RNAi抑制小菜蛾Br-Z2/3基因?qū)ο掠渭?xì)胞凋亡基因表達(dá)及化蛹的影響

胡曉漢, 田素芬, 李亞勍, 林 碩, 陳藝欣, 魏 輝,顧曉軍,2,*, 黃勁飛,2,*, 王曦瑩, 李志華

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 福州350002; 2. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 福建省作物有害生物監(jiān)測(cè)與治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福州350003; 3. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部福州作物有害生物科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站, 福州 350013)

小菜蛾P(guān)lutellaxylostella屬鱗翅目(Lepidoptera)菜蛾科(Plutellidae)，在全世界140多個(gè)國家以及中國各地區(qū)普遍發(fā)生，幼蟲取食十字花科作物，寄主包括甘藍(lán)、芥藍(lán)、花菜、白菜、蘿卜、油菜等重要經(jīng)濟(jì)作物(https:∥www.cabi.org/isc/datasheet/42318; Zhuetal., 2011; 柯富士等, 2019)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，由該蟲所造成的損害及其控制成本每年全球累計(jì)達(dá)40～50億美元(Furlongetal., 2013)，中國達(dá)7.7億美元(Lietal., 2016)。長(zhǎng)期以來小菜蛾的防治主要依靠各類農(nóng)藥(包括化學(xué)農(nóng)藥和生物農(nóng)藥)的使用，但小菜蛾幾乎對(duì)各種農(nóng)藥都能在短時(shí)間內(nèi)迅速產(chǎn)生高水平抗性，而農(nóng)藥使用后產(chǎn)生的農(nóng)藥殘留也可能污染環(huán)境和損害人體健康。可見，小菜蛾防治急需新的防治思路。

參與昆蟲蛻皮、變態(tài)、生殖等重要生理過程及響應(yīng)病原侵染、農(nóng)藥等不良因子脅迫的相關(guān)基因的表達(dá)均受轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控(Guoetal., 2018; Heetal., 2020; Palli, 2020； 趙國棟等, 2020)，因而轉(zhuǎn)錄因子在害蟲控制及新農(nóng)藥開發(fā)中具有良好的應(yīng)用前景(Guoetal., 2018; Zhaoetal., 2018)。在眾多轉(zhuǎn)錄因子中，全變態(tài)昆蟲蛹期蛻皮激素的初級(jí)響應(yīng)基因Br在害蟲控制中的應(yīng)用價(jià)值則尤為值得關(guān)注。其對(duì)化蛹的調(diào)控機(jī)制是全變態(tài)昆蟲末齡幼蟲體內(nèi)保幼激素消失、蛻皮激素引發(fā)Br大量表達(dá)，進(jìn)而結(jié)合下游靶基因如caspase家族基因Dronc及reaper,hid和Drice等細(xì)胞凋亡關(guān)鍵基因的啟動(dòng)子區(qū)域，啟動(dòng)化蛹進(jìn)程(Jiangetal., 2000; Lee and Baehrecke, 2001; Cakourosetal., 2002; Leeetal., 2002; Kilpatricketal., 2005)。

在小菜蛾中，目前發(fā)現(xiàn)了Br-Z2/3及Br-Z7兩種Br異構(gòu)體，其中Br-Z2/3在預(yù)蛹期表達(dá)水平最高(超過表達(dá)最低成蟲階段的300倍以上)，其次是在4齡幼蟲末期(水平超過成蟲的100倍)，與小菜蛾化蛹關(guān)系更為密切(Huangetal., 2019)。通過dsRNA飼喂法處理小菜蛾4齡幼蟲后，雖然靶標(biāo)基因Br-Z2/3表達(dá)降低了40%，但是也有近40%的試蟲成功化蛹(Huangetal., 2019)，說明RNAi效率不高。本研究一方面擬采用dsRNA顯微注射法實(shí)施RNAi，以期提高RNAi效果；另一方面擬采用原核表達(dá)法合成dsRNA，代替先前的試劑盒體外合成，以期提高dsRNA合成效率。應(yīng)用大腸桿菌EscherichiacoliHT115表達(dá)獲得dsRNA具有合成時(shí)間短、合成量大、成本低的優(yōu)點(diǎn)，已在多種鞘翅目、直翅目昆蟲中成功應(yīng)用過(Ratzkaetal., 2013)。其原理是將L4440 載體(含有雙向 T7 啟動(dòng)子和 lac乳糖操縱子)轉(zhuǎn)化入大腸桿菌HT115。由于大腸桿菌HT115是RNase Ⅲ缺陷型菌株，故誘導(dǎo)該菌表達(dá)的目的基因 dsRNA不會(huì)被RNase Ⅲ酶切降解(Newmarketal., 2003)?；诖?，本研究采用原核表達(dá)系統(tǒng)大量合成Br-Z2/3 dsRNA，注射法處理小菜蛾4齡幼蟲后考察試蟲Br-Z2/3與細(xì)胞凋亡基因reaper,caspase-9和Gadd45g表達(dá)及其化蛹變化，以期進(jìn)一步闡明Br-Z2/3對(duì)小菜蛾化蛹的調(diào)控機(jī)理及其在小菜蛾防治中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

供試蟲源為本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期室內(nèi)飼養(yǎng)的小菜蛾敏感種群，幼蟲寄主植物為蘿卜苗。具體飼養(yǎng)方法條件：將蘿卜種子浸泡過夜后，再用75%百菌清可濕性粉劑(或50%多菌靈可濕性粉劑)的500倍稀釋液浸泡40 min消毒，沖洗濾干，然后將經(jīng)高溫濕熱滅菌處理的營養(yǎng)土平鋪在長(zhǎng)方形不銹鋼托盤(40 cm×20 cm)內(nèi)(厚3～3.5 cm)，充分澆水后均勻撒播蘿卜種子，待蘿卜苗長(zhǎng)至約6 cm高時(shí)，飼喂小菜蛾幼蟲(韓藝欣等, 2019)。集中收集蛹置于養(yǎng)蟲籠(長(zhǎng)×寬×高=25 cm×25 cm×30 cm)中，成蟲羽化后以10%(w/v)蜜糖水補(bǔ)充營養(yǎng)，剪取鮮嫩蘿卜苗(6 cm)，將蘿卜苗榨汁后，均勻涂于鋁箔錫紙(10 cm×10 cm)(購自鄭州鴻富源工貿(mào)有限公司)供成蟲產(chǎn)卵，飼養(yǎng)溫度25±1℃，相對(duì)濕度70%±5%，光周期16 L∶8D。

1.2 小菜蛾總RNA提取和cDNA第1鏈的合成

由于Br-Z2/3基因在預(yù)蛹期高表達(dá)(Huangetal., 2019)，故于小菜蛾的預(yù)蛹期取樣(陳藝欣等, 2011)，-80℃保存?zhèn)溆?。參考天根生化科?北京)有限公司總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，參考全式金生物技術(shù)有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA第1鏈，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 dsRNA表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)本課題組前期研究已經(jīng)上傳NCBI的小菜蛾Br-Z2/3基因序列(GenBank登錄號(hào): MG753773.1)，并以pIZT/v5-his載體中GFP序列為陰性對(duì)照，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增Br-Z2/3基因干擾片段和GFP的引物。分別在Br-Z2/3正反向引物的5′端加上SacⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)，以及在GFP正反向引物的5′端加上SacⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)。引物由福州尚亞生物技術(shù)有限公司合成，序列詳見表1。

表1 本研究所用引物

分別以1.2節(jié)合成的預(yù)蛹期小菜蛾cDNA和pIZT/v5-his質(zhì)粒為模板，使用采購自南京諾唯贊公司的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase擴(kuò)增Br-Z2/3基因RNA干擾片段及GFPRNA干擾對(duì)照片段。PCR反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性3 min; 95℃ 15 s, 59℃ 15 s, 72℃ 30 s, 35個(gè)循環(huán); 72℃ 5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物并利用凝膠回收試劑盒(天根生化科技北京有限公司)回收并純化上述PCR產(chǎn)物后，連接pEASY-Blunt Cloning載體，將陽性克隆菌液送至福州尚亞生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

使用內(nèi)切酶SacⅠ和KpnⅠ雙酶切pEASY-Blunt-Br-Z2/3質(zhì)粒和L4440空載體，并使用內(nèi)切酶SacⅠ和SalⅠ雙酶切 pEASY-Blunt-GFP質(zhì)粒及L4440空載體(酶切時(shí)間均為3 h)，凝膠回收后，將目的片段和L4440載體線性化片段在16℃環(huán)境中用T4連接酶過夜連接。連接產(chǎn)物再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂板對(duì)應(yīng)抗性LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，挑取陽性單克隆菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行酶切驗(yàn)證。

1.4 dsRNA表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)

將1.3節(jié)構(gòu)建成功的含小菜蛾Br-Z2/3基因以及GFP基因片段的dsRNA表達(dá)載體 L4440-Br-Z2/3和L4440-GFP轉(zhuǎn)化至大腸桿菌HT115感受態(tài)中，涂板對(duì)應(yīng)抗性平板培養(yǎng)過夜，挑取陽性單克隆后用T7引物擴(kuò)增檢測(cè)轉(zhuǎn)化是否成功。挑取含有dsRNA表達(dá)載體的單菌落接種于20 mL LB液體培養(yǎng)基(含50 μg/mL氨芐青霉素和50 μg/mL四環(huán)素20 μL)，37℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液OD600=0.4～0.6，加入IPTG(終濃度1 mmol/L)誘導(dǎo)，再繼續(xù)培養(yǎng)4 h，誘導(dǎo)dsRNA表達(dá)載體表達(dá)，收集菌液，采用細(xì)胞總RNA提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司)提取RNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 顯微注射法介導(dǎo)RNA干擾

根據(jù)小菜蛾4齡幼蟲體型特征(陳藝欣等, 2011)，挑取生長(zhǎng)日齡相同、體型一致的4齡第2天小菜蛾幼蟲80頭隨機(jī)放入8個(gè)直徑5 cm底部墊有濕潤濾紙的塑料培養(yǎng)皿中，每皿10頭。 在溫度25±1℃、相對(duì)濕度70%±5%、光周期16L∶8D條件下，用新鮮蘿卜苗飼喂12 h。處理組、對(duì)照組各4個(gè)培養(yǎng)皿小菜蛾4齡幼蟲分別注射100 nLBr-Z2/3 dsRNA(處理組)和100 nLGFPdsRNA(陰性對(duì)照)，dsRNA濃度約為1 000 ng/μL，采用Nanoject Ⅲ顯微注射器(購自武漢蓋爾德納科技有限公司，型號(hào)3-000-207)，注射部位為小菜蛾4齡第2天幼蟲第3腹節(jié)背板，每頭試蟲注射1次。以上實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.6 RNAi后Br-Z2/3, caspase-9, reaper和Gadd45g的表達(dá)水平測(cè)定

1.5節(jié)RNAi處理組和陰性對(duì)照組于12和24 h后隨機(jī)選取5頭幼蟲，利用總RNA提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司)提取供試小菜蛾總RNA，利用全式金生物技術(shù)有限公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第1鏈。 根據(jù)NCBI中已登錄的Br-Z2/3及其下游細(xì)胞凋亡基因caspase-9(GenBank登錄號(hào): KF030680.1),reaper(GenBank登錄號(hào): KF991219.1)和Gadd45g(GenBank登錄號(hào): MW160738)的核酸序列，用軟件Primer5.0設(shè)計(jì)其qPCR引物，內(nèi)參基因EF-1α(GenBank登錄號(hào): EF417849)定量引物參考符偉等(2012)(表1)。qPCR反應(yīng)體系參照NovoStart? SYBR qPCR SuperMix Plus (近岸蛋白質(zhì)科技有限公司)的說明書。反應(yīng)程序: 94℃ 2 min; 94℃ 5 s, 60℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán)。每個(gè)處理或?qū)φ諟y(cè)定3個(gè)樣品，每個(gè)樣品3次技術(shù)重復(fù)。

1.7 RNAi后小菜蛾生物學(xué)指標(biāo)觀測(cè)

RNAi處理后，每6 h觀察記錄試蟲死亡數(shù)、化蛹數(shù)、畸形蛹數(shù)，計(jì)算幼蟲死亡率、化蛹率、平均化蛹時(shí)間、蛹畸形率等。死亡率=(死亡蟲數(shù)/總試蟲數(shù))×100%;化蛹率=(化蛹數(shù)/試蟲總數(shù))×100%;畸形蛹率=(畸形蛹數(shù)/總化蛹數(shù))×100%。

1.8 數(shù)據(jù)分析

基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算采用2-ΔΔCT法(Livak and Schmittgen, 2001)，獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)法檢驗(yàn)處理與對(duì)照差異顯著性，顯著水平設(shè)定為P<0.05，運(yùn)用SPSS 22.0完成。

2 結(jié)果

2.1 dsRNA表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)

PCR擴(kuò)增獲得小菜蛾Br-Z2/3(圖1: A)和GFP片段(圖1: B)。將克隆的片段與克隆載體pEASY-Blunt連接轉(zhuǎn)化，對(duì)pEASY-Blunt-Br-Z2/3及 pEASY-Blunt-GFP菌液PCR檢測(cè)的結(jié)果也表明分別與預(yù)期片段基本相符(圖1: C, D)，其測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致。

L4440-Br-Z2/3菌液PCR檢測(cè)得到一條大小接近500 bp的條帶(圖1: E)，L4440-GFP菌液PCR檢測(cè)得到一條大小接近350 bp的條帶(圖1: F)，與預(yù)期相符；L4440-Br-Z2/3重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后得到一條約2 700 bp和一條約500 bp的條帶(圖1: G)。L4440-GFP重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后得到一條約2 700 bp和一條約350 bp的條帶(圖1: H)，其結(jié)果與目的片段及線性L4440質(zhì)粒片段大小一致，表明Br-Z2/3與GFP的dsRNA片段已構(gòu)建至L4440載體上。測(cè)序結(jié)果也證實(shí)構(gòu)建正確。

加入IPTG(1 mmol/L)后，于37℃誘導(dǎo)6 h，提取對(duì)照菌體總 RNA結(jié)果顯示如圖2。 L4440-Br-Z2/3菌株和L4440-GFP菌液均表達(dá)出與預(yù)期大小一致的dsRNA(箭頭所示)，而未經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)的 L4440-Br-Z2/3 菌液與L4440-GFP菌液均未表達(dá)出相應(yīng)dsRNA，純化后dsRNA濃度能夠高達(dá)1 040 ng/μL。

圖1 RNAi載體的構(gòu)建

圖2 dsBr-Z2/3 (A)和dsGFP (B)在細(xì)菌中表達(dá)的鑒定

圖3 顯微注射Br-Z2/3 dsRNA后小菜蛾4齡幼蟲中Br-Z2/3, reaper, caspase-9和Gadd45g的表達(dá)量

2.2 Br-Z2/3基因RNAi后相關(guān)基因表達(dá)變化

qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組比較，注射Br-Z2/3 dsRNA后12和24 h，Br-Z2/3相對(duì)表達(dá)量分別顯著下降了66.75%和83.47%(圖3: A)(P<0.05)；reaper相對(duì)表達(dá)量在12和24 h分別顯著下降了17.52%和82.71%(圖3: B)(P<0.05)；caspase-9相對(duì)表達(dá)量在12和24 h分別顯著上升了40.35%和34.76%(圖3: C)(P<0.05)；Gadd45g相對(duì)表達(dá)量在12和24 h分別顯著上升了321.77%和362.99%(圖3: D)(P<0.01)。

2.3 Br-Z2/3基因RNAi對(duì)小菜蛾化蛹的影響

注射Br-Z2/3 dsRNA后，處理組中試蟲便開始發(fā)生死亡，直至48 h幼蟲死亡率才穩(wěn)定在40%，而對(duì)照中死亡率較低，30 h便穩(wěn)定在6.67%(圖4: C)；處理組中即便是存活個(gè)體也沒有全部化蛹，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處理組中化蛹率為46.67%(圖4: B)，試蟲存活率低于60%(圖4: C)，而對(duì)照組中試蟲化蛹率為93.33%(圖4: B)，存活試蟲全部化蛹(圖4: C)；實(shí)驗(yàn)組中試蟲化蛹也推遲，平均化蛹時(shí)間為50.13 h，顯著長(zhǎng)于對(duì)照組的34.64 h(P<0.05)(圖4: A)；處理組成功化蛹的個(gè)體中還有相當(dāng)數(shù)量的畸形蛹，畸形率達(dá)到56.67%(圖4: D)，而對(duì)照組中蛹畸形率僅有6.67%(P<0.05)(圖4: D)；畸形主要表現(xiàn)為預(yù)蛹不能成功蛻皮及個(gè)體偏小(圖5)。

3 討論

圖4 顯微注射Br-Z2/3 dsRNA到小菜蛾4齡幼蟲后對(duì)小菜蛾平均化蛹時(shí)間(A)、化蛹率(B)、幼蟲死亡率(C)和畸形蛹率(D)的影響

圖5 小菜蛾4齡幼蟲Br-Z2/3基因RNAi后畸形蛹

通過dsRNA沉默靶基因的表達(dá)是基因功能研究的重要方法。當(dāng)前用于昆蟲學(xué)研究中dsRNA合成主要有試劑盒體外轉(zhuǎn)錄以及原核表達(dá)兩種。其中，dsRNA合成試劑盒價(jià)格較高，且合成 dsRNA 產(chǎn)出少、濃度低，而利用原核菌體表達(dá)的方法可低成本大量合成dsRNA(王雪慶等, 2018)。本研究中成功實(shí)現(xiàn)了Br-Z2/3 dsRNA的體外原核表達(dá)(圖2)，dsRNA濃度能夠高達(dá)1 040 ng/μL，較好滿足了實(shí)驗(yàn)要求。而在dsRNA的遞送方面，通常有飼喂法和注射法兩種，對(duì)于體型較大個(gè)體一般都采用注射法。Huang等(2019)應(yīng)用飼喂法研究Br-Z2/3 RNAi后試蟲化蛹變化，發(fā)現(xiàn)連續(xù)飼喂dsRNA 72 h后，試蟲Br-Z2/3基因的表達(dá)量也僅降低了40%，最終試蟲化蛹率仍可達(dá)36%。而本研究采用顯微注釋法注射Br-Z2/3 dsRNA 12 h后，試蟲Br-Z2/3的表達(dá)量便下降了66.75%，24 h更進(jìn)一步降低了83.74%(圖3: A, B)，可見相較于飼喂法，顯微注射法見效更快、效果更好。

通常昆蟲Br基因沉默與保幼激素類似物處理能表現(xiàn)相同的癥狀(Spokony and Restifo, 2007)。對(duì)小菜蛾而言，保幼激素類似物蚊蠅醚處理小菜蛾3齡末幼蟲后，試蟲死亡率升高、化蛹推遲、化蛹率下降(Duanetal., 2016)。本研究中Br-Z2/3 dsRNA顯微注射法處理小菜蛾4齡幼蟲，結(jié)果也都類似(圖4)。此外，在赤擬谷盜Triboliumcastaneum研究中也發(fā)現(xiàn)，敲除其Br-Z1-Z4中任何一個(gè)異構(gòu)體，導(dǎo)致試蟲死亡增加的同時(shí)，也有畸形蛹的出現(xiàn)(Konopova and Jindra, 2008)。本研究中也發(fā)現(xiàn)顯微注射Br-Z2/3 dsRNA后，部分試蟲雖未死亡但是所化蛹卻為畸形蛹(圖5)。

雖然改用顯微注射法后，RNAi效率顯著提高，靶基因表達(dá)降低了83.74%，但是試蟲最終化蛹率仍有近40%。其中可能有沉默效果仍不夠徹底的原因，也可能與小菜蛾中另一個(gè)Br基因Br-Z7的存在有關(guān)。Br蛋白對(duì)全變態(tài)昆蟲化蛹的啟動(dòng)機(jī)制是Br促進(jìn)細(xì)胞凋亡因子基因reaper,hid,dronc和drice等的表達(dá)從而誘導(dǎo)幼蟲相關(guān)組織的程序化死亡以及成蟲盤的分化(Jiangetal., 2000; Cakourosetal., 2002; Riddifordetal., 2003)。因而當(dāng)Br基因表達(dá)受到抑制，其下游細(xì)胞凋亡基因表達(dá)也會(huì)相應(yīng)下降，這便是試蟲reaper表達(dá)水平降低的原因(圖3: B)。然而作為dronc同源基因的caspase-9及Gadd45g表達(dá)卻顯著增加(圖3: C, D)，其中原因尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建Br-Z2/3 dsRNA原核表達(dá)系統(tǒng)，并利用該系統(tǒng)合成的dsRNA通過顯微注射遞送小菜蛾4齡幼蟲而成功抑制Br-Z2/3基因的表達(dá)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)成功干擾Br-Z2/3后，小菜蛾幼蟲死亡率顯著上升，化蛹高峰期推遲并出現(xiàn)畸形蛹；而與Br-Z2/3基因相關(guān)聯(lián)的reaper,caspase-9和Gadd45g的表達(dá)量也發(fā)生了顯著變化(P<0.05)，說明Br-Z2/3基因作為蛹期特異表達(dá)因子能夠顯著影響小菜蛾的蛹期進(jìn)程。