結(jié)合珠蛋白基因多態(tài)性對糖尿病血管并發(fā)癥的影響研究

鄭盼盼，胡慶山，劉 珊，趙維麗，李 洋，孫一嬋，劉贊朝

(河北省糖尿病基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實驗室/河北省石家莊市第二醫(yī)院，石家莊 050051)

糖尿病是由復(fù)雜的遺傳-環(huán)境相互作用引起的一種常見慢性臨床綜合征，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。中國是世界上糖尿病人口最多的國家，也是世界上糖尿病發(fā)病率上升最快的國家之一[2]。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者發(fā)生微血管病變和大血管病變的風(fēng)險顯著高于非糖尿病患者[3]。我國糖尿病的主要類型為2型糖尿病(T2DM)。T2DM的發(fā)病機(jī)制和糖尿病血管并發(fā)癥與炎癥及氧化應(yīng)激有關(guān)[4-5]。結(jié)合珠蛋白(Hp)是一種急性時相蛋白，與通過溶血或正常紅細(xì)胞周轉(zhuǎn)釋放到循環(huán)中的血紅蛋白特異性結(jié)合，結(jié)合的復(fù)合物被巨噬細(xì)胞上清除受體CD163介導(dǎo)的內(nèi)吞作用降解從而發(fā)揮抗氧化和抗炎作用[6]。近年來多個研究報道Hp基因分型與糖尿病血管并發(fā)癥有關(guān)[7-9]。并認(rèn)為Hp基因型可用于糖尿病患者的個性化抗氧化治療[7]。研究亦報道糖尿病血管并發(fā)癥的風(fēng)險與性別有關(guān)[10]。雖然不同人群中血管并發(fā)癥與Hp的關(guān)系已有報道，但結(jié)果尚不清楚。本研究描述了中國北方漢族男性T2DM患者Hp基因多態(tài)性與各血管并發(fā)癥的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

抽取2016年8月至2018年11月本院建檔男性T2DM患者403例為研究對象，平均年齡(60.52±8.23)歲，平均BMI(26.03±2.75)kg/m2。所有患者均符合1999年世界衛(wèi)生組織糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn):空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L、餐后2 h血糖(2 h PG)≥11.1 mmol/L或糖化血紅蛋白(HbA1c)≥47.5 mmol/L(6.5%)。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)同意,患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)男性；(2)T2DM患者；(3)年齡大于或等于50歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)免疫性血管炎；(2)最近3個月內(nèi)急性心肌梗死或冠狀動脈粥樣硬化性心臟病發(fā)作；(3)急性或慢性感染；(4)糖尿病急性并發(fā)癥；(5)終末期腎??；(6)近5年內(nèi)患惡性腫瘤。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本的采集和檢測

記錄403例男性T2DM患者的年齡、糖尿病病程、身高、體重等基本信息。所有參與者禁食10 h，次日早晨采集外周血，檢測臨床生化指標(biāo)，提取DNA。BMI以體重(kg)/身高(m)2計算。收縮壓(SBP)和舒張壓(DBP)測量采用自動血壓計(日本Omron)坐位休息5 min后測量。自動生化檢測儀測定FPG、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、C肽、血尿素氮(BUN)、血清肌酐(Cr)、α1微球蛋白(α1-M)和β2微球蛋白(β2-M)水平；采用放射免疫分析法測定空腹胰島素(FIns)水平；采用免疫散射比濁法測定尿微量清蛋白(mAlb)；采用免疫透射比濁法測定HbA1c水平；全自動血液分析儀測定血液中血紅蛋白(HGB)水平。

1.2.2Hp基因分型檢測

使用儀器指定核酸提取試劑盒在核酸自動提取儀(天隆GeneRotex96，中國)中進(jìn)行基因組DNA提取。根據(jù)KOCH等[11]的報道，采用序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-SSP)進(jìn)行Hp基因分型檢測。20.0 μL反應(yīng)體系中包含100 ng的DNA、上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL、2×Rapid Taq Master Mix(諾唯贊，中國)10.0 μL，添加ddH2O補(bǔ)至20.0 μL。反應(yīng)所需引物A(5′-GAG GGG AGC TTG CCT TTC CAT TG-3′)、引物B(5′-GAG ATT TTT GAG CCC TGG CTG GT-3′)、引物C (5′-CCT GCC TCG TAT TAA CTG CAC CAT-3′)和引物D (5′-CCG AGT GCT CCA CAT AGC CAT GT-3′)均由上海生工生物工程公司合成。引物A和B分別擴(kuò)增1 757 bp Hp1等位基因特異性序列和3 481 bp Hp1等位基因特異性序列，然后用引物C和引物D擴(kuò)增349 bp Hp2等位基因特異性序列。PCR反應(yīng)條件如下:95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性1 min，69 ℃退火2 min(A引物和B引物)或1 min(C引物和D引物)，72 ℃延伸2 min，共 33個循環(huán)；末次循環(huán)后72 ℃充分延伸7 min，冷卻至4 ℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳30 min后在成像系統(tǒng)中觀察并拍照。

1.3 觀察指標(biāo)

(1)PCR-SSP方法體外擴(kuò)增Hp基因片段，瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶位置以進(jìn)行Hp基因分型。(2)統(tǒng)計分析各組Hp等位基因與基因型的頻率，并進(jìn)行比較。(3)觀察BMI、SBP、DBP、FPG、HGB、FIns、TG、TC、LDL-C、LDL-C、C肽、BUN、Cr、α1-M、β2-M、mAlb、HbA1c等臨床生化和個體指標(biāo)水平，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 Hp基因分型PCR電泳結(jié)果

采用PCR-SSP法測定了403例男性T2DM患者的Hp基因型。引物A、B分別從含有Hp1和Hp2等位基因的基因組DNA中擴(kuò)增出1 757 bp 和3 481 bp的特異性片段。引物C、D從含有Hp2等位基因的基因組DNA中擴(kuò)增出349 bp的特異性片段(圖1)。然后再通過第一代測序確認(rèn)PCR得到的目標(biāo)片段為Hp1和Hp2。引物A和B擴(kuò)增基因組DNA得到的約1 kbp和2 kbp的明顯冗余條帶，經(jīng)Primer-BLAST(Pubmed)和第一代測序證實分別是鈣調(diào)素結(jié)合轉(zhuǎn)錄活性因子1亞基4及結(jié)合珠蛋白相關(guān)前體(HPR)的基因片段。

2.2 Hp基因型與T2DM患者血管并發(fā)癥的關(guān)系

各組基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。所有參與者分為無血管并發(fā)癥的對照(DM)組、糖尿病腎病(DN)組、糖尿病眼病(DR)組、DN+DR組、心血管病(CVD)組和CVD+DN+DR組共6組。 結(jié)果顯示DN組、DN+DR組、CVD組、CVD+DN+DR組與DM組比較，Hp基因型及等位基因頻率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。僅DR組與DM組比較，Hp基因型頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。DM組和DR組的Hp基因型頻率分別為:Hp1-1 3.70%和0；Hp2-1 37.04%和15.15%；Hp2-2 59.26%和84.85%。Hpdel只在DM組檢測到1例。見表1。

表1 各組等位基因和基因型頻率比較[n(%)]

Ⅰ：MarkerⅢ(Biosharp);Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ：引物A和B的擴(kuò)增產(chǎn)物；Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ：引物C和D的擴(kuò)增產(chǎn)物；Ⅱ、Ⅲ：Hp1-1基因型患者的基因擴(kuò)增產(chǎn)物；Ⅳ、Ⅴ：Hp2-2基因型患者的基因擴(kuò)增產(chǎn)物；Ⅵ、Ⅶ：Hp2-1基因型患者的基因擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.3 DM組患者與DR組患者臨床特征比較

DM組與DR組兩組間年齡、BMI、SBP、DBP、FPG、HbA1c、FIns、HGB、CP、α1-M、β2-M、HDL-C、LDL-C、mAlb、Cr和BUN水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與DM組比較，DR組患者糖尿病病程較長，TG水平較低，TC水平較高(P<0.01)。見表2。

表2 DM組、DR組臨床和生化指標(biāo)比較

續(xù)表2 DM組、DR組臨床和生化指標(biāo)比較

3 討 論

人類Hp基因位于16q22號染色體上，具有兩個等位基因：Hp1和Hp2[12]。Hp1等位基因在物種間保守，Hp2等位基因的形成可能是兩個Hp1基因的第四個和第二個內(nèi)含子的非同源位置的斷裂和重組的結(jié)果。兩個等位基因產(chǎn)生了Hp1-1、Hp2-2和Hp2-1 3種常見的表型和1種罕見的等位基因缺失型Hpdel[11]。Hp等位基因和基因型的分布在人種和地區(qū)上存在差異。在歐洲裔美國人中Hp基因型分布約為16% Hp1-1、48% Hp2-1和36% Hp2-2[13]。與歐洲人和美國人比較，亞洲人的Hp1等位基因頻率較低。本研究顯示403例男性T2DM的Hp等位基因和基因型分布分別為Hp2-2 60.45%、Hp2-1 34.33%、Hp1-1 5.22%，與1項在中國北方漢族人群中T2DM患者組的Hp基因型分布分別為Hp2-2 51.7%、Hp2-1 39.7%、Hp1-1 8.6%的研究報道相似[14]。與歐洲人和美國人比較，亞洲人的Hp1等位基因頻率較低的報道[15]相符。

臨床和實驗數(shù)據(jù)表明Hp基因分型是糖尿病血管并發(fā)癥的獨(dú)立危險因素，具有Hp2-2基因型的糖尿病患者發(fā)生血管并發(fā)癥如DR[16]、DN[17]和CVD[18]的風(fēng)險增加。研究發(fā)現(xiàn)Hp2-2基因型與T2DM之間存在相關(guān)性[19-20]。Hp基因型與1型糖尿病(T1DM)的微血管和大血管并發(fā)癥有關(guān)，而與T2DM心血管并發(fā)癥的相關(guān)性更為一致[7]。Hp2-2基因型可能是T2DM患者心血管疾病的危險因素[9]，而Hp2-2在中國T2DM患者微血管疾病中的作用罕見報道。本研究結(jié)果顯示Hp基因型及等位基因頻率與DN、DN+DR、CVD、CVD+DN+DR無關(guān)，而DR患者有更高的Hp2-2基因型。與Hp2-2基因型可能是T2DM視網(wǎng)膜病變的一個危險因素[21]的報道相符。在T1DM中晚期男性中更常見糖尿病視網(wǎng)膜病變和黃斑水腫[22]，男性出現(xiàn)糖尿病微血管并發(fā)癥的風(fēng)險更高，而女性出現(xiàn)糖尿病大血管并發(fā)癥的風(fēng)險更高[10]，均提示Hp2-2基因型可能與男性T2DM患者的DR風(fēng)險增加有關(guān)。Hp1蛋白的抗氧化能力高于Hp2蛋白[23]。Hp1-1蛋白能夠結(jié)合更多的Hb，更有效地促進(jìn)了CD163受體對Hp-Hb復(fù)合物的攝取，較Hp2-2蛋白能更快地被清除出循環(huán)[24]。因此，筆者認(rèn)為DR的發(fā)生可能與Hp2具有更低抗氧化能力有關(guān)。Hp基因型還是糖尿病體內(nèi)外膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控因子。在糖尿病患者中，Hp2-2-Hb復(fù)合物攜帶的HGB相關(guān)鐵離子和活性氧物質(zhì)與HDL中的載脂蛋白A1 (ApoA1)相互作用，致使HDL中內(nèi)源性Hb和氧化還原活性鐵的水平增加，HDL功能異常、膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)能力降低[25]。也有報道稱在Hp基因中反復(fù)出現(xiàn)的外顯子缺失與較低的血膽固醇水平有關(guān)[26]。本研究發(fā)現(xiàn)DR組患者有更低的TG水平和更高的TC水平，說明DR的發(fā)生可能與Hp基因型導(dǎo)致異常的血脂水平有關(guān)。

綜上所述，糖尿病血管并發(fā)癥全球流行，但很少有研究調(diào)查或報道糖尿病血管并發(fā)癥的性別差異。本研究首次報道了在中國北方漢族人群中Hp2-2基因型可能與男性T2DM患者DR風(fēng)險增加有關(guān)。這個發(fā)現(xiàn)將有助于該疾病的早期診斷和及時干預(yù)，但本研究存在一定的局限性，仍需要在更大的隊列中進(jìn)行基于人群的前瞻性研究來了解Hp等位基因與T2DM患者DR風(fēng)險之間的潛在機(jī)制。