植物天然產(chǎn)物抑制細菌脲酶活性的研究進展

張震宇 趙圣國 鄭 楠 王加啟*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京100193；2.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部奶及奶制品質(zhì)量安全控制重點實驗室，北京100193)

近年來，動物飼糧中抗生素的濫用引起的生物耐藥性問題及人工合成化合物在動物及動物產(chǎn)品中應用所引起的生物毒性與安全問題已引起人們的廣泛關注。植物提取物中獲得的天然產(chǎn)物化合物在動物生產(chǎn)中的應用越來越受重視。隨著分離提純技術的高速發(fā)展，從植物提取物中分離的天然產(chǎn)物化合物越來越多，應用潛力巨大。

在反芻動物飼糧中添加尿素等非蛋白氮可替代約30%的蛋白質(zhì)飼料，為其提供生長和生產(chǎn)所必須的氮源。按照豆粕氮含量6.7%、尿素氮含量46.7%計算，每年反芻動物生產(chǎn)中利用尿素100萬t，可替代700萬t豆粕所提供的氮源[1]。但是，瘤胃中產(chǎn)脲酶菌產(chǎn)生的脲酶催化尿素水解生成氨的速率過快，以致尿素氮不能被有效利用。因此，需應用尿素緩釋技術以提高反芻動物對非蛋白氮的利用效率[2]。

細菌脲酶(EC 3.5.1.5)由結(jié)構(gòu)蛋白UreABC構(gòu)成，而輔助蛋白UreD/UreH、UreE、UreF以及UreG等主要參與細菌脲酶結(jié)構(gòu)蛋白的組裝和活化過程。細菌脲酶活性中心通常位于結(jié)構(gòu)蛋白UreC[3-4]。脲酶抑制劑通過與細菌脲酶活性中心結(jié)合，能同時降低反芻動物內(nèi)源尿素與外源尿素的分解速度。此外，脲酶抑制劑還具有高效、易添加、易制備的特點。目前，在反芻動物生產(chǎn)中應用較廣的脲酶抑制劑為乙酰氧肟酸，但其在瘤胃內(nèi)易被微生物降解，限制了乙酰氧肟酸作為脲酶抑制劑在尿素緩釋方面的應用。特別是大劑量使用乙酰氧肟酸對動物還有著嚴重的副作用，能夠引起皮膚病、神經(jīng)及血液學方面的疾病[5]，進一步限制了乙酰氧肟酸作為脲酶抑制劑的使用。因此，亟需開發(fā)生物毒性低、穩(wěn)定性強的脲酶抑制劑，而天然產(chǎn)物化合物具有結(jié)構(gòu)多樣性大、生物毒性低以及安全性高等特點，近年來已大量應用于脲酶抑制劑的開發(fā)及研究中。從這些研究中獲得的大量具有脲酶抑制生物活性的化合物骨架結(jié)構(gòu)，對于開發(fā)新型脲酶抑制劑具有重要意義。本文分類綜述了具有脲酶抑制活性的植物天然產(chǎn)物，探討了不同類型的天然產(chǎn)物脲酶抑制劑的構(gòu)效關系與抑制模式，旨在為開發(fā)新型脲酶抑制劑提供參考。

1 近年來公開報道的植物天然產(chǎn)物化合物

近年來公開報道的對研發(fā)新型脲酶抑制劑具有參考作用的植物天然產(chǎn)物化合物見表1。表1對具有脲酶抑制作用的植物天然產(chǎn)物化合物進行了分類，并列舉了不同研究中植物天然產(chǎn)物化合物對脲酶的抑制活性——半抑制濃度(IC50)值、抑制類型、構(gòu)效關系以及植物來源。表1中構(gòu)效關系一欄中所列舉的化學結(jié)構(gòu)，為含有這些化學結(jié)構(gòu)的一類化合物中對于其脲酶抑制活性至關重要的化學結(jié)構(gòu)，通過化學修飾取代該結(jié)構(gòu)能改變此類化合物的脲酶抑制活性。

表1 植物天然產(chǎn)物中脲酶抑制劑的分類

續(xù)表1分類Classification化合物名稱Compound nameIC50值IC50value/(μmol/L)抑制類型Inhibition types構(gòu)效關系Structure-activity relationship植物來源Plant sources參考文獻References芪類化合物Stilbene compounds白藜蘆醇-非競爭性脲酶抑制劑-葡萄[15]兒茶素Catechins沒食子酸酯2.2 競爭性脲酶抑制劑B環(huán)的5'位羥基綠茶[16]兒茶素Catechins沒食子兒茶素沒食子酸酯9.8 競爭性脲酶抑制劑B環(huán)的5'位羥基綠茶[16]兒茶素Catechins沒食子兒茶素8.7 競爭性脲酶抑制劑B環(huán)的5'位羥基綠茶[16]兒茶素Catechins表沒食子兒茶素19.6 競爭性脲酶抑制劑B環(huán)的5'位羥基綠茶[16]黃酮類化合物Flavonoids槲皮素80 -3'-羥基、4'-羥基以及3',4'-二羥基番石榴[17-18]黃酮類化合物Flavonoids3'-甲基槲皮素76 --秋海棠[6]黃酮類化合物Flavonoids楊梅素77.2 --金銀花[18]黃酮類化合物Flavonoids木犀草素35.5 --金銀花[18]黃酮類化合物Flavonoids鷹嘴豆素A320 ---[19]黃酮O-糖苷類化合物Flavones O-glycosides槲皮素-4-O-0-β-D-吡喃葡萄糖苷190 -3-羥基洋蔥[17]黃酮O-糖苷類化合物Flavones O-glycosides黃酮類葡萄糖醛酸苷270 非競爭性脲酶抑制劑-黃芩[20]黃酮O-糖苷類化合物Flavones O-glycosides黃芩素1 350 非競爭性抑制劑-燈盞花[21]黃酮O-糖苷類化合物Flavones O-glycosides黃芩苷820 非競爭性抑制劑-黃芩[22]黃酮C-糖苷Flavones C-glycosides牡荊素35 -糖基非洲菊[23]黃酮C-糖苷Flavones C-glycosides葒草素28 -糖基非洲菊[23]黃酮C-糖苷Flavones C-glycosides異日本獐牙菜素38 -糖基非洲菊[23]黃酮C-糖苷Flavones C-glycosides異當藥黃素43 -糖基非洲菊[23]黃酮C-糖苷Flavones C-glycosides5,7-二羥基-40-甲氧基黃烷酮15.8 非競爭性抑制劑-三葉枳[24]單萜類化合物Terpenoids維能酮227.6 --秋海棠[25]二萜類化合物Diterpenoid compounds3,7,15-三-O-乙?；?5-O-煙酰胺基-13,14-二羥基肉豆蔻素81.9 --大戟屬[26]

續(xù)表1分類Classification化合物名稱Compound nameIC50值IC50value/(μmol/L)抑制類型Inhibition types構(gòu)效關系Structure-activity relationship植物來源Plant sources參考文獻References三萜類化合物Triterpenoids蘆丁醇24.2 --雞蛋花[27]三萜類化合物Triterpenoids紅楊酸58.9 --雞蛋花[27]三萜類化合物Triterpenoids山梨素A85.2 --花楸屬植物[28]三萜類化合物Triterpenoids山梨素B17.8 --花楸屬植物[28]三萜類化合物Triterpenoids人參皂甙A500(抑制87%)-硫酸酯駝蹄瓣[29]生物堿類化合物Alkaloids3-羥乙基葡萄球菌素25.6 -羥基/羰基板藍根[30]生物堿類化合物Alkaloids表紅葡萄球菌素37.0 -羥基/羰基板藍根[30]生物堿類化合物Alkaloids小檗堿7.135×103 --黃連[31]生物堿類化合物Alkaloids表小檗堿3.00±0.01 反競爭性抑制劑-黃連[32]醌類Quinones2-(β-D-二吡喃葡萄糖氧基)-1,4-萘醌62 散沫花[33]醌類Quinones3-甲氧基黃檀酮169 競爭性抑制劑-紫羅蘭[34]鞘脂類化合物Sphingolipids紅藻糖苷45.7 --紅楊[27]鞘脂類化合物Sphingolipids鄰苯二甲酰胺A23.1 -糖基(葡萄糖)結(jié)構(gòu)蛇床子[35]鞘脂類化合物Sphingolipids鄰苯二甲酰胺12.6 -糖基(葡萄糖)結(jié)構(gòu)蛇床子[35]含硫化合物Sulfur compounds伊貝林178.8 --西蘭花[36]含硫化合物Sulfur compounds蘿卜硫素190.5 --西蘭花[36]含硫化合物Sulfur compounds大蒜素21.8 --大蒜[37]

2 酚類化合物

酚類化合物是植物的莽草酸、戊糖磷酸和苯丙醇代謝通路中重要的代謝產(chǎn)物，其化學結(jié)構(gòu)中苯環(huán)上的氫原子被羥基取代，為芳烴的含羥基衍生物，具有廣泛的生理活性，是脲酶抑制劑的重要來源之一。Ahmad等[6]從草藥植物秋海棠(Vernoniacinerascens)中分離出2-羥基-3-甲氧基-5-(2-丙烯基)-苯酚，該化合物對刀豆脲酶的IC50值為64.8 μmol/L。Ramsay等[7]報道了從尖喙豆(Stereospermumacuminatissimum)莖皮中分離得到丁香醛。該化合物對脲酶抑制IC50值為(432.20±2.67) μmol/L。丁香醛類化合物已廣泛應用于腸道損傷防護藥物的開發(fā)，且其同時具備微摩爾級的脲酶抑制作用，具有一定的作為脲酶抑制劑的開發(fā)潛力。

Tariq等[8]從乃拉木藍(Indigoferagerardiana)中分離得到了間苯三酚類化合物靛藍素C及其他2個衍生化合物，分別為靛藍素A、靛藍素B。靛藍素B和靛藍素C均具有較好的刀豆脲酶抑制活性，IC50值分別為23.3和49.7 μmol/L，均為競爭性脲酶抑制劑。而靛藍素A雖然與其他2個化合物結(jié)構(gòu)相似，但卻不具備脲酶抑制活性。構(gòu)效關系(SAR)研究表明，脂鏈烴對該類化合物的脲酶抑制活性起關鍵作用。靛藍素A與靛藍素C相比，其化學結(jié)構(gòu)中的脂鏈烴多了1個碳原子，導致其不具備脲酶抑制活性。

Khan等[9]從匍枝毛茛(Ranunculusrepens)根的氯仿和乙酰乙酸提取物中純化分離了3,4,5-三羥基苯甲酸甲酯及黃檀酚。二者均具有很強的刀豆脲酶和巴氏桿菌脲酶抑制活性，其中黃檀酚對于這2種脲酶的IC50值分別為35.01和25.63 μmol/L，而3,4,5-三羥基苯甲酸甲酯對這2種脲酶的IC50值分別為31.75和22.51 μmol/L(參比脲酶抑制劑硫脲對這2種脲酶的抑制IC50值分別為15.06和21.00 μmol/L)，2種化合物為競爭性脲酶抑制劑。SAR研究表明，羥基能與脲酶活性位點中的鎳結(jié)合而抑制脲酶活性，黃檀酚化學結(jié)構(gòu)中羥基的數(shù)量只有1個，3,4,5-三羥基苯甲酸甲酯化學結(jié)構(gòu)中含有3個游離的羥基，而該報道中另一化學結(jié)構(gòu)相似的化合物R(+)-4-甲氧基黃檀酮因不含羥基而脲酶抑制活性最低(對刀豆脲酶和巴氏桿菌脲酶的IC50值分別為67.33和59.72 μmol/L)，3個化合物對脲酶的抑制效果與羥基的數(shù)量相關，表明羥基對該類化合物脲酶抑制活性非常重要。

2.1 酚酸類

酚酸類化合物的苯環(huán)結(jié)構(gòu)上有多個酚羥基取代，是一種芳香羧酸類化合物。酚酸類化合物很少以游離形式存在，主要在中草藥中以糖、酯及有機酸的形式存在。在抗氧化、抗菌消炎、降血脂等方面有很強的生物活性，但由于分子中存在大量的酚酸基取代，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。高溫、光照、酶、環(huán)境酸堿程度均能影響該類化合物的結(jié)構(gòu)，使其失去生物活性。今后，開發(fā)此類化合物用作脲酶抑制劑的研究重點為：在提取和純化的過程中保證化合物的活性，并在保留生物活性的基礎上改善化合物的穩(wěn)定性。

Ngan等[10]從芍藥根(P.lactifloraroot)中純化出沒食子酸甲酯(MG)和1,2,3,4,6-五-O-沒食子酰-β-二吡喃葡萄糖(PGG)，二者對幽門螺桿菌脲酶的抑制IC50值分別為1 330和72 μmol/L。而參比脲酶抑制劑乙酰氧肟酸與硫脲的IC50值分別為49與568 μmol/L。與參比抑制劑乙酰氧肟酸相比，PGG不僅脲酶抑制活性高，而且還具有抗幽門螺旋桿菌的活性，其機制為改變細菌膜通透性，從而破壞質(zhì)子動力和膜相關功能，同時促進細胞內(nèi)酸化，破壞微生物ATP合成酶。因此，在應用PGG時還應注意評估其對某些細菌的抗菌活性。Kubo等[11]從腰果(Anacardiumoccidentale)中分離出的漆樹酸。漆樹酸對幽門螺桿菌脲酶的抑制IC50值為21 μmol/L，是一種競爭性脲酶抑制劑。同時該化合物還具有抗幽門螺旋桿菌活性。SAR研究表明，該化合物的不飽和C15∶3結(jié)構(gòu)中烷基側(cè)鏈在烴側(cè)鏈中具有約30°的彎曲，通過順式構(gòu)型與分子上雙鍵相互作用，使得側(cè)鏈中順式構(gòu)型的2個雙鍵產(chǎn)生更多的彎曲，并顯著縮短了側(cè)鏈的長度。該結(jié)構(gòu)對于該類化合物的抗菌活性具有重要作用。

Arfan等[12]從粗糠柴(Mallotusphilippensis)樹皮的丙酮提取物中分離出巖白菜素(bergenin)，該化合物是一種有效的抗氧化化合物，生物毒性低且具有腸道保護作用。對巴氏桿菌脲酶的IC50值為21.7 μmol/L(硫脲IC50值=25 μmol/L)，為競爭性脲酶抑制劑。巖白菜素與巴氏桿菌脲酶活性中心的結(jié)合模式(圖1)。該化合物能夠與鎳離子及活性中心中重要的氨基酸殘基相互作用。巖白菜素與脲酶活性中心的Lys 169、Ala 266、Arg 339、Gly 280、Asp 363形成氫鍵，與His 323、Lys 169、His 249、Met 367、His 222和Ala 366形成疏水相互作用，從而抑制脲酶活性。

2.2 苯丙酸類

苯丙酸類化合物含C6-C3結(jié)構(gòu)，是一種含有酚羥基取代基的芳香羧酸。該類化合物與酚酸類化合物的化學特性類似。Ahmad等[6]從秋海棠中分離出咖啡酸和異阿魏酸，這2個化合物對刀豆脲酶IC50值分別為69.8和72.4 μmol/L。而Arfan等[13]從灌木金絲桃壁(Hypericumoblongifolium)中提取的咖啡酸衍生物對刀豆脲酶的IC50值為20.96 μmol/L，優(yōu)于參比脲酶抑制劑硫脲(IC50值=21.0 μmol/L)。

圖1 巖白菜素與巴氏桿菌脲酶的結(jié)合模式圖

2.3 芪類(stilbene)化合物

芪類化合物以均二苯乙烯為基本單位，在植物正常組織中含量低。天然芪類化合物是植物的應激產(chǎn)物。Xiao等[14]從高等植物中分離出了2,3,4,4-四羥基-二氫芪，其對幽門螺桿菌脲酶的IC50值為30 μmol/L，為競爭性、時間依賴性抑制劑。此外，SAR研究表明，化學結(jié)構(gòu)中2個鄰羥基對該化合物的脲酶抑制活性至關重要。當該化合物的異黃酮結(jié)構(gòu)的C環(huán)斷裂時，其脲酶抑制活性明顯降低。Paulo等[15]從葡萄(Vitisvinifera)中分離出白藜蘆醇，當濃度為1.75 μmol/L時，可抑制幽門螺旋桿菌脲酶90%的活性。動力學研究表明，白藜蘆醇是幽門螺桿菌脲酶的非競爭性和可逆性抑制劑。此外，白藜蘆醇還具有多種其他生理活性，如抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)脂代謝等。已廣泛應用于反芻動物瘤胃氣體減排、畜禽肉胴體脂肪品質(zhì)的提升[38]。

3 類黃酮類化合物

類黃酮化合物是以黃酮(2-苯基色原酮)為母核而衍生出的一系列天然化合物，可分成不同亞類，如黃酮、黃酮醇、兒茶素等。類黃酮類物質(zhì)具有廣泛的生物活性，是脲酶抑制劑的重要來源之一。

3.1 兒茶素

兒茶素是從茶葉等天然植物中提取出來的一類酚類活性物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗氧化、抗病菌等多種生物活性，此類活性物質(zhì)的特點是含有多羥基結(jié)構(gòu)。多羥基結(jié)構(gòu)使得兒茶素在中性和堿性條件下結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易在生物酶作用下發(fā)生甲基化或糖苷化。在兒茶素結(jié)構(gòu)中引入其他基團可有效提高其穩(wěn)定性和生物利用率，并能增強兒茶素特定的生物活性。例如，糖苷兒茶素水溶性顯著提高，?；瘍翰杷刂苄栽鰪?，其抗氧化活性亦隨之增強。因此，對于兒茶素類脲酶抑制劑的化學結(jié)構(gòu)進行修飾，有望開發(fā)出抑制效果好、穩(wěn)定性強的新型脲酶抑制劑。

Matsubara等[16]從綠茶中分離得到4個兒茶素類化合物：表沒食子兒茶素沒食子酸酯、沒食子兒茶素沒食子酸酯、沒食子兒茶素和表沒食子兒茶素。這些化合物對幽門螺桿菌脲酶抑制的IC50值分別為2.2、9.8、8.7和19.6 μmol/L，均為競爭性脲酶抑制劑。SAR研究表明，在這4個兒茶素化合物的化學結(jié)構(gòu)中，B環(huán)的5′位有羥基，與5′位沒有羥基的其他兒茶素類化合物相比，這4個化合物的脲酶的抑制作用增強了35～104倍。因此，5′位是否有羥基對于兒茶素類化合物是否具有較強的脲酶抑制作用至關重要。Macomber等[39]以產(chǎn)氣克雷伯氏菌脲酶為對象，通過基因定點突變技術，研究了表沒食子兒茶素與脲酶的結(jié)合位點。結(jié)果表明，表沒食子兒茶素通過與脲酶活性中心外柔性片狀區(qū)域的Cys319位點結(jié)合以固定脲酶構(gòu)象，阻止底物尿素進入脲酶活性中心，從而抑制脲酶的活性。

3.2 黃酮類化合物

黃酮類化合物分子中具有2-苯基色原酮(flavone)結(jié)構(gòu)，含有酮式羰基，分子第1位上的氧原子具有堿性，能與強酸成鹽。由于該類化合物羥基衍生物為黃色，故稱黃酮。Shabana等[17]從植物番石榴(Psidiumguajava)提取物中發(fā)現(xiàn)，槲皮素是一種有效的抗氧化劑黃酮醇，其對刀豆脲酶的IC50值為80 μmol/L，但對發(fā)酵乳桿菌脲酶(L.fermentum)幾乎無抑制活性。將槲皮素化合物結(jié)構(gòu)中的3′-羥基和4′-羥基糖基化，可降低該化合物對刀豆脲酶的抑制活性，從而提高該化合物對發(fā)酵乳桿菌脲酶的抑制活性。因此，糖基化位點的位置對于槲皮素及其衍生物的脲酶抑制作用十分重要。Ahmad等[6]從秋海棠提取物中純化獲得了3′-甲基槲皮素，其對刀豆脲酶的IC50值為76 μmol/L。

Xiao等[18]從金銀花(LonicerajaponicaThunb)中提取的楊梅素和木犀草素2種化合物，對幽門螺旋桿菌的IC50值分別為77.2和35.5 μmol/L。Xiao等[18]進一步研究了槲皮素的作用模式(圖2)，結(jié)果表明，槲皮素對幽門螺旋桿菌脲酶的IC50值為11.2 μmol/L，其脲酶抑制活性優(yōu)于參比脲酶抑制劑乙酰氧肟酸[IC50值=(19.4±2.0) μmol/L]。酶動力學研究表明，槲皮素是幽門螺旋桿菌脲酶的非競爭性脲酶抑制劑。SAR研究表明，3-OH、5-OH和3′，4′-二羥基對于該化合物的脲酶抑制活性非常重要，與Shabana等[17]報道結(jié)果相符。Liu等[19]報道了鷹嘴豆素A對脲酶的IC50值為320 μmol/L,該研究還通過16S rRNA基因測序揭示了該天然產(chǎn)物化合物能夠減少瘤胃細菌體外發(fā)酵體系中蛋白降解菌中普雷沃氏菌屬和鏈球菌屬的豐度并降低谷氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和總氨基酸的降解量。

圖2 槲皮素與幽門螺旋桿菌脲酶的結(jié)合模式圖

3.3 黃酮O-糖苷類化合物

黃酮類糖苷是以黃酮為基本骨架，根據(jù)糖基與糖基骨架鏈接的位置及基團，分為黃酮O-糖苷類化合物及黃酮C-糖苷，糖基部分主要包括葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖等，且部分糖基存在著乙酰化、丙二?；痊F(xiàn)象，使得該類化合物具有多種生物活性。

黃酮O-糖苷類化合物為糖取代基以氫氧化形式與黃酮碳骨架相連，形成黃酮O-糖苷。Shabana等[17]從洋蔥(Alliumcepa)中純化的槲皮素-4-O-0-β-D-吡喃葡萄糖苷，對刀豆脲酶的抑制IC50值為190 μmol/L。當該槲皮素苷中的3-羥基被蘆丁糖取代后，脲酶抑制活性降低了4倍以上，說明過高的親水性會降低該類化合物與酶的結(jié)合能。SAR研究表明，化合物骨架中含有羥基是該化合物脲酶抑制作用的關鍵結(jié)構(gòu)特征。去除槲皮素中的羥基會導致該化合物的脲酶抑制活性急劇下降。將該類化合物中的羥基甲基化，會進一步降低其脲酶抑制活性，最終導致該化合物因疏水性顯著增加而完全喪失其脲酶抑制活性[18]。Tan等[20]從干燥的黃芩(Scutellariabaicalensis)根中提純的黃芩苷，是一種黃酮類葡萄糖醛酸苷，隨后研究了其與刀豆脲酶的作用模式(圖3)，發(fā)現(xiàn)該化合物以刀豆脲酶活性中心的硫醇結(jié)構(gòu)為靶點，其IC50值為270 μmol/L，為非競爭性脲酶抑制劑。

圖3 黃芩苷與刀豆脲酶的結(jié)合模式圖

Wu等[21]從中草藥植物燈盞花(Erigeronbreviscapus)中提取了黃芩素，是一種黃酮類葡萄糖醛酸苷，對刀豆脲酶的IC50值為1 350 μmol/L，而槲皮素作為參比脲酶抑制劑，在相同體系下其對刀豆脲酶的IC50值為617 μmol/L。分子對接結(jié)果表明，黃芩素可與脲酶活性中心巰基結(jié)合而抑制該脲酶的活性。Yu等[22]驗證了黃芩苷和黃芩素對脲酶的抑制作用，發(fā)現(xiàn)這2個化合物對幽門螺旋桿菌脲酶的IC50值分別為820和470 μmol/L，而參比脲酶抑制劑乙酰氧肟酸的IC50值為140 μmol/L。黃芩苷和黃芩素均為幽門螺旋桿菌脲酶的非競爭性抑制劑。該研究同時揭示了黃芩苷和黃芩素不僅能與脲酶活性中心巰基結(jié)合，還能與Cys321位點結(jié)合，從而抑制脲酶活性。

3.4 黃酮C-糖苷

黃酮C-糖苷為糖取代基與黃酮A環(huán)上的C原子直接相連所形成的一類化合物。Perveen等[23]從非洲菊(Celtisafricana)的正丁醇可溶性部分中純化出4種C-糖基類黃酮化合物，牡荊素(vitexin)、葒草素(orientin)、異日本獐牙菜素(isoswertiajaponin)和異當藥黃素(isoswertisin)。這些化合物對刀豆脲酶的抑制IC50值分別為35、28、38和43 μmol/L，而參比脲酶抑制劑硫脲的IC50值為21.5 μmol/L。SAR研究表明，化合物中糖基部分的存在增加了這些化合物的抗脲酶活性。

3.5 黃烷酮類

Kim等[24]從三葉枳(Poncirustrifoliate)的提取物中純化得到5,7-二羥基-40-甲氧基黃烷酮，該化合物為枸橘甙(poncirin)的主要代謝產(chǎn)物，能被人的腸道微生物代謝。該化合物具很強的幽門螺旋桿菌脲酶抑制活性，IC50值為15.8 μmol/L。此外，該化合物為脲酶的非競爭性抑制劑，對幽門螺桿菌具有直接抑菌活性。

4 萜類化合物

萜類化合物是植物中的一類大而多樣的有機化合物，廣泛存在于植物的香精、樹脂、色素中。萜類化合物的基本化學骨架由異戊二烯單元構(gòu)成，是甲戊二羥酸的衍生物。其化學結(jié)構(gòu)中C1、C3、C4、環(huán)戊烷部位為活性部位，其中C1位易與羥基、甲氧基或酮基結(jié)合，與羥基結(jié)合時易與糖結(jié)合形成苷；C3、C4位易氧化形成雙鍵，C4位易形成羰基、羧基、酯基等；環(huán)戊烷部位依氧化程度不同形成不同的環(huán)。這些活性部位對萜類化合物的生物活性至關重要。根據(jù)萜類化合物中異戊二烯單元的數(shù)量，可將該類化合物進一步分為單萜類化合物(monoterpenoids)、二萜類化合物(diterpene)以及三萜類化合物(triterpenoids)。

4.1 單萜類化合物

單萜由2個異戊二烯單元構(gòu)成，分為無環(huán)單萜、單環(huán)單萜、雙環(huán)單萜及三環(huán)單萜4類,前3類多見于天然化合物。Ahmed等[25]從秋海棠根的甲醇提取物中純化出維諾酮(vernonione)。維諾酮對刀豆脲酶具有明顯的抑制作用，IC50值為227.6 μmol/L。

4.2 二萜類化合物

二萜的分子式為(C5H8)4，由4個異戊二烯單元構(gòu)成。Ahmad等[40]從大戟屬(Euphorbiadecipiens)植物中分離出的具有曼西醇型骨架的二萜類酯類化合物—3,7,15-三-O-乙?；?5-O-煙酰胺基-13,14-二羥基肉豆蔻素，該化合物對刀豆脲酶的IC50值為81.9 μmol/L，而在另一篇報道中，該化合物對巴氏桿菌脲酶的抑制效果較好，抑制常數(shù)(Ki)為117.4 μmol/L，是巴氏桿菌脲酶的反競爭性抑制劑[26]。

4.3 三萜類化合物

三萜類化合物由6個異戊二烯單位聚合而成，以游離形式或以與糖結(jié)合成苷或酯的形式存在于植物體內(nèi)。

Akhtar等[27]從雞蛋花(Plumeriarubra)甲醇提取物的乙酸乙酯溶解物中分離出蘆丁醇(rrubrajaleelol)和紅楊酸(rubrajaleelic acid)。它們對幽門螺旋桿菌脲酶的IC50值分別為24.2和58.9 μmol/L。

Kazmi等[28]從花楸屬植物(Sorbuscashmiriana)的甲醇提取物的氯仿可溶部分中分離出的2種新的羽扇烷型三萜類化合物山梨素A(sorbicins A)和山梨素B(sorbicins B)。山梨素A對刀豆脲酶的IC50值為85.2 μmol/L，山梨素B對刀豆脲酶的IC50值為17.8 μmol/L，可見山梨素B的脲酶抑制活性要強于參比脲酶抑制劑硫脲(IC50值為21.6 μmol/L)。

Khan等[29]從駝蹄瓣(ZygophyllumfabagoLinn)分離出5種烏蘇烷型硫酸皂苷。其中3β,23-雙-O-磺酰-23-羥基脲-20(21)-烯-28-烏蘇酸28-O-[β-D-吡喃葡萄糖基]-酯(人參皂甙A)在濃度為500 μmol/L時，對巴氏桿菌脲酶抑制率達87%。在該濃度下參比脲酶抑制劑硫脲的抑制率為98%。SAR研究表明，該類化合物結(jié)構(gòu)中硫酸酯部分，有助于將分子固定在脲酶的活性中心的口袋狀結(jié)構(gòu)中，對這些化合物的脲酶抑制活性起著重要作用。

5 其他植物有效成分提純物

5.1 生物堿類

生物堿是一類天然存在的有機含氮堿。生物堿對人類和動物具有各種重要的生理作用。它們由包括植物在內(nèi)的多種生物產(chǎn)生。Ahmed等[30]自板藍根(Isatistinctoria)中分離出的3-羥乙基葡萄球菌素和表紅葡萄球菌素，對巴氏桿菌脲酶的IC50值分別為25.6和37.0 μmol/L，對刀豆脲酶IC50值分別為31.7和47.3 μmol/L。SAR分析表明，該化合物的羥基/羰基與脲酶的活性位點的螯合有關，隨著羥基/羰基數(shù)量的增加，該類化合物的脲酶抑制活性增加。如3-羥乙基葡萄球菌素化學結(jié)構(gòu)中的羥基比表紅葡萄球菌素多，因其脲酶抑制活性更強。

小檗堿是植物中分離得到的一種生物堿，具有廣泛的生理功能，其潛在的生物活性具有較大的開發(fā)和應用價值。近年來，有關小檗堿及其衍生物的脲酶抑制活性報道較多。Li等[31]報道了小檗堿的幽門螺旋桿菌脲酶及刀豆脲酶抑制活性，其IC50值分別為7.135×103和9.097×103μmol/L，而相同條件下參比脲酶抑制劑乙酰氧肟酸的IC50值分別為41.294和25.310 μmol/L。Bae等[41]還報道了小檗堿對幽門螺旋桿菌的抗菌活性，其最低抑菌濃度(MIC)值為40 μg/mL。Tan等[32]從黃連(Rhizomacoptidis)中分離出鹽酸小檗堿，其對幽門螺旋桿菌脲酶的IC50值為(3.00±0.01) μmol/L，對刀豆脲酶的IC50值為(2.30±0.01) μmol/L，而參比脲酶抑制劑乙酰氧肟酸對幽門螺旋桿菌的IC50值為(83.00±0.01) μmol/L，對刀豆脲酶的IC50值為(22.00±0.01) μmol/L。表小檗堿與脲酶蛋白的巰基結(jié)合而抑制其活性。酶動力學研究表明，表小檗堿是幽門螺旋桿菌的反競爭性抑制劑，相應的Ki值為(10.60±0.01) μmol/L，為刀豆脲酶的競爭性抑制劑，相應的Ki值為(4.60±0.01) μmol/L。分子對接表明，表小檗堿通過N—H……O相互作用與幽門螺旋桿菌脲酶上的氨基酸殘基Asn-168和Met-366相互作用(圖4-A)，與刀豆脲酶上的Gly-641相互作用(圖4-B)。

圖4 表小檗堿與幽門螺旋桿菌脲酶(A)及刀豆脲酶(B)的結(jié)合模式圖

5.2 醌類

Zaborska等[42]報道了1,4-萘醌對刀豆脲酶的抑制活性，其IC50值為30 μmol/L。Kot等[43]評價植物來源的5-羥基-1,4-萘醌和1,4-萘醌對刀豆脲酶的抑制活性，IC50值分別為13.5和20.0 μmol/L。

Uddin等[33]從散沫花(L.albaLam)的莖中分離獲得了2-(β-D-二吡喃葡萄糖氧基)-1,4-萘醌。該化合物對刀豆脲酶的IC50值為62 μmol/L。研究表明醌類化合物的脲酶抑制活性與它們在橋接脲酶中巰基的能力有關。Muhammad等[34]從草藥紫羅蘭(ViolaBetonicifolia)中提純出3-甲氧基黃檀酮。該化合物對巴氏桿菌脲酶的IC50值為169 μmol/L。該化合物是脲酶的競爭性抑制劑，相應的Ki值為138.2 μmol/L。

5.3 鞘脂類化合物

Akhtar等[27]從紅楊(P.rubra)中提取了紅藻糖苷。該化合物對幽門螺旋桿菌脲酶的IC50值為45.7 μmol/L。Firdous等[35]從蛇床子(Heliotropiumophioglossum)中純化出2種新型鞘脂的鄰苯二甲酰胺A(ophiamide A)和鄰苯二甲酰胺(ophiamide B)，對刀豆脲酶的IC50值分別為23.1和12.6 μmol/L。SAR研究表明，該類化合物結(jié)構(gòu)中糖基(葡萄糖)結(jié)構(gòu)對于其脲酶抑制活性至關重要。

5.4 含硫化合物

Fahey等[36]從西蘭花(broccoli)中分離出伊貝林(iberin)和蘿卜硫素(sulforaphane)。2種化合物對刀豆脲酶的IC50值分別為178.8和190.5 μmol/L,對幽門螺桿菌脲酶的IC50值分別為216.8和225.7 μmol/L，Juszkiewicz等[37]從大蒜中分離出大蒜素(allicin)，對刀豆脲酶的IC50值為21.8 μmol/L。SAR研究表明，大蒜素的脲酶抑制活性與其同活性中心中Cys592位點的SH-基團之間的結(jié)合有關。

6 小 結(jié)

植物天然產(chǎn)物化合物的結(jié)構(gòu)豐富，是低生物毒性、副作用小的脲酶抑制劑的理想來源之一。而目前開發(fā)植物天然產(chǎn)物化合物作為脲酶抑制劑主要的發(fā)展方向為：1)在未來研究中，應盡量獲取植物提取物中單一成分的植物天然產(chǎn)物化合物，并研究不同配比植物天然產(chǎn)物化合物的脲酶抑制效果及其中各單一成分化合物的化學結(jié)構(gòu)與其脲酶抑制作用的構(gòu)效關系，豐富具有脲酶抑制作用的化學骨架庫。2)進一步研究羥基、羧基、脂鏈烴及類黃酮結(jié)構(gòu)等報道較多的具有脲酶抑制作用的化學骨架之間的互作關系，為脲酶抑制先導化合物及天然化合物的修飾與優(yōu)化提供理論依據(jù)。3)目前對于植物提取物中天然化合物的評價還停留在簡單的脲酶活性和酶動力學評價水平，對產(chǎn)品開發(fā)參考作用有限，應進一步以體外微生物培養(yǎng)及動物模型評價這些化合物，探討它們對微生物區(qū)系、動物健康及生產(chǎn)指標的影響，并給出在動物生產(chǎn)中適宜的添加量，同時還應考慮天然化合物的多效性，從多方面進行評價。4)開發(fā)植物天然產(chǎn)物化合物的合成工藝，以利于工業(yè)化合成并降低合成成本。