脂肪酸占比高于非洲獅，然而虎乳中ω-6多不飽和脂肪酸/ω-3多不飽和脂肪酸為15.36∶1.00(表4)，過高的ω-6多不飽和脂肪酸/ω-3多不飽和脂肪酸被認為與較高的心臟病、腫瘤、感染以及自身免疫疾病等因素有關(guān)[12]。礦物質(zhì)方面，虎乳中鈣磷比例接近1∶1(實際檢測結(jié)果為1.00∶1.15)。國外有關(guān)虎乳研究方面，只有巴西波梅羅迪一家動物園有報道過1只5歲、泌乳期為第8周的孟加拉虎(Bengal tiger)虎乳成分分析，該研究僅僅對虎乳中氨基酸含量進行了檢測[13]，沒有對虎乳中其他成分進行分析，也沒有針對性開展幼虎代乳粉的研制。

根據(jù)華南虎母乳檢測結(jié)果和特點分析，課題組開發(fā)了虎專用幼虎代乳粉，分別于東北虎虎園(哈爾濱)和福建梅花山華南虎繁育所(龍巖)對18只東北虎幼虎和1只華南虎幼虎進行了飼喂跟蹤研究，從幼虎增重、采食情況、增重效率以及消化吸收情況來看，虎專用代乳粉取得了成功，但受制于目前營養(yǎng)和飼料加工技術(shù)水平，代乳粉只是嚴格按照虎母乳氨基酸成分進行配制，在總氨基酸和總脂肪酸含量方面仍然達不到虎母乳水平，后續(xù)將兼顧水溶性能、乳化性能、母乳相關(guān)指標的符合度等因素，進一步優(yōu)化虎代乳粉，并采用生理生化、腸道微生物菌群、分子生物學等指標對研制的虎代乳粉進行深入評價。

4 結(jié) 論

① 華南虎母乳具有獨特的營養(yǎng)成分構(gòu)成，具有低乳糖、高蛋白質(zhì)、高脂肪、脂肪酸結(jié)構(gòu)接近1∶2∶1(飽和脂肪酸：單不飽和脂肪酸：多不飽和脂肪酸)、鈣磷比例接近1∶1等組成特點。

② 開發(fā)的虎代乳粉可成功飼喂東北虎幼虎和華南虎幼虎。