姜黃素對(duì)肺癌相關(guān)LncRNA表達(dá)及厄洛替尼敏感性的影響

徐亞莉，曹曉靜，朱小珍，朱光輝

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 藥學(xué)部，浙江 溫州 325027

肺癌是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率及病死率均居首位的惡性腫瘤，且呈現(xiàn)出快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)[1]。表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變是導(dǎo)致肺癌發(fā)生發(fā)展最主要的原因之一，其持續(xù)活化將導(dǎo)致下游多種原癌基因網(wǎng)絡(luò)的激活[2]。EGFR-酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKI）可顯著抑制EGFR活性，阻止下游信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，其成員厄洛替尼是目前晚期肺腺癌患者的一線用藥[3]，但獲得性耐藥的發(fā)生極大地限制了其臨床療效[4]，因此，明確影響EGFR-TKI類藥物抵抗發(fā)生的關(guān)鍵因素成為亟待解決的問題。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）作為機(jī)體重要的表觀遺傳調(diào)控分子群，參與影響細(xì)胞EGFR-TKI的敏感性[5]。近年有研究指出，姜黃素在EGFR-TKI類藥物治療肺癌的過程中可能發(fā)揮著積極作用[6]，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步明確。本研究以EGFR敏感性突變的肺癌細(xì)胞株P(guān)C9為體外模型，探究姜黃素對(duì)肺癌相關(guān)LncRNA表達(dá)的影響及其與細(xì)胞TKI藥物敏感性的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞分組 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞包括非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）EGFR突變PC9細(xì)胞株（PC9 WT）和PC9厄洛替尼抵抗細(xì)胞株（PC9 ER）。培養(yǎng)環(huán)境：5% CO2，37 ℃，濕度100%。

細(xì)胞分組：將PC9 WT細(xì)胞分為對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組，將PC9 ER細(xì)胞分為抵抗組及處理組。在450 mL RPMI-1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）中加入10%胎牛血清（50 mL，美國(guó)Gibco公司）及10 μmoL姜黃素（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）或等體積0.9%氯化鈉溶液作為細(xì)胞培養(yǎng)液備用，實(shí)驗(yàn)組及處理組采用含20 μmol·L-1姜黃素（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）的RPMI-1640培養(yǎng)液（美國(guó)Gibco公司）培養(yǎng)，對(duì)照組及抵抗組采用含等體積0.9%氯化鈉溶液的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)72 h[7]。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）實(shí)驗(yàn) 設(shè)計(jì)并合成LncRNA MALAT1、LSINCT5、UCA1、HOTAIR、GAS5及H19的qPCR引物（上海生工生物工程公司），引物序列如表1所示。各組細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，待細(xì)胞融合度＞80%，TRIzoL（日本Takara公司）抽提細(xì)胞總RNA，30～50 μL無(wú)核酶水稀釋（美國(guó)Invitrogen公司），Nanodrop2000（美國(guó)Thermo公司）檢測(cè)總RNA濃度，均取1 μg進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件根據(jù)試劑盒（美國(guó)Promega公司）進(jìn)行設(shè)置，F(xiàn)astStart Universal SYBR Green（美國(guó)Roche公司）核酸熒光染料檢測(cè)各組細(xì)胞中待測(cè)LncRNA的CT值，以β-actin為內(nèi)參基因，ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)（美國(guó)Applied Biosystems公司）進(jìn)行熒光信號(hào)累積分析，采用2-△△CT法計(jì)算各LncRNA的表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.3 CCK-8實(shí)驗(yàn) 在10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)各組細(xì)胞，消化離心后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1×103個(gè)/孔接種至96孔板中，設(shè)置6個(gè)厄洛替尼濃度梯度，分別為0、0.01、0.1、1、10、100、1 000 μmol·L-1，同時(shí)每組細(xì)胞每個(gè)濃度梯度設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔，接種細(xì)胞后24 h采用梯度濃度厄洛替尼處理細(xì)胞24 h，4 ℃取出CCK-8試劑與RPMI-1640+10% FBS培養(yǎng)液1:9混合均勻，替代含厄洛替尼的培養(yǎng)基，5% CO2，37 ℃避光孵育2 h，多孔酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad）檢測(cè)細(xì)胞450 nm處OD值，空白孔調(diào)零，以各組細(xì)胞0 μmol·L-1厄洛替尼處理下的相對(duì)OD值作為100%參照，計(jì)算不同濃度下各細(xì)胞系相對(duì)細(xì)胞活力的百分?jǐn)?shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s 表示，多組間比較采用方差分析，SNK-q 檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，厄洛替尼半數(shù)抑制濃度（semi-inhibitory concentrations，IC50）以細(xì)胞各濃度梯度的相對(duì)細(xì)胞活力繪制擬合曲線來(lái)計(jì)算。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞肺癌相關(guān)LncRNA的表達(dá)比較 相比對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組MALAT1、LSINCT5、HOTAIR及H19表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），UCA1及GAS5的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而抵抗組及處理組各LncRNA均顯著增高（P＜0.05）；相比抵抗組，處理組LncRNA MALAT1、LSINCT5、HOTAIR、GAS5及H19表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）。見表2。

2.2 對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞厄洛替尼IC50比較 對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞以0 μmol·L-1厄洛替尼處理下的相對(duì)OD值作為存活率100%，繪制0、0.01、0.1、1、10、100及1 000 μmol·L-1濃度下，以細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)的擬合曲線，通過擬合曲線計(jì)算生成相應(yīng)的厄洛替尼IC50，結(jié)果顯示，對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組、抵抗組及處理組細(xì)胞厄洛替尼IC50分別為0.416±0.030、0.375±0.058、8.159±0.602、3.167±0.283 μmol·L-1，相比對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組厄洛替尼IC50 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而抵抗組及處理組IC50均顯著增高（P＜0.05）；相比抵抗組，處理細(xì)胞IC50顯著降低（P＜0.05）。見圖1。

表2 各組細(xì)胞中肺癌相關(guān)LncRNA的表達(dá)比較

圖1 不同濃度厄洛替尼對(duì)細(xì)胞存活率影響的擬合曲線

3 討論

肺癌是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的主要原因，多數(shù)肺癌患者初診時(shí)已處于中晚期，導(dǎo)致患者5年生存率低至4%～17%[8]，靶向藥物的開發(fā)顯著延長(zhǎng)了患者的總體生存時(shí)間，但絕大多數(shù)仍在8～12個(gè)月時(shí)發(fā)生耐藥[9]。姜黃素是一種存在于植物組織中的二酮類化合物，作為天然色素被廣泛應(yīng)用于食品及醫(yī)藥行業(yè)，而其藥用價(jià)值包括降低血脂、抑制炎癥、對(duì)抗氧化應(yīng)激及抑制腫瘤等[10]。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)顯示，姜黃素可在多水平、多角度抑制肺癌的發(fā)生發(fā)展：姜黃素通過下調(diào)Wnt/β-catenin通路活性，抑制肺癌的干細(xì)胞表型[11]，并可優(yōu)先促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中活性氧產(chǎn)物的生成，通過STAT3途徑介導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞及相應(yīng)順鉑耐藥細(xì)胞的凋亡[12-13]；姜黃素還可通過RAC1依賴途徑及PI3K/Akt通路抑制肺癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移[14-15]。近年有研究指出，姜黃素對(duì)肺癌細(xì)胞具有潛在的EGFR-TKI增敏作用：CHEN等[6]發(fā)現(xiàn)姜黃素可通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，克服肺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼的原發(fā)性耐藥；DAI等[16]及LI等[17]研究顯示姜黃素類似物可下調(diào)肺癌細(xì)胞EGFR表達(dá)并抑制其磷酸化，增加厄洛替尼對(duì)其耐藥細(xì)胞的敏感性，同時(shí)介導(dǎo)厄洛替尼耐藥細(xì)胞的凋亡。

LncRNAs作為機(jī)體內(nèi)重要的表觀調(diào)控分子，同樣被發(fā)現(xiàn)參與肺癌細(xì)胞EGFR-TKI抵抗的形成，包括LncRNA MALAT1、UCA1、HOTAIR、GAS5及H19可通過多種途徑影響肺癌細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI的敏感性[18-22]，而姜黃素也對(duì)多種LncRNA存在調(diào)控作用，包括PVT1、lincROR及MEG3等[23-25]，提示姜黃素可能通過影響LncRNA的表達(dá)，發(fā)揮肺癌細(xì)胞EGFR-TKI的增敏作用。

本研究通過文獻(xiàn)檢索，選取與肺癌細(xì)胞EGFRTKI敏感性有關(guān)的LncRNA，包括MALAT1、UCA1、HOTAIR、GAS5及H19作為研究對(duì)象，同時(shí)，通過生物信息學(xué)網(wǎng)站（http://annolnc.cbi.pku.edu.cn/）分析發(fā)現(xiàn)LSINCT5[26]作為EGFR潛在的調(diào)控分子，可能在肺癌細(xì)胞EGFR-TKI抵抗的形成中發(fā)揮作用，也作為本研究的檢測(cè)對(duì)象。本研究結(jié)果顯示，姜黃素可顯著下調(diào)PC9親本細(xì)胞中LncRNA MALAT1、LSINCT5、HOTAIR及H19的表達(dá)，提示其可能對(duì)多種肺癌相關(guān)LncRNA存在廣譜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，但對(duì)野生型PC9細(xì)胞EGFR-TKI敏感性無(wú)顯著影響，推測(cè)可能由于野生型細(xì)胞中EGFR-TKI抵抗的相關(guān)通路處于未激活狀態(tài)，故姜黃素對(duì)其IC50無(wú)顯著影響。同時(shí)，我們?cè)贓GFR-TKI抵抗的PC9細(xì)胞中驗(yàn)證了MALAT1、UCA1、HOTAIR、GAS5及H19的高表達(dá)狀態(tài)，并發(fā)現(xiàn)LSINCT5同樣高表達(dá)于抵抗細(xì)胞，這表明LSINCT5也可能作為促進(jìn)因子在肺癌細(xì)胞EGFR-TKI抵抗的形成中發(fā)揮作用，進(jìn)而采用姜黃素處理抵抗細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，MALAT1、LSINCT5、HOTAIR、GAS5及H19表達(dá)均顯著降低，同時(shí)細(xì)胞EGFR-TKI敏感性顯著增高，表明姜黃素可顯著抑制多種EGFR-TKI抵抗相關(guān)LncRNA的表達(dá)，并部分逆轉(zhuǎn)細(xì)胞EGFR-TKI抵抗能力，值得一提的是，本研究發(fā)現(xiàn)LSINCT5基因表達(dá)在厄洛替尼抵抗細(xì)胞中的顯著差異，且對(duì)姜黃素處理反應(yīng)敏感。在接下來(lái)的研究中，我們將通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及分子生物技術(shù)等手段，闡明姜黃素對(duì)多種LncRNA的調(diào)控機(jī)制，并明確LSINCT5與肺癌EGFR-TKI敏感性的確切關(guān)系，為相關(guān)輔助藥物及聯(lián)用靶向藥物的開發(fā)提供新的依據(jù)。