稀有人參皂苷微生物轉(zhuǎn)化研究進展

章沙沙，張海玲，葉靜，徐健峰※

(1.盤錦檢驗檢測中心，遼寧 盤錦 124010；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112)

人參作為我國一種傳統(tǒng)的中藥已使用了2 000 多年，被譽為“百草之王”，由于其獨特的藥理活性而在世界范圍內(nèi)廣泛使用[1,2]。我國是人參種植大國，但我國人參產(chǎn)品品種十分有限，產(chǎn)品優(yōu)勢明顯落后于日韓等國家。人參皂苷是人參中的主要活性物質(zhì)，具有獨特的生物學(xué)活性和藥用價值。人參皂苷的生物活性包括抗癌[3,4]、抗老化、抗炎[5]、抗過敏[6]、抗糖尿病[7]、抗高血脂[8]、抗疲勞和抗氧化活性[9]，并且還可以促進DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成。人參皂苷作為人參質(zhì)量評估的關(guān)鍵指標(biāo)，在不同人參中的分布有所不同。目前，從人參或三七等中藥中分離并鑒定出的人參皂苷有100 余種，其中人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf 和Rg1 占總?cè)藚⒃碥盏?0%以上，通常被認為是主要的人參皂苷[10,11]。研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的次級代謝產(chǎn)物具有更強的生物活性，這種次級代謝產(chǎn)物稱之為稀有人參皂苷[12]。稀有人參皂苷F1、F2、Rg3、Rh1、Rh2、Rh3、CY、CM 和CK 在人參中的含量極少，人體胃腸道對主要人參皂苷的吸收非常差，而稀有人參皂苷更容易被人體吸收并發(fā)揮作用。現(xiàn)已證明稀有人參皂苷具有更好的藥理活性，是癌癥治療的潛在候選藥物[13]。目前，從人參等中藥中提取的稀有人參皂苷產(chǎn)量低，不能滿足市場需求，限制了其開發(fā)和應(yīng)用，因此，通過轉(zhuǎn)化主要人參皂苷來制備稀有人參皂苷具有非常重要的意義。人參皂苷可以通過酸水解、堿水解、微生物法和酶解法轉(zhuǎn)化成為具有藥物活性的稀有人參皂苷[14-16]。在這些方法中，由于微生物轉(zhuǎn)化法具有高特異性和高產(chǎn)率，被認為是制備稀有人參皂苷的最有效途徑之一[17-19]。

微生物轉(zhuǎn)化法是利用微生物細胞分解釋放一種或多種酶，定向水解人參皂苷從而獲得稀有人參皂苷的過程。微生物轉(zhuǎn)化過程中會產(chǎn)生各種酶，包括 -葡萄糖苷酶、-半乳糖苷酶和 -阿拉伯呋喃糖苷酶，這些酶可通過在C-3，C-6 和C-20 處切開糖基部分來轉(zhuǎn)化人參皂苷[7]。微生物轉(zhuǎn)化法具有物理或化學(xué)方法難以實現(xiàn)的優(yōu)點，相較與其他轉(zhuǎn)化方法生產(chǎn)成本低、周期短、副產(chǎn)物少，而且產(chǎn)物更安全。近年來，關(guān)于微生物轉(zhuǎn)化稀有人參皂苷的研究已取得了一些顯著的研究成果[20-22]。本文綜述了不同微生物轉(zhuǎn)化稀有人參皂苷的最新研究進展，為研究稀有人參皂苷的制備提供參考依據(jù)。表1 為近年來將人參皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷的微生物種類、反應(yīng)條件及生成產(chǎn)物等情況。

表1 微生物轉(zhuǎn)化稀有人參皂苷Table 1 Ginsenosides transformation by hydrolyzing in ginsenosides using microbial

1 食用微生物轉(zhuǎn)化稀有人參皂苷

隨著人們對食品安全重視程度的不斷加強，從食品中分離出的微生物在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用前景越發(fā)廣闊。目前大多數(shù)用于人參皂苷轉(zhuǎn)化的微生物對于食品消費和藥物開發(fā)可能并不安全。為了將微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的人參皂苷安全地應(yīng)用于食品，需要使用食品級的微生物。食品微生物對Rb1 和Re 的轉(zhuǎn)化途徑如下：Rb1→Rd 和F→CK，Rb1→Rd 和F2→Rh2，Rb1→Rd→F2，Re→Rg2→Rh1，Re→Rg1→Rh1。人參皂苷Rb2 和Rc 同樣可以被食物微生物轉(zhuǎn)化。Rb2 和Rc 的轉(zhuǎn)化途徑如下：Rb2 和Rc→Rd→F2→Rh2 或CK，Rb2→CO→CY→CK，Rc→MC→CK[23]。表2 為人參皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷的常見食品微生物種類。

表2 常見轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷的食品微生物種類Table 2 The common food microorganisms transformed into rare ginsenosides

稀有人參皂苷CK（Compound K）是營養(yǎng)補品、化妝品和傳統(tǒng)藥物中必不可少的成分，具有抗動脈硬化、抗癌和保護神經(jīng)等多種生物活性[24,25]。韓國在人參皂苷轉(zhuǎn)化方面的研究工作居世界領(lǐng)先地位，Yoo J M[26]利用從泡菜中分離出來的短乳桿菌FR-B 發(fā)酵人參細根，經(jīng)5 d 發(fā)酵后產(chǎn)生大量的稀有人參皂苷CK，由此表明短乳桿菌FR-B 是較好的微生物轉(zhuǎn)化用食用菌。Palaniyandi等[27]使用人參粗提物篩選出副干酪乳桿菌MJM60396，將Rb1 與MJM60396 一起溫育，可轉(zhuǎn)化生成Rg3 和Rh2。菌株MJM60396 有潛力作為保健食品用于制備Rg3 和Rh2。韓國泡菜世界研究所研究員Park B 等[28]從泡菜中分離出的5 株乳酸菌（明串珠菌WiKim19、戊糖片球菌WiKim20、短乳桿菌WiKim17、乳明串珠菌WiKim48 和櫻乳桿菌WiKim49）可將Rb1轉(zhuǎn)化為Rg3。實驗結(jié)果表明，微生物轉(zhuǎn)化人參皂苷與酶活性和環(huán)境條件如有機酸的產(chǎn)生有關(guān)。稀有人參皂苷的抗氧化活性和抗炎作用可增強皮膚的抗衰老作用[29]。Bak M J 等[30]利用釀酒酵母發(fā)酵黑人參FBG，發(fā)現(xiàn)FBG 具有多種生物活性，包含人參總皂苷1.440g/mL、Rg2 2.86g/mL、Rg3 24.52g/mL、Rh1 12.64g/mL、Rh2 0.63g/mL 和Rf 1.32g/mL。Park E S 等[31]利用FBG 發(fā)酵生成的產(chǎn)物作用于人皮膚成纖維細胞HS68，結(jié)果證實FBG 具有潛在的抗氧化活性，可作為化妝品抗皺的有效成分。Cui C 等[32]利用食品級GRAS 菌株谷氨酸棒桿菌ATCC13032 表達重組-葡萄糖苷酶MT619，同時使用纖維素作為固定材料，以提高CK和F1 的生產(chǎn)效率。Liu Z 等[33]通過高效液相色譜-電噴霧電離質(zhì)譜分析篩選了24 種可食用和藥用蘑菇的微生物，可將PPD 型人參皂甙（Rb1、Rc、Rb2 和Rd）轉(zhuǎn)化為稀有人參皂甙（F2、CO、CY、CMc1、CMc 和CK）的強大能力，這是食用和藥用蘑菇發(fā)酵將主要人參皂苷生物轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷的第一個報道，同時也證明了食用蘑菇是獲得稀有人參皂苷的潛在食品微生物。

2 腸道細菌轉(zhuǎn)化稀有人參皂苷

人和動物的腸道細菌包括擬桿菌、（短）雙歧桿菌、梭形桿菌屬、德氏乳桿菌和明串珠菌等，因其在人參皂苷轉(zhuǎn)化中的潛力而備受關(guān)注。由于腸道細菌可以代謝經(jīng)口攝入的人參皂苷，因此可以安全地用于多種食品和藥品中。許多研究人員研究了腸道菌群體內(nèi)人參皂苷的代謝，Niu T 等[34]研究了腸道微生物中細菌將紅參提取物中的人參皂甙轉(zhuǎn)化稀有人參皂甙的能力。他們利用小鼠肺癌LM1 細胞測試了稀有人參皂甙的抗增殖活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A/J 小鼠在口服Rb1 后血液中產(chǎn)生大量稀有人參皂苷F2 和CK，且CK 的抗增殖活性和通透性高于其他人參皂苷，由于哺乳動物細胞不水解人參皂苷，因此可以確定是腸道中的細菌水解了人參皂苷，并發(fā)現(xiàn)Rb1 逐步水解為Rd，Rd形成F2 是Rb1向CK 生物轉(zhuǎn)化的過程。Shan Y 等[35]從人糞便中克隆了BlBG3，一種來自長雙歧桿菌的GH3 -葡萄糖苷酶。并發(fā)現(xiàn)BlBG3 比其他微生物-葡萄糖苷酶以更高的效率催化糖苷呋喃甾醇和Rb1 的水解。與D-葡萄糖復(fù)合的BlBG3 的結(jié)構(gòu)分析顯示了其3 個獨特的環(huán)，形成了一個深口袋并參與底物結(jié)合，為人參皂苷用于醫(yī)藥和食品工業(yè)提供理論基礎(chǔ)。Jung I H[36]測定了148 份人糞便樣品中Rb1 的代謝活性，并從一株長雙歧桿菌H-1 中克隆了編碼 -D-葡萄糖苷酶（BglX）的基因，能將Rb1 轉(zhuǎn)化為CK，這一研究結(jié)果為新型抗腫瘤藥物的研究和開發(fā)提供有用的信息。Shen H等[37]通過健康人的腸道細菌樣品進行厭氧孵育來研究腸道細菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物和模擬胃液內(nèi)環(huán)境分析Rb1 的降解過程，研究發(fā)現(xiàn)，Rb1會產(chǎn)生5 種代謝產(chǎn)物，即Rd、F2、CK、絞股藍皂苷XVII和絞股藍皂苷LXXV。Rb1 對酸高度不穩(wěn)定，并迅速降解形成F2、Rg3、Rh2 和CK，但在模擬胃液中未生成絞股藍皂苷。絞股藍總皂甙的形成可能是由于腸道細菌介導(dǎo)的酶促參與。本實驗室從反芻動物的血液、腸道和糞便等組織中分離出5 株纖維素酶活較高的細菌，經(jīng)鑒定為纖維微細菌屬（Cellulosimicrobium sp.），通過薄層層析和高效液相色譜分析發(fā)現(xiàn)，5 株菌具有很高的人參皂苷轉(zhuǎn)化活性，前期實驗結(jié)果顯示可將Rb1轉(zhuǎn)化為Rd、GypXVII、F2、Rg3、Rh2和CK[38]。

3 內(nèi)生菌轉(zhuǎn)化稀有人參皂苷

內(nèi)生菌是指在生活史的某一階段或全部階段生活在健康植物的各種器官或組織內(nèi)部的微生物，包括內(nèi)生細菌、內(nèi)生真菌和內(nèi)生放線菌[39]。Lei C等[40]從桔梗中分離出69 種內(nèi)生菌，其中有32 種產(chǎn)生-葡萄糖苷酶的內(nèi)生菌，內(nèi)生菌藤黃色桿菌JG09 能有效地轉(zhuǎn)化人參皂苷為稀有人參皂苷。例如，JG09 可以將人參皂苷Rb1、Rb2、Rc 和Rd 轉(zhuǎn)化為人參皂苷F2 和CK，并將Rg1 轉(zhuǎn)化為Rh1。轉(zhuǎn)化人參皂苷F2 和CK 的最高生產(chǎn)率分別達到94.53%和66.34%。實驗表明JG09 是獲得稀有人參皂苷CK 和F2 潛在的微生物來源。Nan W等[41]從植物中分離出釀酒酵母WLT-MVA5，通過誘導(dǎo)表達“人參”基因PGM2、UGP1 和UGT1WLT-MVA5，經(jīng)酶催化將原人參二醇合成CK的轉(zhuǎn)化率達到64.23%，同時添加甘油優(yōu)化發(fā)酵條件，使得CK 產(chǎn)量增加到384.52 mg/L。稀有人參皂苷Rg3 和Rh2 具有較好的藥理活性和市場需求，已引起了越來越多學(xué)者的關(guān)注[42]。Fu Y 等[43]從人參中分離出10 種產(chǎn)生 -葡萄糖苷酶的內(nèi)生細菌，其中內(nèi)生細菌洋蔥伯克霍爾德菌GE17-7具有較高的水解活性，可將Rb1 和Rd 轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷Rg3。GE17-7 代謝轉(zhuǎn)化途徑為Rb1→Rd→Rg3。最佳培養(yǎng)條件為pH 7.0、30°C 發(fā)酵15 h，Rg3 的最大轉(zhuǎn)化率為98%。將GE 17-7 應(yīng)用于新藥開發(fā)中用于制備人參皂苷Rg3 具有廣闊前景。兩年后Fu Y[44]又分離得到內(nèi)生細菌黃桿菌GE32，可將Rb1 轉(zhuǎn)化為Gyp-XVII 和Rg3，GE32 在制藥工業(yè)制備Rg3 中同樣具有潛力。韓國學(xué)者Yan H 等[45]從人參根組織中分離提取出81 種內(nèi)生細菌，其中農(nóng)桿菌PDA-2 生產(chǎn)稀有人參皂Rg3 和Rh2 的含量分別達到62.20 和18.60 mg/L。盡管大多數(shù)真菌在人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化中不能與土壤細菌和腸道菌群媲美，但冬蟲夏草作為一種珍貴的藥用真菌在人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化中具有很好的轉(zhuǎn)化效果。Wang WN 等[46]通過高效液相色譜/四極桿飛行時間質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)了冬蟲夏草的生物轉(zhuǎn)化途徑Rb1→Rd→F2→CK。冬蟲夏草轉(zhuǎn)化Rb1為CK的轉(zhuǎn)化率超過82%，制備的CK 純度超過91%。

4 土壤微生物轉(zhuǎn)化

從土壤中分離出的微生物包括真菌和細菌。真菌如藍色犁頭霉、直立頂孢霉、新月彎孢菌、鐮刀菌、根霉菌和擬青霉屬等；細菌如巨大芽孢桿菌、伯克霍爾德菌，間孢囊菌屬、微桿菌屬和鞘氨醇單胞菌等也已用于人參皂苷的轉(zhuǎn)化。土壤微生物因其在廉價的培養(yǎng)基中生長更快，因此比腸道細菌轉(zhuǎn)化人參皂苷更加經(jīng)濟實在，但由于某些土壤真菌具有毒素，因此只有土壤微生物被認定為是安全的情況下，才能將其應(yīng)用于食品或藥品工業(yè)中。Lin F等[47]從人參中分離出產(chǎn)生-葡萄糖苷酶的雜色曲霉菌株LFJ1403。LFJ1403通過水解C-20位的外部葡萄糖部分將Rb1 轉(zhuǎn)化為Rd。最佳生物轉(zhuǎn)化條件為37°C，pH5.0 和48 h，轉(zhuǎn)化率最高可達96%，工業(yè)化擴大實驗轉(zhuǎn)化率可達85%。楊淑欽等[48]選用纖維素降解菌PSW 和厭氧嗜熱纖維素分解細菌HCp，對人參皂苷進行轉(zhuǎn)化。通過薄層色譜和高效液相色譜檢測，發(fā)現(xiàn)并證實這2 株厭氧菌可以轉(zhuǎn)化產(chǎn)生CK。Cui C H 等[49]從人參栽培土壤細菌中分離了一株有效轉(zhuǎn)化絞股藍皂苷XVII 為LXXV 的微桿菌屬Gsoil 167，并研究了其對3 種癌細胞系（HeLa，B16 和MDAMB231）的體外抗癌作用，結(jié)果表明，絞股藍皂苷LXXV顯著降低了細胞活力，顯示出較強的抗癌作用。Li F 等[50]獲得了一種新型真菌突變體黑曲霉菌株TH-10a，TH-10a 可以有效地將Rb1 轉(zhuǎn)化Rd。通過高效液相色譜分析鑒定Rb1 的C20 位置去除外部葡萄糖殘基而生成的Rd。最佳培養(yǎng)條件為28℃、pH6 和48 h，獲得最高的轉(zhuǎn)化率86%。在最佳條件下處理72 h 后，TH-10a 可以耐受40 mg/mL 人參根提取物作為底物，生物轉(zhuǎn)化率達到60%。實驗表明，TH-10a作為一種新的人參皂苷Rd 轉(zhuǎn)化真菌，在制藥工業(yè)中具有潛在的實際應(yīng)用。

5 結(jié)語與展望

2000 年我國批準(zhǔn)稀有人參皂苷Rg3 為處方藥；2006年我國研發(fā)的稀有人參皂苷Rh2藥品批準(zhǔn)上市[12]。由于在中藥中稀有人參皂苷含量極低，并且我國目前缺乏批量生產(chǎn)稀有人參皂苷的專業(yè)技術(shù)，使得稀有人參皂苷研究僅限于基礎(chǔ)科研，限制了其在制藥和食品工業(yè)中的應(yīng)用[51]。物理和化學(xué)方法都不適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)人參皂苷，如酸水解法雖然能夠生產(chǎn)稀有人參皂苷，但反應(yīng)過程劇烈，且稀有人參皂苷轉(zhuǎn)化率并不高。堿水解法獲得稀有人參皂苷對pH、壓力和溫度等條件要求非常苛刻，而微生物轉(zhuǎn)化在人參皂苷的轉(zhuǎn)化中具有明顯優(yōu)勢。微生物轉(zhuǎn)化法獲得稀有人參皂苷具有快速、方便、有效和無害化等優(yōu)點，因此成為轉(zhuǎn)化稀有人參皂苷最常用的方法。未來搶先具備產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)稀有人參皂苷的企業(yè)必將具有市場話語權(quán)。隨著科技的發(fā)展，通過設(shè)計組合微生物或幾種加工方法聯(lián)合使用轉(zhuǎn)化單體人參皂苷增加稀有人參皂苷的含量，對提高人參產(chǎn)品的食用和藥用價值具有重要意義。