S100A8/A9在主動(dòng)脈夾層患者組織中的表達(dá)及臨床意義

溫中毓，丁榮明，胡育華，陸偉林，李青瑞，廖 沁，周世菊，呂亮亮，王雅蘭，謝家和，5

（1. 贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科；2. 贛南醫(yī)學(xué)院2018級(jí)碩士研究生；3. 贛州市人民醫(yī)院心內(nèi)科；4. 贛南醫(yī)學(xué)院2019級(jí)碩士研究生；5. 贛南醫(yī)學(xué)院心腦血管疾病防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 贛州 341000）

主動(dòng)脈夾層（Aortic dissection，AD）是指主動(dòng)脈壁內(nèi)膜破裂，導(dǎo)致假腔和/或壁內(nèi)血腫的形成及相應(yīng)器官血流灌注受損，嚴(yán)重者可因動(dòng)脈壁的破裂導(dǎo)致患者急性死亡［1］，致死率極高，達(dá)70%以上［2］。目前研究發(fā)現(xiàn)AD 發(fā)病受多種因素共同影響，如動(dòng)脈粥樣硬化，細(xì)胞外基質(zhì)降解、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等［3］。研究表明AD 發(fā)展整個(gè)過(guò)程中均伴有炎癥反應(yīng)，炎癥不僅是AD 的觸發(fā)因素還可促進(jìn)疾病進(jìn)展。此外，有研究結(jié)果表明多種炎癥因子對(duì)AD 的發(fā)展及預(yù)后具有預(yù)測(cè)功能［4］，但是至今還沒(méi)有公認(rèn)的生化指標(biāo)用于指導(dǎo)AD的防治。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)促炎因子鈣結(jié)合蛋白家族中成員［S100 鈣結(jié)合蛋白A8/A9（S100 calcium-binding protein A8/A9，S100A8/A9）］在多種心腦血管疾病中均升高，如腦梗死、心肌炎、急性冠脈綜合征等［5-8］。讓研究者感興趣的是S100A8/A9 對(duì)AD 的發(fā)病危險(xiǎn)因素如動(dòng)脈粥樣硬化、氧化應(yīng)激具有促進(jìn)作用［9］，但是S100A8/A9是否參與AD的發(fā)生，目前尚無(wú)研究報(bào)道。本研究通過(guò)檢測(cè)AD患者與NAD人群之間動(dòng)脈組織中S100A8/A9 及其下游相關(guān)因子水平，以期認(rèn)識(shí)S100A8/A9在AD的發(fā)展過(guò)程中的作用，并推測(cè)其可能的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2017—2019 年在贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心胸外科住院接受主動(dòng)脈置換術(shù)的AD 患者的夾層部位組織6 例為AD 組，另取行心臟搭橋手術(shù)患者的動(dòng)脈組織6 例為NAD 組。AD 診斷標(biāo)準(zhǔn)：患者經(jīng)過(guò)CT、CTA 等影像學(xué)檢查確診為主動(dòng)脈夾層（形成假腔或者游離瓣確診為主動(dòng)脈夾層）。同時(shí)均排除患有結(jié)締組織病、腫瘤和全身感染性疾病的患者。AD 組和NAD 組（對(duì)照組）在年齡、性別構(gòu)成等方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均自愿捐贈(zèng)樣本且對(duì)診治知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 臨床炎癥指標(biāo)測(cè)定抽取入選人群靜脈血行血漿白細(xì)胞（WBC）、C-反應(yīng)蛋白（CRP）、降鈣素原（PCT）等生化指標(biāo)檢測(cè)，具體操作由贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科完成，操作步驟參考檢測(cè)儀器及試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3 WB、免疫組化及RT-qPCR 檢測(cè)主動(dòng)脈組織中的S100A8/A9 蛋白及mRNA 表達(dá)水平；WB 檢測(cè)動(dòng)脈組織中S100A8/A9 相關(guān)因子NLRP3、Caspase-1及IL-1β表達(dá)水平。

1.4 觀察指標(biāo)比較兩組患者的同型半胱氨酸（Hcy）、D-二聚體（D-D）、白細(xì)胞（WBC）、降鈣素原（PCT）和C反應(yīng)蛋白（CRP）指標(biāo)水平并進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)比較組間差異，非正態(tài)分布以中位數(shù)表示，使用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)比較組間差異；計(jì)數(shù)資料用百分位數(shù)表示，采用卡方檢驗(yàn)比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AD組和NAD組臨床資料比較AD組患者性別、年齡、高血壓病史、吸煙史、入院時(shí)收縮壓和舒張壓，D-二聚體（D-D），同型半胱氨酸（Hcy）與NAD組無(wú)明顯差異，而AD 組患者白細(xì)胞（WBC）、降鈣素原（PCT）和C 反應(yīng)蛋白（CRP）高于NAD 組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.2 S100A8/A9 在AD 組和NAD 組動(dòng)脈組織中的表達(dá)分別采用WB、RT-qPCR 和免疫組化技術(shù)檢測(cè)AD 組和NAD 組中S100A8/A9的表達(dá)水平，WB結(jié)果顯示S100A8/A9 在AD 組高于NAD 組（圖1A/B）。RT-qPCR 的檢測(cè)結(jié)果與WB 一致，AD 組中S100A8/A9的表達(dá)高于NAD 組（圖1C）。免疫組化染色結(jié)果也顯示S100A8/A9 在AD 組表達(dá)升高（圖1D、E），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 NLRP3、Caspase-1 和IL-1β 在AD 組和NAD組動(dòng)脈組織中的表達(dá)使用WB 實(shí)驗(yàn)方法對(duì)其相關(guān)下游因子NLRP3、Caspase-1 及IL-1β 進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示NLRP3、Caspase-1及IL-1β在AD組的表達(dá)水平高于NAD 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

表1 患者臨床資料比較

圖1 S100A8/A9在AD患者動(dòng)脈組織中的表達(dá)水平

圖2 NLRP3、Caspase-1和IL-1β在AD組動(dòng)脈組織中的表達(dá)

3 討 論

我國(guó)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，隨著人口老齡化日益嚴(yán)重及生活方式的改變，AD 的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。目前隨著影像學(xué)技術(shù)的發(fā)展及普及，其診斷已不難，但是因其缺乏早期的防治手段，AD 患者死亡率并沒(méi)有減低［10-12］，因此探索AD 發(fā)病機(jī)制尋找有效的早期防治途徑具有重要意義。既往研究表明，炎癥是AD 發(fā)生的重要機(jī)制，血管壁炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)可以觸發(fā)炎癥反應(yīng)及增加基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的分泌，從而導(dǎo)致彈性纖維降解及動(dòng)脈壁中層結(jié)構(gòu)破壞，最終促使AD 形成［13］。此外，大量的研究已證實(shí)，炎癥指標(biāo)對(duì)AD 的發(fā)生及預(yù)后評(píng)估有重要意義，根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道，炎癥因子（CRP、PCT）水平與AD 的發(fā)生及預(yù)后有密切關(guān)系，如CRP 可作為評(píng)估AD 患者預(yù)后的預(yù)測(cè)因子；CRP 表達(dá)水平升高時(shí)AD患者住院死亡風(fēng)險(xiǎn)顯著增加［14-16］。此外一項(xiàng)包含347 例AD 患者的回顧性研究顯示，其入院時(shí)高水平的D-二聚體與患者術(shù)后90 d 血管性事件發(fā)生呈正相關(guān)［17］。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及氧化應(yīng)激導(dǎo)致PCT分泌增多，而血管內(nèi)膜損傷和氧化應(yīng)激是導(dǎo)致AD 形成的重要環(huán)節(jié)［18-19］。高同型半胱氨酸（HHcy）通過(guò)促進(jìn)血管炎癥反應(yīng)導(dǎo)致AD的發(fā)生，其機(jī)制可能與HHcy誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞募集及促進(jìn)炎癥細(xì)胞（IL-1、MCP-1）分泌，激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致Fibrillin-1蛋白變性，而彈性蛋白異常聚集易被金屬蛋白酶MMPs 降解，進(jìn)而加速血管壁重塑等有關(guān)［20-21］。以上結(jié)果表明炎癥因子與AD之間存在密切關(guān)系，我們所收集的臨床生化指標(biāo)結(jié)果亦顯示在AD 組患者血清中CRP、D-D、HHcy 及PCT 表達(dá)高于NAD 組。但是目前還沒(méi)有關(guān)于PCT 與AD 之間關(guān)系的確切研究，還需要在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及分子水平方面做進(jìn)一步研究。

近年來(lái)炎癥因子S100A8/A9 受到廣泛關(guān)注，眾多研究發(fā)現(xiàn)其在多種心腦血管疾病中表達(dá)升高，是心腦血管疾病的重要參與者［22］。S100A8/A9 來(lái)源于S100 蛋白家族，又稱(chēng)為遷移抑制因子相關(guān)蛋白MRP8/14；S100A8 和S100A9 兩亞基之間具有高度的序列同源性和結(jié)構(gòu)相似性，并通過(guò)Ca2+型依賴方式形成以反平行的二聚體發(fā)揮生物學(xué)功能［23］。S100A8/A9在細(xì)胞內(nèi)、外具有不同的生物學(xué)功能，不僅可以調(diào)節(jié)能量代謝、鈣穩(wěn)態(tài)以及蛋白磷酸化和炎癥反應(yīng)；還可以促進(jìn)細(xì)胞遷移、增殖或凋亡［24-25］。S100A8/A9 作為損傷相關(guān)分子模式（DAMP）的分子在正常生理情況下無(wú)促炎活性，機(jī)體在應(yīng)激損傷刺激下S100A8/A9 與免疫細(xì)胞上的TLR4 或RAGE 配體結(jié)合，并誘導(dǎo)核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路激活，觸發(fā)炎癥瀑布式反應(yīng)，從而參與多種疾病的炎癥發(fā)生過(guò)程［26-27］。因此認(rèn)為S100A8/A9 可能成為一些疾病診斷及預(yù)后判斷的標(biāo)志物，其表達(dá)水平的增加可預(yù)測(cè)疾病的發(fā)展并有可能成為該疾病治療的潛在靶點(diǎn)。

S100A8/A9 通常儲(chǔ)存在細(xì)胞質(zhì)中，只有在機(jī)體受到內(nèi)外因素刺激后才釋放至細(xì)胞外發(fā)揮作用。S100A8/A9的分泌并非通過(guò)經(jīng)典高爾基胞吐途徑分泌，而是類(lèi)似于白細(xì)胞介素-1b（IL-1b）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等細(xì)胞因子依賴于PKC 的激活特異性分泌到細(xì)胞外環(huán)境中，并對(duì)炎癥病灶周?chē)陌准?xì)胞發(fā)揮強(qiáng)大的趨化作用［28］。在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)建立的AD 小鼠模型及臨床試驗(yàn)中檢測(cè)到細(xì)胞因子IL-6、IL-18、MCP-1和MMP-2/MMP-9等表達(dá)升高，并且動(dòng)脈組織纖維斷裂明顯增加［29-30］。S100A8/A9作為這些炎癥因子的前因子在炎癥發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中起促進(jìn)作用，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示S100A8/A9在夾層組織中高表達(dá)，提示S100A8/A9 在主動(dòng)脈的炎癥反應(yīng)中可能發(fā)揮重要的作用及與AD 的發(fā)生密切關(guān)系。

S100A8/A9 在AD 形成中的具體作用機(jī)制尚不清楚，本研究結(jié)果表明S100A8/A9 的下游相關(guān)因子NLRP3、Caspase-1 和IL-1β 在AD 組中表達(dá)升高，而炎性小體NLRP3 是研究較清楚的介導(dǎo)細(xì)胞死亡的因子，其通過(guò)激活炎癥信號(hào)通路，促進(jìn)釋放催化成熟的炎癥因子，導(dǎo)致細(xì)胞炎癥性死亡［31］。研究報(bào)道在高脂喂養(yǎng)的APOE動(dòng)脈粥樣硬化小鼠中OxLDL誘導(dǎo)NLRP3 活化，進(jìn)而介導(dǎo)Caspase-1 活化及導(dǎo)致VSMCs 的凋亡增加［32］。而在人動(dòng)脈組織中NLRP3升高，促進(jìn)成熟Caspase 1和IL-1β分泌增加，從而誘導(dǎo)骨相關(guān)基質(zhì)蛋白的表達(dá)并促使血管鈣化及VSMCs凋亡；并且VSMCs 表型轉(zhuǎn)換依賴于S100A8/A9 的配體TLR4 的激活［33］；S100A8/A9 通過(guò)TLR4/NLRP3 促進(jìn)炎癥因子IL-1β、IL-18等高表達(dá)，造成機(jī)體過(guò)度炎性反應(yīng)；并通過(guò)線粒體和溶酶體調(diào)節(jié)活性氧ROS 活性，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡及自噬死亡［34-35］。因此S100A8/A9可能通過(guò)激活血管平滑肌細(xì)胞炎癥性程序性死亡通路參與AD的發(fā)生過(guò)程。

綜上所述，S100A8/A9 與AD 的發(fā)生有密切聯(lián)系，其作用機(jī)制可能與炎癥反應(yīng)有關(guān)，但本研究為臨床研究，無(wú)法進(jìn)行條件性干預(yù)，其確切作用過(guò)程仍需以后在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及分子水平方面做進(jìn)一步研究。