半夏葉片開(kāi)放式組培體系初步建立

李欣，趙振軍，張建，郭麗紅，王迪，武彥芳

（1.長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025；2.宜賓學(xué)院川茶學(xué)院，四川 宜賓 644000）

半夏[Pinellia ternate (Thunb.) Breit]為大宗藥材，市場(chǎng)需求量大，人工栽培過(guò)程中存在繁殖系數(shù)較低、退化減產(chǎn)且優(yōu)質(zhì)種減少、病毒感染以及栽培技術(shù)不高等問(wèn)題，導(dǎo)致半夏產(chǎn)量不能滿(mǎn)足需求。其中無(wú)性繁殖的自繁留種更易導(dǎo)致帶病材料的累積，使后期病蟲(chóng)害暴發(fā)，影響半夏的品質(zhì)和產(chǎn)量，制約半夏產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。組織培養(yǎng)是快速增殖種苗的有效方式，再生植物具有發(fā)生數(shù)量多、培養(yǎng)周期短、結(jié)構(gòu)完整、成苗率高以及遺傳背景一致的特點(diǎn)。很多學(xué)者開(kāi)展過(guò)半夏的組織培養(yǎng)相關(guān)工作，并取得豐碩成果，建立了半夏完整的快繁體系[1-3]。傳統(tǒng)組培需要嚴(yán)格的無(wú)菌環(huán)境，需要一定的設(shè)備、器材和用具，同時(shí)還需要人工控制溫度、光照及濕度等培養(yǎng)條件，組培苗的成本相對(duì)較高，難以滿(mǎn)足栽培的需求，而開(kāi)放式組培較傳統(tǒng)組培脫離無(wú)菌的環(huán)境，通過(guò)抑菌素的添加達(dá)到抑制病原菌的增殖，從而避免培養(yǎng)基污染，達(dá)到省時(shí)省力、提高效益的目的。我國(guó)開(kāi)放式組培在香蕉[4]、切花菊‘白扇’[5]、馬鈴薯[6]、山丹丹[7]、藍(lán)莓[8]、相思[9]和甘蔗[10]等植物上取得一定成功，初步建立了開(kāi)放體系。日本在多種觀賞植物中已經(jīng)廣泛應(yīng)用開(kāi)放式組培，并取得很大進(jìn)展[11]。

因此，本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，以半夏葉片為材料，研究半夏開(kāi)放式組培技術(shù)，以進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本，建立高效再生的半夏開(kāi)放組培體系，滿(mǎn)足市場(chǎng)對(duì)種苗的需求。

1 材料和方法

1.1 材料

以長(zhǎng)江大學(xué)西校區(qū)栽培的桃葉型半夏為材料，取葉片為外植體，進(jìn)行半夏開(kāi)放式組培的相關(guān)研究。

1.2 方法

1.2.1 開(kāi)放式培養(yǎng)基的配置 用抗生素（頭孢克肟、鏈霉素）、抗菌劑（多菌靈、代森錳鋅）以及次氯酸鈉的不同濃度組合物作為抑菌劑，對(duì)培養(yǎng)基的質(zhì)量進(jìn)行觀察，放置15 d 后，統(tǒng)計(jì)污染率和外植體生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.2.2 外植體消毒方法 取半夏葉片，采用次氯酸鈉、酒精以及升汞消毒的組合，每個(gè)處理接種50 個(gè)外植體，1 周后統(tǒng)計(jì)葉片外植體的污染情況。

1.2.3 不同激素種類(lèi)和濃度對(duì)半夏葉片組培效果的研究 在1.2.1 和1.2.2 最佳處理的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)不同的TDZ濃度組合，MS+6-BA1.0+NAA0.2（CK）以及在對(duì)照中添加濃度為0.05、0.1、0.3 mg/L的TDZ，觀察葉片外植體愈傷組織誘導(dǎo)以及分化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抑菌劑組合對(duì)培養(yǎng)基效果的影響

不同抑菌組合對(duì)培養(yǎng)基效果的影響，見(jiàn)表1。

表1 不同抑菌劑組合對(duì)培養(yǎng)基效果的影響Table 1 Effects of different antibacterial combinations on the effect of the culture base

通過(guò)表1 可知，除7 號(hào)組合以外，其他組合均可達(dá)到控制培養(yǎng)基污染的效果，但接種外植體后污染率都有所上升，其中以2 號(hào)和3 號(hào)組合上升最明顯。1 號(hào)抑菌劑的使用濃度提高，雖然可以更好地控制培養(yǎng)基污染，但對(duì)外植體愈傷組織的產(chǎn)生和增殖的影響也相對(duì)提高。一旦外植體生理情況變差就極易導(dǎo)致半夏內(nèi)生菌的增殖，導(dǎo)致整個(gè)外植體受到污染。根據(jù)比較分析，設(shè)計(jì)組合中5 號(hào)和6 號(hào)的效果比較好，所用的抑菌劑濃度可以抑制培養(yǎng)基中的病原物，對(duì)外植體的影響也較小，但其中6 號(hào)外植體的愈傷組織增殖比5 號(hào)要快。因此，綜合考慮，培養(yǎng)基處理以6 號(hào)為宜。

2.2 不同外植體消毒方法對(duì)污染的影響

不同外植體消毒方法對(duì)污染的影響，見(jiàn)表2。

表2 不同外植體消毒方法對(duì)外植體污染的影響Table 2 Effects of different external plant disinfection methods on external plant contamination

通過(guò)表2 的結(jié)果分析，升汞的消毒效果較好，污染率較低，但隨著升汞處理時(shí)間的延長(zhǎng)，外植體的死亡率也逐漸加大。升汞有毒，容易造成環(huán)境污染，若無(wú)菌水沖洗不徹底，會(huì)造成外植體中毒死亡。次氯酸鈉處理時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)造成外植體死亡率的上升，但時(shí)間短，消毒效果又不理想。單獨(dú)使用酒精時(shí)，先用酒精潤(rùn)濕的紗布反復(fù)擦洗干凈，再用酒精浸泡攪拌45 s，污染率控制在30%左右。綜合分析，采用方法5 最好，雖然污染率高，但外植體的死亡率最低，且操作比較簡(jiǎn)單，對(duì)環(huán)境影響也較小，發(fā)現(xiàn)污染，及時(shí)去除，并不影響組培瓶中其它外植體的繼續(xù)發(fā)育。

2.3 不同激素濃度對(duì)半夏組培效果的影響

不同激素濃度對(duì)半夏組培效果的影響，見(jiàn)表3。

表3 TDZ 濃度對(duì)半夏組織培養(yǎng)的影響Table 3 Effect of TDZ Concentration on Tissue Culture of Finellia ternate

激素濃度在半夏愈傷組織誘導(dǎo)和分化中起著重要作用，在沒(méi)有添加激素TDZ 的組合中，6-BA 和NAA誘導(dǎo)出大量的愈傷組織，但不能進(jìn)行分化，需要轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基中進(jìn)行分化。添加TDZ 處理的組合，不需要進(jìn)行分化轉(zhuǎn)接，可直接從愈傷組織上分化出叢生芽。TDZ濃度對(duì)分化的效果有不同的影響，低濃度的TDZ有明顯的促進(jìn)作用，可直接在愈傷組織上分化出芽，不需要轉(zhuǎn)接分化；較高濃度的TDZ 會(huì)產(chǎn)生一定的抑制作用，導(dǎo)致愈傷組織出現(xiàn)褐化，從而影響叢生芽的質(zhì)量。

圖1 半夏開(kāi)放式組培的效果Fig.1 Effect of open tissue culture of Finellia ternate

在各處理中，半夏葉片的開(kāi)放式組培中的形態(tài)發(fā)生過(guò)程基本相似，葉片切口處產(chǎn)生愈傷組織，其中葉脈中的形成層最為活躍，最先產(chǎn)生愈傷組織并迅速增殖，其他部位產(chǎn)生愈傷組織較慢且增殖較慢（圖1-1），18 d左右，愈傷組織體積明顯增大，質(zhì)地緊密，白色（圖1-2）；1 個(gè)月左右，愈傷組織產(chǎn)生較多圓狀凸起，該結(jié)構(gòu)類(lèi)似珠芽的作用（圖1-3）且數(shù)量較多；45 d 左右，圓狀凸起變?yōu)榫G色，分化出芽（圖1-4），之后叢生芽快速生長(zhǎng)，產(chǎn)生大量叢生芽，并不斷有新的芽點(diǎn)產(chǎn)生（圖1-5）；之后，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，可產(chǎn)生不定根（圖1-6），不定根的數(shù)量與愈傷組織的體積呈正相關(guān)；在椰土中進(jìn)行煉苗移栽，生長(zhǎng)良好，由于愈傷組織不斷分化出芽，因此，叢生苗的特征較為明顯（圖1-7）。在培養(yǎng)過(guò)程中，由于培養(yǎng)條件的惡化，如高濕、缺氧，導(dǎo)致叢生芽生理狀態(tài)較差（圖1-8），難以進(jìn)一步增殖或分化，采用蛭石無(wú)糖培養(yǎng)，部分組培苗在老葉、葉柄枯萎后，可重新萌發(fā)出新葉，并產(chǎn)生根系，形成功能正常、形態(tài)正常的組培苗，降低污染造成的損失（圖1-9）。

3 討論

3.1 抑菌劑的選擇

葉片的消毒處理仍然存在一些問(wèn)題，如葉片存在一定污染率，主要是細(xì)菌污染，真菌污染控制較好。在抗生素的選擇方面，還需要進(jìn)一步的篩選。由于細(xì)菌種類(lèi)較多，單一的抗生素很難起到較為滿(mǎn)意的效果。在抑菌劑方面，前人做過(guò)較多的研究，并取得了較大的進(jìn)展。盧加舉等[12,13]對(duì)復(fù)合抑菌劑進(jìn)行了研究，并取得預(yù)期的抑菌效果。此外，部分植物精油含有殺菌、抗菌活性物質(zhì)，在抑菌劑方面有廣闊的應(yīng)用前景[14,15]，在避免抗生素的使用及降低成本方面具有一定的應(yīng)用潛力。抑菌劑對(duì)無(wú)菌苗的生長(zhǎng)有一定抑制[16]，但抑菌機(jī)理的相關(guān)研究尚不完善。

3.2 消毒方法

在外植體轉(zhuǎn)接過(guò)程中，由于外植體經(jīng)過(guò)酒精消毒，在轉(zhuǎn)接過(guò)程中，酒精可能未揮發(fā)完全，導(dǎo)致酒精持續(xù)對(duì)外植體葉片造成損傷，致使葉片生理狀態(tài)變差，從而導(dǎo)致死亡。待酒精揮發(fā)完全，可降低轉(zhuǎn)接的死亡率。在超凈工作臺(tái)操作，風(fēng)速可加快酒精的揮發(fā)，從而降低酒精對(duì)外植體的傷害。從污染情況來(lái)看，外植體消毒和接種應(yīng)在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，這樣可以避免外植體的感染，待外植體產(chǎn)生愈傷組織進(jìn)行增殖時(shí)，可以在室內(nèi)進(jìn)行，這樣污染率非常低，和在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行無(wú)顯著性差異。

3.3 開(kāi)放培養(yǎng)的效果

開(kāi)放培養(yǎng)由于沒(méi)有高壓滅菌的過(guò)程，因此營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損耗以及激素?fù)p耗較少，使開(kāi)放培養(yǎng)基中的激素濃度有所降低，同時(shí)瓊脂使用量大大降低，由7 g/L降低為3 g/L，木薯粉的添加使培養(yǎng)基的配制不需要pH的調(diào)整，大大縮短配制時(shí)間。與傳統(tǒng)無(wú)菌培養(yǎng)的半夏相比較，開(kāi)放式組培中激素濃度需要相應(yīng)降低，愈傷組織的增殖以及叢生芽的誘導(dǎo)較傳統(tǒng)組培差距不大，表明抑菌劑的種類(lèi)和濃度對(duì)半夏的組培影響較小，可大規(guī)模應(yīng)用。

在愈傷組織轉(zhuǎn)接過(guò)程中，多數(shù)愈傷組織可分化出叢生芽，但后期容易出現(xiàn)一些問(wèn)題，比如愈傷組織和培養(yǎng)基接觸面出現(xiàn)膿狀物、培養(yǎng)基變色以及叢生芽葉片開(kāi)展較弱等問(wèn)題，這可能是半夏叢生苗生理狀態(tài)變差，致使內(nèi)生菌或附著的細(xì)菌成為優(yōu)勢(shì)種而產(chǎn)生的膿狀物。導(dǎo)致半夏叢生苗生理狀態(tài)變差的原因，可能是培養(yǎng)容器內(nèi)惡化的環(huán)境，如濕度較大、溫度較高以及有害氣體增加等，從而導(dǎo)致有害菌增殖。在此情況下，采用無(wú)糖培養(yǎng)的方法，把叢生芽的外植體轉(zhuǎn)接在不含糖的蛭石上，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間，可產(chǎn)生新根，從而挽救生理狀態(tài)惡化的叢生芽外植體，減少損失。占艷等[17]對(duì)半夏無(wú)糖組培苗和有糖組培苗的根、葉顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行解剖比較分析發(fā)現(xiàn)，無(wú)糖半夏組培苗保水能力具有明顯優(yōu)勢(shì)，組培苗質(zhì)量明顯優(yōu)于有糖組培苗。

3.4 無(wú)糖培養(yǎng)的初步探討

無(wú)糖暴露培養(yǎng)應(yīng)是半夏進(jìn)一步培養(yǎng)的方向，從而進(jìn)一步建立操作簡(jiǎn)單、成本低廉的培養(yǎng)模式。在無(wú)糖培養(yǎng)的相關(guān)研究當(dāng)中，部分植物種類(lèi)獲得成功，且無(wú)糖組培苗較有糖培養(yǎng)苗的根系更為旺盛，柵欄組織和海綿組織分化更為明顯，組培苗質(zhì)量更優(yōu)[18,19]。借鑒無(wú)糖培養(yǎng)的理念，對(duì)生理狀態(tài)較差的叢生芽進(jìn)行處理，轉(zhuǎn)接在用MS 無(wú)機(jī)鹽（無(wú)有機(jī)物）+IBA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L營(yíng)養(yǎng)液充分潤(rùn)濕的蛭石中進(jìn)行培養(yǎng)，叢生芽出現(xiàn)少量葉片和葉柄的枯萎，但有更多的新葉產(chǎn)生，20 d 后取出觀察，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生部分新根，叢生苗正常生長(zhǎng)，該補(bǔ)救措施可減少組培苗的損失。