水通道蛋白4 小分子抑制劑的篩選和驗證

王 楠, 郭 健, 閆 冰, 劉 晴, 張 磊,3, 許會靜, 李 淼, 孫美艷

（1. 吉林醫(yī)藥學院基礎(chǔ)醫(yī)學院實驗中心，吉林 吉林 132013；2. 吉林醫(yī)藥學院檢驗學院實驗中心，吉林 吉林 132013；3. 吉林省抗體工程科技協(xié)同創(chuàng)新中心，吉林 吉林 132013；4. 吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林 長春 130033）

視神經(jīng)脊髓炎（neuromyelitis optica， NMO）是一種選擇性的累及視神經(jīng)和脊髓的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾病，臨床上以視神經(jīng)和脊髓同時或相繼受累為主要特征，呈進行性或緩解與復發(fā)交替的病程［1］。該病由Devic 于1894 年首次描述，又被稱為Devic 病，既往認為NMO 是多發(fā)性硬化的一種亞型，但隨著水通道蛋白4（aquaporin 4，AQP4）自身抗體的發(fā)現(xiàn)，多數(shù)學者達成共識，NMO 是獨立于多發(fā)性硬化的自身免疫性膜通道?。?-3］，具有其自身的發(fā)病機制和臨床特點。NMO 的發(fā)病機制尚不完全明確，研究［4-5］表明：NMO 的主要發(fā)病環(huán)節(jié)是在血清和腦脊液中出現(xiàn)了針對髓鞘星形膠質(zhì)細胞膜上AQP4 的自身抗體NMO-IgG，NMO-IgG與AQP4 結(jié)合導致星形膠質(zhì)細胞膜上水通道蛋白功能障礙而發(fā)病。因此如何有效地阻斷NMO-IgG 與星型膠質(zhì)細胞膜表面AQP4 結(jié)合，成為NMO 治療的關(guān)鍵。基于這一策略，有研究［6-7］合成了一種具有高親和力、非致病性的單克隆抗體aquaporumab，其可以與致病性NMO-IgG 抗體競爭性結(jié)合AQP4，從而達到緩解疾病的目的。但這些抗體可能激活補體系統(tǒng)產(chǎn)生NMO 類似的病理變化，從而減弱其保護作用。因此，目前亟待研發(fā)毒性小、阻斷效果明顯的小分子化合物，尤其是直接作用于星型膠質(zhì)細胞表面AQP4 進而阻斷NMO-IgG 與AQP4 結(jié)合的小分子化合物。neosutchuenenine 是從北豆根植物中分離出來的一種雙芐基異喹啉類生物堿。本研究利用表達hAQP4-M23 的FRT-AQP4細胞系和NMO 患者血清通過電化學發(fā)光的方法篩選出該化合物為AQP4 小分子阻斷劑，并對天然小分子阻斷劑的活性進行分析，從根本上阻斷由于NMO-IgG 與其抗原AQP4 結(jié)合這一關(guān)鍵環(huán)節(jié)所引發(fā)的一系列病理過程，為治療NMO 的新藥開發(fā)及指導NMO 臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器FRT-AQP4 遼寧醫(yī)學院饋贈，V79-AQP4 細胞為意大利巴里大學饋贈。NMO 血清樣本來自北京宣武醫(yī)院、遼寧省人民醫(yī)院和吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院，DMEM 高糖培養(yǎng)基（美國Sigma 公司），BSA（美國BBI 公司），胎牛血清（美國Hyclon 公司），Alex Fluo488 羊抗兔和Alexa Fluor 555 標記的抗人IgG 二抗（美國Invitrogen 公 司），兔 抗AQP4 抗 體 和HRP 標 記的抗人（美國Santa Cruz 公司），人補體（美國Sigma 公司），Cell Titer-Glo?發(fā)光測定試劑盒（美國Promega 公司），水溶性四氮唑1（water solubility tetrazole-1，WST-1）細胞活力檢測試劑盒和酶聯(lián)免疫吸附試驗 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）細胞凋亡檢測試劑盒（瑞士Roche公司）。細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司），IX71 型熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）， Fluostar Optima 多功能酶標儀（德國BMG 公司）。

1.2 高通量篩選細胞接種于96 孔細胞培養(yǎng)板（黑壁透明底） 中進行培養(yǎng)，當細胞融合度約為90%時進行篩選。以FRT-AQP4 細胞不加小分子化合物的最后一列為陰性對照，以FRT-null 細胞不加小分子化合物的第1 列為陽性對照，其余80 孔為檢測孔。每個孔采用PBS 緩沖液洗滌3 次，4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）固定10 min，3%BSA 封閉30 min（100 μL/孔）。每孔中加入中藥小分子單體化合物或者中藥組分，室溫孵育15 min。PBS 緩沖液洗滌細胞2次，加入NMO 患者血清，37 ℃下孵育1 h。PBS 緩沖液洗滌細胞2次，加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗人二抗，室溫孵育1 h。PBS 緩沖液洗滌3 次后，加入HRP 的化學發(fā)光底物［增強化學發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）］以測量HRP 活性。采用終點檢測法測定化學發(fā)光，整合時間為100 ms，等待5 min 后，檢測每孔的化學發(fā)光強度，以熒光強度表示HRP 活性，保存記錄，原理見圖1。

1.3 免疫染色法檢測neosutchuenenine 阻斷NMO-IgG 與AQP4 的結(jié)合作用表達AQP4-M23的V79-AQP4 細胞 培 養(yǎng)24 h， PBS 緩 沖 液 洗 滌3 次， 3%BSA 在 室 溫 下 封 閉 細 胞1 h。 加 入neosutchuenenine 或二甲基亞砜（DMSO），室溫孵育15 min，加入NMO 患者血清或非NMO 患者對照血清（1∶200）4 ℃過夜。PBS 緩沖液洗滌V79-AQP4 細胞3 次，加入Alexa Fluor 555 標記的山羊抗人IgG 二抗（1∶400）溫育30 min。AQP4 免疫熒光染色時，將V79-AQP4 細胞在4%PFA 中室溫固 定10 min， 0.5%Triton X-100 通 透10 min，3%BSA 封閉1 h 后，加入兔抗AQP4 抗體（1∶200）室溫孵育2 h，Alexa Fluor 488 標記的山羊抗兔IgG（1∶200）二抗孵育30 min，熒光顯微鏡觀察熒光強度。

1.4 熒光淬滅法檢測neosutchuenenine 對細胞水通透性的作用本實驗采用鈣黃綠素熒光猝滅法檢測細胞膜的通透性。將細胞接種到96 孔細胞培養(yǎng)板（黑壁透明底） 中培養(yǎng)24 h，細胞單層鋪滿孔底，PBS 緩沖液沖洗2 次，加入5 μmol·L－1calcein-AM，室溫孵育15 min。棄去calcein，PBS 緩沖液沖洗2 次，加入300 mOsm 的等滲PBS 緩沖液，F(xiàn)luorStar 熒光測定3 s 后自動向孔中加入500 mOsm 的高滲PBS 緩沖液，繼續(xù)測定30s，生成全程曲線。熒光值從加液開始到淬滅最低為止所用的時間以τ 表示，以1/τ 表示細胞的水通透性。

1.5 Cell Titer-Glo? 發(fā)光法檢測補體依賴的細胞毒性將細胞與neosutchuenenine 或DMSO 孵育15 min，以正常人的血清（1∶200） 作為陰性對照，加入NMO 患者血清和5%人補體于37 ℃孵育1 h。每孔中加入100 μL CellTiter-Glo?試劑，震蕩混勻5 min 后，室溫孵育25 min， Fluostar Optima酶標儀進行檢測。

1.6 WST-1 法檢測neosutchuenenine 作用下細胞活性采用細胞活力試劑盒和1 種四唑鹽試劑WST-1 快速檢測細胞活性。加細胞懸液100 μL 到96 孔細胞培養(yǎng)板，37 ℃、5% CO2孵育過夜，采用一定濃度的neosutchuenenine 處理細胞24 h，在每孔中加入10 μL WST-1溶液，37 ℃孵育1 h，在酶標儀450 nm 處測定吸光度（A） 值，以A 值表示細胞活性。

圖1 NMO-IgG 與AQP4 結(jié)合的天然小分子阻斷劑篩選原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of screening principle of natural small molecules inhibitors of binding of NMO-IgG to AQP4

1.7 ELISA 法檢測neosutchuenenine 作用下細胞凋亡情況采用ELISA 細胞凋亡檢測試劑盒，通過定量檢測細胞死亡后相關(guān)DNA 片段反映細胞的凋亡。將neosutchuenenine 與70%融合度的細胞作用24 h 后，將細胞裂解物置于鏈霉親和素包被的微孔板中，加入80 μL 免疫反應試劑（含生物素標記的抗DNA-POD 和抗組蛋白的抗體），室溫孵育2 h，加入ABTS 底物100 μL，室溫孵育15 min，在405 nm 處 檢 測A 值。

1.8 統(tǒng)計學分析采用Graphpad Prism 7 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。采用Shapiro-Wilk 檢驗法分析各組數(shù)據(jù)的正態(tài)分布。各組細胞中水通透性水平、細胞毒性水平、細胞活性和細胞凋亡水平均呈正態(tài)分布，以±s 表示，2組間樣本均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，2種細胞不同濃度樣本均數(shù)比較采用雙因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 化學發(fā)光法檢測小分子對NMO-IgG 與AQP4結(jié)合的抑制作用本研究利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染AQP4-M23亞型的FRT 細胞為抑制劑篩選模型，從含有50 000 種中藥粗提物組分進行初步篩選，結(jié)果表明：與FRT-AQP4 組比較，分離出的4 個連續(xù)組分的化學發(fā)生強度明顯降低，即HRP 活性明顯升高（P＜0.01），表明該4 種組分對NMO-IgG 與AQP4 的結(jié)合具有明顯的抑制作用。與DMSO 組比較，這些組分在二次篩選中HRP 活性明顯升高（P＜0.01），表明篩選出的4 種組分對NMO-IgG依賴的補體細胞毒性具有明顯的抑制作用。對該中藥的活性成分進行分離和鑒定，鑒定出1 種名為neosutchuenenine 的小分子。見圖2。

2.2 免疫染色法檢測neosutchuenenine 對NMOIgG 與AQP4 結(jié)合的抑制作用采用免疫熒光法分析neosutchuenenine 對NMO-IgG 與AQP4 結(jié) 合 的 抑制作用。在DMSO 或neosutchuenenine 作用下，將V79-AQP4 細胞與NMO-IgG 孵育、固定和通透后，加入Alexa Fluor 555 偶聯(lián)二抗。與DMSO 組比較，將細胞與neosutchuenenine 孵育后，紅色熒光減弱。同時，使用抗C 末端的AQP4 抗體和Alexa Fluor 488 標記的二抗檢測AQP4 的表達，與DMSO 組比較，neosutchuenenine 實驗組抗C 末端AQP4 抗體產(chǎn)生的綠色熒光無明顯變化，表明neosutchuenenine抑制了NMO-IgG 與AQP4 的結(jié)合，不影響AQP4的正常表達。見圖3。

圖2 4 種連續(xù)組分對NMO-IgG 與AQP4 結(jié)合的抑制作用Fig.2 Inhibitory effects of four fractions on binding of NMO-IgG to AQP4

2.3 熒光猝滅法檢測neosutchuenenine 作用下細胞 水 通 透 性與 DMSO 組 比 較，加 入neosutchuenenine 后，calcein 熒光值變化速率無明顯變化（熒光值變化曲線1/τ 表示細胞的水通透性）。表明neosutchuenenine 不影響V79-AQP4 細胞對水的通透性。見圖4。

2.4 CellTiter-Glo? 發(fā)光法檢測neosutchuenenine作用下補體依賴的細胞毒性將V79-AQP4 細胞與neosutchuenenine 或DMSO 孵育15 min，以正常人血清（1∶200）作為陰性對照，加入NMO 患者血清和5%人補體，通過CellTiter-Glo?發(fā)光法檢測neosutchuenenine 的細胞毒性。與non-NMO 組比較，NMO 組隨抑制劑濃度的升高，相對發(fā)光強度增高，表明neosutchuenenine 以濃度依賴性方式增加了NMO-IgG /補體處理的V79-AQP4 細胞的活性。見圖5。

圖3 免疫熒光法檢測neosutchuenenine 對NMO IgG 與AQP4 結(jié)合的抑制作用(Bar=50 μm)Fig.3 Inhibitory effects of neosutchuenenine on binding of NMO IgG to AQP4 detected by immunofluorescence method（Bar=50 μm）

2.5 WST-1 法檢測neosutchuenenine 作用下細胞活性與DMSO 組比較，2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、 100.0 和200.0 μmol·L－1neosutchuenenine在450 nm 處A 值無明顯變化（P＞0.05），且各組間細胞A 值比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明在本研究使用的neosutchuenenine 劑量范圍內(nèi)，細胞增殖差異無統(tǒng)計學意義。見圖6。

2.6 ELISA 法檢測neosutchuenenine 作用下細胞凋亡情況細胞凋亡的發(fā)生是由于鈣-鎂依賴性核酸酶切割DNA 后產(chǎn)生大量核小體片段，核小體含有組蛋白，采用雙抗體夾心酶免疫法，可進行比色法分析細胞凋亡情況。與DMSO 組比較，2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 和200.0 μmol·L－1neosutchuenenine 組405 nm 處A 值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），且各組間細胞A 值比較差異無統(tǒng)計學 意 義 （P＞0.05），表 明 在 本 研 究 使 用 的neosutchuenenine 劑量范圍內(nèi)，細胞凋亡差異無統(tǒng)計學意義。見圖7。

3 討 論

圖4 neosutchueneninel 作用下V79-AQP4 細胞水通透性Fig. 4 Water permeabilities of V79-AQP4 cells after treated with neosutchuenenine

水通道蛋白（aquaporin，AQP） 是一類特異性快速轉(zhuǎn)運水和其他小溶質(zhì)的細胞膜通道類蛋白家族［8-14］。迄今為止，在已鑒定的13 種同源AQP中，AQP4 引起了越來越多的關(guān)注。研究［15-18］顯示：AQP4 對耳聾和腦水腫的形成有重要作用，并且 是NMO自身抗體NMO-IgG 的靶抗原［19-20］。NMO 患者血清中抗AQP4 的NMO-IgG 自身抗體與AQP4 的結(jié)合增強了NMO 的血管周圍炎癥特性，引起血腦屏障的破壞，是NMO 發(fā)病的主要環(huán)節(jié)［21-22］。目前，臨床上NMO 的治療主要是對癥治療，如甲基潑尼松龍、免疫抑制和血漿置換等，但只能在一定程度上緩解患者的癥狀，不能從根本上治愈NMO［23-24］?？梢?，NMO-IgG 與AQP4 結(jié)合的抑制劑成為NMO 的潛在治療候選物。理想的抑制劑應有效阻斷NMO-IgG 與AQP4 的結(jié)合而不損害其他細胞。在以往的研究［25］中鑒定了NMO-IgG與AQP4 結(jié)合的抑制劑異粉防己堿，使用補體依賴的細胞毒性（complement dependent cytotoxicity，CDC） 實驗證明了異粉防己堿的活性，證明了異粉防己堿具有低細胞毒性，且不影響AQP4 的水轉(zhuǎn)運功能。本研究分析了雙芐基異喹啉類生物堿中neosutchuenenine 小分子對NMO-IgG 與AQP4 結(jié)合的抑制作用，表明neosutchuenenine 抑制了依賴NMO-IgG 的補體細胞毒性。

圖5 neosutchuenenine 作用下各組V79-AQP4 細胞毒性Fig.5 Cytotoxicities of V79-AQP4 cells in various groups after treated with neosutchuenenine

圖6 neosutchuenenine 作用下各組V79-AQP4 細胞活性Fig.6 Activities of V79-AQP4 cells in various groups after treated with neosutchuenenine

圖7 Neosutchuenenine 作用各組V79-AQP4 細胞凋亡情況Fig.7 Apoptosis of V79-AQP4 cells in various groups after treated with neosutchuenenine

北豆根屬于防己科類植物蝙蝠葛（ManispernumdaericumDC.） 根莖，主要出產(chǎn)在東北、華北及山東和陜西等不同地域［26］，其性味苦寒，能清熱解毒，有小毒，能祛風且止痛，普遍用于治療咽喉腫痛、風濕痹痛和腸炎痢疾等病癥［27-28］。目前已從北豆根中分離出生物堿類、酚酸類、醌類、醇類、揮發(fā)油和多糖等多種成分。其中，生物堿類成分是其主要生物活性成分，可為雙芐基四氫異喹啉型生物堿、氧化異阿樸啡型生物堿、嗎啡烷型生物堿、阿樸啡型生物堿、原小檗堿型生物堿、異喹啉和異吲哚型生物堿，這些生物堿類成分常作為北豆根質(zhì)量控制的指標［29-31］。本研究中分離的小分子化合物neosutchuenenine 是一種雙芐基異喹啉類生物堿，該分子抑制了NMO-IgG 與AQP4 結(jié)合，有效降低NMO-IgG 補體處理過的V79-AQP4 細胞中的補體依賴性細胞毒性，且不影響V79-AQP4 細胞的增殖和凋亡。因此，具有生物活性的天然小分子阻斷劑neosutchuenenine 的分離和鑒定為有效治療NMO 提供了新思路。