茶樹根際土壤細菌多樣性及其主要環(huán)境影響因子研究

賀屹成，王夢姣，秦公偉

陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000

茶樹[Camellia sinensis (L.) O. Kuntze]是我國重要經(jīng)濟作物，茶葉產(chǎn)業(yè)成為各主產(chǎn)茶區(qū)的支柱產(chǎn)業(yè)和部分貧困地區(qū)農(nóng)民脫貧致富的重要產(chǎn)業(yè)。但在茶葉產(chǎn)業(yè)發(fā)展過程中，也出現(xiàn)了一些嚴(yán)重掣肘問題，如盲目使用化學(xué)肥料導(dǎo)致的茶園土壤土質(zhì)退化、高劑量化學(xué)農(nóng)藥施用導(dǎo)致茶葉農(nóng)藥殘留日益嚴(yán)重等。探索能顯著降低化學(xué)肥料與農(nóng)藥施用量的新技術(shù)、新方法成為促進茶葉產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要研究課題。

茶樹根際土壤微環(huán)境的穩(wěn)定性是茶樹正常生長及茶葉品質(zhì)的保證[1]，土壤微生物的多樣性和穩(wěn)定性還能促進惡劣土壤環(huán)境的生物修復(fù)[2]。 茶樹根際土壤細菌，作為茶樹根際土壤微環(huán)境中營養(yǎng)元素循環(huán)的重要驅(qū)動力，對土壤肥力和茶樹正常生長具有顯著促進作用[3]。例如，某些根際促生菌能夠分泌生長素類物質(zhì)促進植物生長[4]；某些具有較高固氮酶活性的菌株可以進行生物固氮，提供植物生長必需的氮元素[5]和提高土壤氮素含量[6]；根際促生微生物的旺盛代謝可以促進土壤有機物的分解和營養(yǎng)元素的礦化，改善土壤營養(yǎng)環(huán)境[7]，土壤營養(yǎng)元素的變化又會顯著影響土壤根際微生物的群落組成[8]，從而形成一個良性循環(huán)。不僅如此，許多根際微生物通過分泌Phenazines 及其衍生物、Tropolone 和Pyocyunim 等抑菌物質(zhì)[9-10]，達到預(yù)防和降低某些植物病害的效果。

試驗從根際微環(huán)境出發(fā)，采用高通量擴增子測序法對茶樹根際細菌的結(jié)構(gòu)和功能進行研究，并結(jié)合茶樹根際土壤營養(yǎng)元素含量、pH 值及含水量，分析土壤環(huán)境因素與根際細菌多樣性的相互關(guān)系，以期為土壤改良和微生物菌肥開發(fā)提供理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 采樣方法、采樣地及茶樹概況

采樣點為秦巴山區(qū)的鎮(zhèn)巴、寧強和城固三地的典型茶園（表1）。選擇距離根系5 ～15 cm 的根周土壤，去除土壤表面異物后，取距離地表10 ～20 cm 深度的土壤樣品；每處茶園不同樹齡樣品均按 “S”形補點，取10 份土壤樣品[11]。收集土壤樣品后迅速帶回實驗室進行充分混勻并過2 mm 篩，分裝、標(biāo)記后分別保存在4 ℃冰箱、-80 ℃冰箱。

表1 采樣信息表Table 1 Sampling Information

1.2 茶樹根際土壤理化指標(biāo)測定

茶樹根際土壤有機碳、總氮、總磷、全鉀、水解性氨、有效磷、速效鉀的含量測定分別參考森林土壤有機碳、氮、磷和鉀的測定方法[12-15]。 土壤含水量及土壤pH值測定參考喬帥等[16]方法。

1.3 茶樹根際土壤細菌多樣性分析

采用高通量測序法測定分析茶樹根際土壤細菌多樣性，DNA 提取、PCR 擴增、產(chǎn)物電泳檢測及切膠純化、構(gòu)建DNA 庫、OTU 數(shù)據(jù)的獲取及測序過程以及OUT 序列注釋過程參考WANG 等[2]方法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

1.4.1 系統(tǒng)進化樹構(gòu)建及多樣性分析

選取總體相對豐度排在前50 且有屬分類信息的OTU 代表性序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建參考Saitou[17]。

使用QIIME（V1.9.1） 軟件中的alpha_diversity. py 腳本對OTU 序列進行分析，并計算α 多樣性指數(shù)（Chao1、Shannon 以及Simpson）。

利用非度量多維尺度法（Nonmetric Multi-Dimensional Scaling, NMDS）計算樣品的Weighted Unifrac 和Uweighted Unifrac 距離，分析其β 多樣性。

1.4.2 NMDS（Non-metric Multidimensional scaling） 分析

在beta 多 樣 性 距 離（Weighted Unifrac、Unweighted Unifrac）的計算基礎(chǔ)上，基于Weighted Unifrac 和Unweighted Unifrac 距離矩陣，使用QIIME 軟件和ggplot 2 軟件包進行NMDS 分析并繪制出NMDS 圖。

1.4.3 茶樹根際理化指標(biāo)分析

茶樹根際土壤元素含量、酸堿度和含水量取3 次平行實驗平均值，用SPSS 和R 軟件，計算不同采樣地之間物理化學(xué)指標(biāo)的平均值、方差及其之間的差異性，p ＜ 0.01 表示組別之間差異性顯著，用小寫字母標(biāo)明。

1.4.4 相關(guān)性分析

RDA/CCA 分析：使用R 軟件對環(huán)境因子進行DCA（Detrended correspondence analysis）分析，根據(jù)梯度值確定模型類型，并分析繪圖。

分別用SPSS（Statistical Product and Service Solutions）和R 軟件，進行環(huán)境因子與高通量測序結(jié)果中細菌α 多樣性指數(shù)及相對豐度大于1%的門的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性

2.1.1 茶樹根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)

高通量測序結(jié)果表明，三個茶園土樣中細菌分布在41 個門中，其中相對豐度大于1%的有13 個門（圖1A），變形菌門、酸桿菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢菌門。變形菌門所占百分比在鎮(zhèn)巴及城固土樣中隨茶樹樹齡增長先下降后增高，在寧強土樣中先升高后下降；酸桿菌門所占百分比在鎮(zhèn)巴及城固土樣中隨茶樹樹齡增長先上升后下降，在寧強土樣中則持續(xù)上升；擬桿菌門所占百分比在三個采樣地均隨茶樹樹齡增長而持續(xù)下降。

三個茶園茶樹根際細菌分布于1288 個屬中，其中相對豐度占比大于1%的屬有33 個（圖1B）。地桿菌屬（16.54%）為鎮(zhèn)巴2 年樹齡茶樹根際細菌的優(yōu)勢屬,代爾夫特氏屬（8.31%）為城固20 年以上樹齡茶樹根際細菌的優(yōu)勢屬。

選取所有采樣地不同樹齡根際土壤中總體相對豐度排在前50 且有屬分類信息的OUT 代表性序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1C），并將其相對豐度進行可視化展示。結(jié)果表明，Delftia OTU3 是總體相對豐度最高的序列。

1 ～ 34 分別代表相對豐度小于1%及未鑒定種等的總和、Bryobacter、Solibacter、RB41、嗜酸棲熱菌屬、Parafrigoribacterium、Paeniglutamicibacter、 黃桿菌屬、地桿菌屬、芽孢八疊球菌屬、芽單胞菌屬、硝化螺菌屬、伯克氏菌屬、反硝化卡斯特蘭尼氏屬、代爾夫特氏屬、Massilia、Chujaibacter、 Rhodanobacter、寡養(yǎng)單胞菌屬、Udaeobacter、Chthoniobacter、Granulicella、Koribacter、Mucilaginibacter、HSB_OF53-F07、慢生根瘤菌屬、 貪嗜菌屬、Acidipila、Lysobacter、假單胞菌屬、 Haliangium、Pseudolabrys、Acidibacter、Terrimonas。

2.1.2 茶樹根際土壤細菌多樣性

土壤樣品中細菌α 多樣性指數(shù)結(jié)果（圖2A）表明，三個采樣地不同樹齡物種數(shù)量變化趨勢不完全一致，鎮(zhèn)巴采樣地10 年樹齡茶樹根際細菌數(shù)量最多；城固和寧強采樣地不同樹齡茶樹根際細菌數(shù)量有一定變化，但是變化不顯著。香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)結(jié)果表明（圖2B、圖2C），三個采樣地不同樹齡茶樹根際細菌多樣性變化不一致，鎮(zhèn)巴采樣地2 年樹齡茶樹根際細菌多樣性最差，城固采樣地10 年樹齡茶樹根際細菌多樣性最差，寧強采樣地20 年以上樹齡茶樹根際細菌多樣性最差。

采用NMDS 法對樣品的Beta 多樣性進行分析，結(jié)果表明（圖3），樹齡越大，樣品之間根際細菌群落多樣性差異越小，不同采樣地20 年以上樹齡茶樹根際樣品的細菌多樣性差異最小。

圖1 三地茶園茶樹根際土壤細菌群落組成分析Figure 1 Analysis of bacterial community composition in rhizosphere soil of tea trees in three tea gardens

圖2 三地茶園茶樹根際土壤細菌Alpha 多樣性分析 Figure 2 Analysis of α-bacterial diversity in rhizosphere soil of tea trees in three tea gardens

圖3 利用非度量多維尺度法三地茶園茶樹根際土壤細菌Beta 多樣性分析 Figure 3 Analysis of Beta-bacterial diversity in rhizosphere soil of tea trees in three tea gardens by nonmetric multidimensional scaling method

2.2 茶樹根際土壤理化性質(zhì)

茶樹根際土壤元素含量分析結(jié)果（圖4）表明，鎮(zhèn)巴和城固兩地茶樹根際土壤的有機碳、總氮、水解性氮、有效磷以及速效磷等元素含量都隨樹齡增加而呈現(xiàn)下降的趨勢，個別元素含量在20 年以上樹齡的茶樹根際土壤中略有上升（圖4A、圖4B、圖4E、圖4F、圖4G）。寧強采樣地10 年樹齡茶樹根際土壤中有機碳、總氮、水解性氮及有效磷等元素含量均為最高（圖4A、圖4B、圖4E、圖4G）；2 年樹齡茶樹根際土壤中總磷含量、有效磷含量及全鉀含量均為最高（圖4C、圖4D、圖4F）。

三地不同樹齡土壤樣品pH 值無顯著差異性（圖4H）。土壤含水量呈現(xiàn)出不同變化趨勢，含水量最高的分別是鎮(zhèn)巴采樣地10 年樹齡茶樹根際土壤、城固2 年樹齡茶樹根際土壤及寧強20 年以上樹齡茶樹根際土壤（圖4I）。

圖 4 茶樹根際土壤元素含量、pH 值及含水量（數(shù)據(jù)差異性標(biāo)注同圖1 和圖2）Figure 4 Analysis of element content, pH value and water content in rhizosphere soil of tea trees in three tea gardens

2.3 根際土壤理化性質(zhì)與細菌多樣性的相關(guān)性

采用RDA/CCA 方法對土壤理化性質(zhì)與細菌多樣性進行相關(guān)性分析，結(jié)果（圖5）表明，對采樣地根際微生物多樣性影響最大的前四位環(huán)境因子分別為土壤總氮含量、pH 值、有機碳及水解性氮。

對環(huán)境因子與細菌多樣性指數(shù)及13 個主要細菌門相關(guān)性分析結(jié)果表明，有機碳、總氮和水解氮與chao1 和shaanon 指數(shù)呈極顯著或顯著負相關(guān)，但是對simpson 指數(shù)相關(guān)性不顯著；土壤pH 值與simpson 指數(shù)顯著相關(guān)（表2）。有機碳、總氮、水解性氮、速效鉀含量與各細菌門相關(guān)性顯著或極顯著，其余環(huán)境因子與細菌門的顯著或極顯著相關(guān)數(shù)量均遠小于50%；醋酸桿菌門、放線菌門、Patescibacteria 的相對豐度受到環(huán)境因子影響大（表3）。

圖5 RDA/CCA 法分析細菌多樣性與環(huán)境因子關(guān)系Figure 5 Relationship between bacterial diversity and environmental factors analyzed by RDA/CCA method

表2 環(huán)境因子與根際土壤細菌α 多樣性指數(shù)相關(guān)性Table 2 Correlation between environmental factors and Alpha diversity index of rhizosphere soil bacteria

表3 環(huán)境因子與根際土壤細菌門的相關(guān)性Table 3 Correlation between environmental factors and microbial phylum in rhizosphere soil

3 結(jié)論與討論

本研究采用高通量測序法對秦巴山區(qū)鎮(zhèn)巴、寧強和城固三地的典型茶園中不同樹齡根際土壤細菌多樣性進行分析，共檢測到13 個主要的細菌門（門的相對豐度大于1%），這些主要細菌門在每個采樣地分布總豐度范圍為80.25%～98.95%；變形菌門、酸桿菌門以及擬桿菌門為優(yōu)勢菌門。這一結(jié)果與前人研究[18]相比，分離得到的門的種類多，優(yōu)勢菌門占比低，充分反映了樣地茶樹根際土壤細菌多樣性較為豐度。伯克氏菌、慢生根瘤菌、Chthoniobacter, Flavobacterium, Gemmatimonas, Massilia 以及 RB41 都是常見的根際促生菌[19]，這些菌都能在本研究中找到，說明本研究樣品采集地具有開發(fā)根際促生微生物的可能性。

不同樹齡茶樹根際土壤細菌多樣性變化趨勢表明，鎮(zhèn)巴2 年生樹齡茶樹根際土壤細菌豐富度最低，城固則為10 年樹齡、寧強20 年樹齡的茶樹根際土壤細菌豐度最低。值得注意的是，雖然不同采樣地細菌豐富度指數(shù)變化趨勢不一致，但是除去組中豐富度最低的樹齡，本組中剩余兩個年份樹齡茶樹根際細菌豐富度變化不顯著。因此，一方面可以得出，以上變化趨勢可能和采樣地細菌數(shù)量有一定關(guān)聯(lián)；另一方面也說明，受到細菌數(shù)量的影響，在判斷具體哪個采樣地、哪個樹齡茶樹根際細菌多樣性豐度最佳，還需繼續(xù)深入研究。

對樣品的Beta 多樣性分析結(jié)果表明，樹齡越長，茶樹根際土壤細菌結(jié)構(gòu)組成越相似。但是不同地區(qū)不同樹齡的根際土壤細菌多樣性變化不完全一致，這可能是不同地區(qū)根際土壤性質(zhì)有一定差別，如營養(yǎng)元素含量、膠體結(jié)構(gòu)、土壤性質(zhì)、土壤顆粒度等，對細菌多樣性有一定影響[20]。因長期施肥和茶樹根部有機酸的分泌，樹齡較大的茶樹根際土壤會出現(xiàn)明顯的土壤酸化、板結(jié)、正常土壤團粒被破壞等現(xiàn)象，導(dǎo)致茶樹根系延展困難，吸收功能降低，茶樹長勢逐漸減弱，分泌物逐漸降低，與根際微生物互作顯著下降[21]。細菌是土壤微生物，尤其是根際微生物中的主要種群，但是大多數(shù)細菌的最適酸堿度是中性或中性偏堿性，酸性土壤也不適合大部分細菌生存。綜合分析，本研究認為，在進行后續(xù)秦巴山區(qū)典型茶樹根際土壤微環(huán)境與茶樹互作，尤其是根際土壤細菌多樣性與茶樹的相互關(guān)系研究中，建議將10 年樹齡茶樹根際土壤作為研究對象。

本研究對土壤環(huán)境因子與茶樹根際微生物的相關(guān)性研究結(jié)果表明，土壤有機碳含量、總氮含量、水解性氮含量能夠顯著影響茶樹根際土壤細菌多樣性，pH 值與速效鉀與茶樹根際土壤細菌多樣性有一定影響，與O'Brien 和Pasternak 的結(jié)果較為一致[22-23]。