‘黔藿1 號’在不同種植區(qū)的質(zhì)量穩(wěn)定性評價研究

雷榮，汪永平，晏凱，劉紅昌，3※

（1.貴州大學農(nóng)學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州貴基生物醫(yī)藥有限公司，貴州 從江 557400；3.貴州省藥用植物繁育與種植重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

淫羊藿始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，作為藥材已有2 000多年的歷史，是中國最為悠久的中藥材之一[1]，歷代本草及苗醫(yī)藥文獻均有記載[2]，2020 版《中國藥典》記載其基源植物為箭葉淫羊藿[Epimedium sagittatum(Sieb.etZucc.) Maxim.]、淫羊藿（E.breviconu Maxim.）、柔毛淫羊藿（E.pubescens Maxim.）和朝鮮淫羊藿（E.koreanum Nakai.）[3]。淫羊藿以干燥葉入藥，性溫、味辛、甘，歸肝、腎經(jīng)，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕的功效，常用于治療腎陽虛衰、陽痿遺精、筋骨痿軟、風濕痹痛及麻木拘攣等病癥[4]，并且對于增強心臟功能和抗腫瘤方面也具有一定療效[5,6]。

淫羊藿為多基源藥材，在我國淫羊藿種質(zhì)資源有45 種[7]，屬于品種多、主產(chǎn)區(qū)種類復雜、性狀難以鑒別的藥材[8,9]。不同基源淫羊藿藥材化學組成和主要黃酮類成分含量相差較大，現(xiàn)有文獻報道多針對某一種淫羊藿不同部位指紋圖譜或主要黃酮類成分進行分析[10]，而同一種淫羊藿藥材在不同種植區(qū)質(zhì)量變化鮮有報道。本試驗以箭葉淫羊藿優(yōu)良品種‘黔藿1 號’為材料，研究其在不同種植區(qū)的質(zhì)量變化，為其適宜種植區(qū)的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為貴州貴基生物醫(yī)藥有限公司自育箭葉淫羊藿優(yōu)良品種‘黔藿1 號’，經(jīng)貴州大學植物鑒定中心鑒定為小檗科（Berberidaceae）淫羊藿屬（Epimedium）植物箭葉淫羊藿[Epimedium sagittatum(Sieb.etZucc.)Maxim.]，于2017 年種植于貴州省遵義市新蒲新區(qū)喇叭鎮(zhèn)（S1）、湖南省邵陽市新寧縣萬塘鄉(xiāng)（S2）、安徽省宿州市埇橋區(qū)夾溝鎮(zhèn)（S3）、安徽省合肥市瑤海區(qū)（S4）和河南省南陽市高新區(qū)（S5），見表1。

表1 ‘黔藿1 號’不同種植區(qū)環(huán)境參數(shù)Table 1 Environmental parameters of different planting areas of‘Qianhuo No.1’

主要儀器有高效液相色譜儀（Agilent 1260 infinity）、紫外可見分光光度計（T6 新世紀）、電子天平（AR224CN）、箱式電阻爐（SX-5-12）、超聲波清洗機（SB-5200DT）和數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-6）等。

主要試劑有朝藿定A、朝藿定B 對照品（批號：110623-72-8、110623-73-9，質(zhì)量分數(shù)＞98%，大連美侖生物技術(shù)有限公司）；朝藿定C 對照品（批號：111780-201804，質(zhì)量分數(shù)92.6%，中國食品藥品檢定研究院）、淫羊藿苷對照品（批號：110737-201516，質(zhì)量分數(shù)94.2%，中國食品藥品檢定研究院）；色譜級甲醇、乙腈（質(zhì)量分數(shù)≥99.9%）；AR 級甲醇、AR 級乙醇。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 樣品于2019 年11 月上旬采收，洗凈，晾干，于105 ℃下殺青15 min 后置于55 ℃烘箱內(nèi)烘至恒重，粉碎，過3 號篩，置于干燥器中保存。

1.2.2 總灰分測定 參照2015 版《中國藥典》四部（通則2302）進行測定。

1.2.3 浸出物測定 參照2015 版《中國藥典》四部醇溶性浸出物測定法（通則2201）項下的冷浸法測定。

1.2.4 朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 及淫羊藿苷含量測定 HPLC 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18色譜柱250 mm 4.6 mm 5m；流動相：乙腈-水（30：70）；檢測波長：270 nm；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：5L。

供試品溶液制備：參照2015 版《中國藥典》四部，稱取0.200 0 g 樣品置于具塞三角瓶中，加入20 mL 50%乙醇，稱定重量，超聲處理1 h，再稱定重量，用50%的乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取濾液，即得。

對照品溶液制備：分別稱取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 和淫羊藿苷0.02 g、0.005 g、0.05 g 和0.005 g，加甲醇溶解，定容至10 mL 即可。朝藿定A、朝藿定B和淫羊藿苷使用前稀釋10 倍。

1.2.5 總黃酮含量測定 供試品溶液制備：取1.2.4 項下的供試品溶液稀釋100 倍即可。

對照品溶液制備：精密稱定淫羊藿苷對照品適量，加甲醇制成含淫羊藿苷20g/mL 的溶液，即得。

1.3 方法學考察

1.3.1 線性關(guān)系考察 以朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 和淫羊藿苷峰面積為縱坐標（y），對照品溶液進樣量（L）為橫坐標（x），考察線性關(guān)系。回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)為朝藿定A: y=252.51x+18.273，0.02～3.2g，R=0.9999；朝藿定B: y=132.92x-4.0069，0.005～0.8g，R=0.9997；朝藿定C: y=567.87x-1.935，0.1～5.5g，R=1；淫 羊 藿 苷: y=356.46x-6.0903，0.005～0.45g，R=1；結(jié)果表明朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 和淫羊藿苷分別在上述范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以總黃酮吸光度為縱坐標（y），淫羊藿苷濃度為橫坐標（x），考察線性關(guān)系?；貧w方程及相關(guān)系數(shù)為：y=0.0058x+0.0009, R=0.9997，結(jié)果表明總黃酮在0～20g/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見圖1。

圖1 朝藿定A、B、C、淫羊藿苷及總黃酮標準曲線Fig.1 Standard curve of epimedin A,B,C,icariin and total flavonoids

圖2 精密度試驗色譜圖Fig.2 Chromatogram of precision test

1.2.4 項條件連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積。朝藿定A平均峰面積為129.97，RSD 0.41%；朝藿定B 平均峰面積為145.62，RSD 0.84%；朝藿定C平均峰面積為4 853.65，RSD0.64%；淫羊藿苷平均峰面積為2 420.9，RSD0.17%。表明儀器精密性良好，見圖2。

1.3.5 加樣回收試驗 取5 份已知朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 及淫羊藿苷含量的供試品溶液1 mL，分別加入0.1 mL 0.2 mg/mL 的朝藿定A 對照品溶液、0.4 mL 0.05 mg/mL 的朝藿定B 對照品溶液、0.5 mL 0.5 mg/mL 的朝藿定C 對照品溶液、1 mL 0.05 mg/mL的淫羊藿苷對照品溶液，分別進樣并記錄峰面積，計算朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 及淫羊藿苷平均回收率分別為100.22%、100.34%、100.09%和100.57%，RSD分別為0.45%、0.39%、0.08%和1.09%，表明該試驗的加樣回收率良好，見表2。

表2 加樣回收測定結(jié)果Table 2 Determination results of sample recovery

續(xù)表2

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種植區(qū)‘黔藿1號’總灰分、浸出物和總黃酮含量比較

不同種植區(qū)‘黔藿1 號’藥材中總灰分質(zhì)量分數(shù)為6.35～8.99%，CV 為14.80，表明總灰分含量差異較大，以S2 和S3 中總灰分的含量較低，分別是6.37%和6.35%，S5 總灰分含量最高（8.99%），S5 與S1、S2、S3、S4 存在顯著差異，S4 與S2、S3 存在顯著差異，與S1 無顯著差異，S2 與S3 之間無顯著差異。不同種植區(qū)‘黔藿1 號’藥材浸出物CV 為7.19%，其含量存在差異，以S5 中浸出物的含量最低（34.00%），S2 與S3含量最高，均為38.67%，S1、S2、S3 和S4 4 個種植區(qū)的含量無顯著差異。不同種植區(qū)‘黔藿1 號’藥材中總黃酮質(zhì)量分數(shù)為9.07～12.48%，CV為11.68%，其含量存在差異，以S5 中總黃酮含量最低，S1 中最高，S1、S2、S3 和S4 4 個種植區(qū)之間無差異顯著，與S5 存在顯著差異，見表3。‘黔藿1 號’藥材隨著種植區(qū)海拔、降雨量和無霜期的變化，其灰分、浸出物和總黃酮含量均為未表現(xiàn)出規(guī)律性變化，表明受種植區(qū)域小氣候及土壤等因子的綜合影響較大。

表3 不同種植區(qū)‘黔藿1 號’總灰分、浸出物和總黃酮含量比較Table 3 Comparison of the contents of total ash,extract and total flavonoids of‘Qianhuo No.1’in different ecological planting areas （%）

2.2 不同種植區(qū)‘黔藿1號’中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷含量分析

‘黔藿1 號’在不同種植區(qū)朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 和淫羊藿苷含量存在差異，CV 分別為24.64%、12.50%、10.18%和12.83%。朝藿定A 和朝藿定B質(zhì)量分數(shù)分別為0.07%～0.12%和0.07%～0.09%，S2、S4 中朝藿定A、朝藿定B 含量最低均為0.07%，S3 中朝藿定A和朝藿定B含量為最高，分別為0.12%和0.09%。S4 中朝藿定C 含量最低（5.87%），S3 中含量最高（7.76%），S4 與S1、S3、S5 之間存在顯著差異，與S2 之間無顯著差異。S2 和S4 兩個種植區(qū)淫羊藿苷含量最低，均為0.42%，在S1 中淫羊藿苷含量最高（0.55%），與S3 無顯著差異，但顯著高于其它種植區(qū)，見表4。‘黔藿1 號’藥材朝藿定C 含量隨著種植區(qū)海拔的升高而增加；朝藿定A 和朝藿定B 含量隨著降雨量的增加有所下降。淫羊藿苷含量隨著種植區(qū)海拔、降雨量和無霜期的變化，均為未表現(xiàn)出規(guī)律性變化。綜上分析，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 及淫羊藿苷含量受種植區(qū)域環(huán)境因素影響較大。

表4 不同種植區(qū)‘黔藿1 號’四種成分含量分析Table 4 Content analysis of four components in Qianhuo No.1 from different ecological planting areas （%）

3 討論

本研究測定箭葉淫羊藿優(yōu)良品種‘黔藿1 號’的相關(guān)質(zhì)量指標含量，研究結(jié)果表明，不同種植區(qū)‘黔藿1 號’藥材中總灰分、浸出物、總黃酮、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 及淫羊藿苷含量變異系數(shù)（CV）分別為14.80%、7.19%、11.68%、24.64%、12.50%、10.18%和12.83%，其中浸出物含量變異最小，朝藿定A 含量變異較大，這與孫夢杰等[11]的研究結(jié)果一致。2020 年版《中國藥典》規(guī)定淫羊藿灰分不得高于8.0%、浸出物含量不得低于15.0%、總黃酮含量不得低于5.0%及總黃酮醇苷不得低于1.50%，而所有樣品中浸出物和總黃酮的含量遠高于2020 年版《中國藥典》規(guī)定，河南南陽高新區(qū)種植區(qū)‘黔藿1 號’藥材總灰分含量較高，超過2020 版《中國藥典》規(guī)定，其余4 個種植區(qū)均符合2020 版《中國藥典》規(guī)定。淫羊藿苷含量是淫羊藿藥材質(zhì)量是否達標的主要衡量指標[12]，所有樣品均達到2020版《中國藥典》規(guī)定，但貴州遵義新蒲新區(qū)喇叭鎮(zhèn)和安徽省宿州市埇橋區(qū)夾溝鎮(zhèn)2 個種植區(qū)質(zhì)量較佳。本研究發(fā)現(xiàn)‘黔藿1 號’藥材中朝藿定C 含量隨著種植區(qū)海拔的升高而增加；朝藿定A 和朝藿定B 含量隨著降雨量的增加有所下降，這也印證了秦偉瀚等[13]的觀點，淫羊藿藥材成分含量變化，不僅與海拔有關(guān)，還與當?shù)氐臍夂颉⑼寥兰安墒諘r間等諸多因素相關(guān)。本研究測定了‘黔藿1 號’在不同種植區(qū)的質(zhì)量變化，可為其適宜種植區(qū)篩選、規(guī)范化種植提供參考。