TWEAK刺激后巨噬細胞源性外泌體抑制上皮性卵巢癌細胞侵襲和遷移的機制

李 霞，張 珂，閔 楠

(新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院婦科，新疆 烏魯木齊 830011)

經(jīng)相關(guān)臨床研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導因子(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis,TWEAK)作用后，巨噬細胞源性外泌體可以有效產(chǎn)生抑制功效，但其所存在著作用機制尚不明確。經(jīng)另一項調(diào)查觀察到，在卵巢癌細胞內(nèi)對miRNA-7進行轉(zhuǎn)染，可以有效對表皮生長因子受體以及受體下游信號通路的表達水平進行抑制，并可以對卵巢癌細胞遷移與侵襲作用進行抑制[1-12]。所以，本研究旨在探究經(jīng)TWEAK作用后是否借助于對巨噬細胞與其外泌體內(nèi)miRNA-7表達水平進行調(diào)控，抑制EOC細胞遷徙與遷移作用，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 實驗中所使用的人單核細胞株THP-1購買自中國科學院上海生命科學研究院中細胞庫內(nèi)，使用市級內(nèi)婦科腫瘤重點研究室長期保存著的人上皮性卵巢癌細胞株HO8910-PM。RPMI-1640培養(yǎng)基與胎牛血清來自于Hyclone公司；重組人TWEAK細胞因子來自于Sigma公司；佛波酯來自于PeproTech公司；總外泌體分離試劑盒與TRIzol試劑來自于Invitrogen公司；TaqMan microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒來自于Applied Biosystems公司；U6的特殊性探針與miRNA-7來自于Applied Biosystems公司。Transwell小室屬于Corning公司，此類型號為3422；0.22 μm濾器具來自于Millipore公司；Matrigel基質(zhì)膠來自于BD公司)；在整個實驗過程中主要使用CST公司的的蛋白檢測抗體。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人單核細胞THP-1與人上皮性卵巢癌細胞HO8910-PM培養(yǎng)在包含有純度10%的胎牛血清的0% RPIM-1640培養(yǎng)基中，在37 ℃ 5%CO2條件下經(jīng)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)間進行傳代。細胞通過1 500×g離心2 min后傳代或是換液。THP-1細胞注意保持形態(tài)相同、透亮、圓形的懸浮狀況有所發(fā)生。

1.2.2對誘導THP-1巨噬細胞作用 懸浮著的THP-1細胞根據(jù)5×105個/mL的密度在10 cm的培養(yǎng)皿當中進行接種，與此同時添加100 ng/mL的佛波酯進行誘導24 h。

1.2.3經(jīng)TWEAK作用對巨噬細胞進行刺激 所懸浮著的THP-1細胞經(jīng)過一定的誘導過程使得細胞變?yōu)樗N壁著的巨噬細胞后，使用PBS洗2次，并將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換為不含有血清的RPIM-1640培養(yǎng)基，200 ng/mL的對其進行添加TWEAK并持續(xù)刺激24 h。對照組添加同等體積量的PBS，其他的處理形式與上述幾近相似。

1.2.4細胞上清液中外泌體的分離 選擇400×g取細胞上清液進行離心處理15 min，選擇上清。選擇5 000×g，在溫度為4 ℃下離心處理15 min，選擇0.22 μm濾器進行過濾。按照2∶1的比例將上清與抽提試劑混合添加至外泌體抽提試劑當中，快速混勻并放置在4 ℃過夜，次日拿走，10 000×g，在4 ℃溫度下離心1 h，將上清抽離出來。沉淀為抽提的外泌體，使用PBS重懸處理后使用BCA手段定量蛋白。然后將其放置在-80 ℃攝氏度的冰箱進行長時間的封存，盡可能防止反復凍融。

1.2.5Western blotting手段對細胞內(nèi)蛋白的表達進行檢測 去除細胞培養(yǎng)基，利用溫度為4 ℃預冷后的PBS洗2次，添加含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液在冰上對其裂解30 min。使用裂解溶液以1 200×g，在溫度為4 ℃進行離心處理10 min，去除沉淀后對裂解溶液使用BCA手段對其進行定量。含量10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳對蛋白樣品進行相應的分離，最初的電壓保持在80 V，將蛋白marker進行分開后，將使用電壓調(diào)節(jié)至120 V，完成整個電泳實驗。經(jīng)聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜轉(zhuǎn)膜90 min后，保持恒電流為200 mA。濃度為5%的BSA在室溫條件下?lián)u床封閉2 h，根據(jù)抗體說明書所表示，添加稀釋一抗并在溫度為4 ℃條件下孵育過夜，在實驗中使用TBS-T緩沖溶液洗膜后二抗在常溫條件下進行1 h的孵育，使用熒光掃描設備對顯影進行掃描。

1.2.6使用Real-time PCR技術(shù)對miRNA-7的表達進行檢測 按照TRIzol試劑說明書內(nèi)容選取巨噬細胞與外泌體內(nèi)的RNA。使用特殊的TaqMan反轉(zhuǎn)錄探針對miRNA-7進行反轉(zhuǎn)錄，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄可以轉(zhuǎn)錄成為cDNA，使用TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒對整個反轉(zhuǎn)錄體系結(jié)果進行調(diào)試，配置反應體系中所需要的所有處理都是在冰的條件下進行處理。反應條件為時間30 min，溫度為16 ℃，30 min 42 ℃，5 min 85 ℃。而后按照后TaqMan miRNA Assay操作手冊所要求的操作步驟對相關(guān)試劑進行配置并完成PCR反應。確保反應順利進行，應當控制精準的反應條件：10 min 95 ℃，15 s 95 ℃，1 min 60 ℃，之后的兩個步驟共分為40個循環(huán)。使用U6作為內(nèi)參照，以2-△△CT值對微小RNA即miRNA的相對表達量進行評估，在進行試驗后，保證每組試驗設定為3個復孔。

1.2.7Transwell侵襲和遷移實驗 使用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基對HO8910-PM細胞進行重懸，對細胞數(shù)密度進行相應的調(diào)整。按照4×104個細胞在遷移實驗中種于上室；在進行侵襲實驗過程中，首先使用無血清先將RPMI-1640培養(yǎng)基按照1∶6的比例對Matrigel基質(zhì)膠進行稀釋，選擇容量為50 μL稀釋溶液包被置于Transwell小室的最下位置處，將8×104個細胞種于上室。在下室添加濃度為10%的750 μL胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基后，放置在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。之后使用濃度為4%的多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色時間大約為30 min，使用PBS清洗3次后使用棉簽對上室殘留細胞進行擦去，放置在倒置顯微鏡下拍照并進行相應的計量。每個樣品隨機計數(shù)5個視野穿過的細胞數(shù)并在數(shù)據(jù)中選取平均數(shù)值。

1.3觀察指標 對TWEAK在刺激作用前后的巨噬細胞源性外泌體進行收集，同H08910-PM一起進行培養(yǎng)，通過使用real-time PCR對巨噬細胞源性外泌體、巨噬細胞以及共同培養(yǎng)后的HO8910-PM細胞中miRNA-7的表達進行檢測，通過Western blotting技術(shù)對共培養(yǎng)后的HO8910-PM細胞中EGFR/AKT/ERK1/2信號通路的表達進行檢測，觀察與比較2組巨噬細胞內(nèi)及其外泌體中miRNA-7表達水平、2組巨噬細胞源性外泌體對HO8910-PM細胞中miRNA-7的表達。

1.4統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.12組巨噬細胞內(nèi)及其外泌體中miRNA-7表達水平比較 在TWEAK作用后，觀察組巨噬細胞內(nèi)及其外泌體中miRNA-7表達水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組巨噬細胞內(nèi)及其外泌體中miRNA-7表達水平比較Table 1 Comparison of expression levels of miRNA-7 in macrophages and their exosomes in two groups

2.22組巨噬細胞源性外泌體對HO8910-PM細胞中miRNA-7的表達比較 在TWEAK作用后，觀察組經(jīng)TWEAK刺激后的巨噬細胞源性外泌體對HO8910-PM細胞中miRNA-7的表達明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組巨噬細胞源性外泌體對HO8910-PM細胞中miRNA-7 的表達比較Table 2 Comparison of expression of miRNA-7 in HO8910-PM cells by macrophage derived exosomes in two groups

3 討 論

TWEAK蛋白最初是1997年被相關(guān)學者所發(fā)現(xiàn)，它是由249個氨基酸所組成的Ⅱ型跨膜蛋白，包含有TNF的同源結(jié)構(gòu)范圍?，F(xiàn)今探究表明，經(jīng)TWEAK作用后可直接對自然殺傷細胞、巨噬細胞與樹突狀細胞等固有免疫細胞的功效進行調(diào)節(jié)。經(jīng)相關(guān)學者探究表明，TWEAK可以對腫瘤浸潤巨噬細胞的抗腫瘤作用有著重要的影響，但現(xiàn)如今對其抗腫瘤作用機制還探究的甚少[13-15]。經(jīng)前期探究表明，在TWEAK作用下，巨噬細胞上所存在著的清液可以對人卵巢癌細胞HO8910-PM的侵襲作用進行有效抑制。之后在TWEAK刺激作用后的從巨噬細胞上清液之中分離并提取出外泌體，觀察到其外泌體具有可以對HO8910-PM細胞侵襲和遷移的作用進行抑制的因子。但是外泌體包含有脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等多類的生物活性物質(zhì)，它可以具備抑制癌癥的功效[16-17]。

本研究主要探究巨噬細胞源性外泌體在TWEAK作用后抑制上皮性卵巢癌細胞侵襲與遷移的作用機制，經(jīng)研究表明，在TWEAK作用后，觀察組巨噬細胞內(nèi)及其外泌體中miRNA-7表達水平提高。在進行不同處理后，巨噬細胞源性外泌體同HO8910-PM細胞共培養(yǎng)24 h，之后對HO8910-PM細胞中的miRNA-7進行檢測。觀察組經(jīng)TWEAK刺激后的巨噬細胞源性外泌體對HO8910-PM細胞中miRNA-7的表達明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。該數(shù)據(jù)提示在TWEAK對巨噬細胞介導中，miRNA-7可以發(fā)揮其抑制癌癥的功效。其中外泌體中的miRNA可以穩(wěn)定地保存著，通過細胞間的傳遞并調(diào)節(jié)下游基因的表達過程。對乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤等的癌癥的探究，其中通過miRNA-7可以有效抑制貼壁于腫瘤細胞內(nèi)的斑激酶并可以抑制EGFR等分子及其下游信號通路，幫助調(diào)節(jié)抑制癌癥。大概約有70%的卵巢癌細胞內(nèi)高表達水平，所被激活的EGFR信號通路可以調(diào)節(jié)細胞侵襲、遷移等過程，并極大提高產(chǎn)生腫瘤血管的量。因此有效抑制其相關(guān)的信號通路就可以做到治療患者的卵巢癌。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)巨噬細胞在分泌過程中會分泌外泌體，調(diào)節(jié)患者HO8910-PM細胞中miRNA-7的表達水平，對其EGFR/AKT/ERK1/2信號通路的活化進行抑制，并使得卵巢癌細胞的在整個侵襲和遷移階段中得到較好的抑制作用。通過作相關(guān)的對體外實驗觀察到，有一類miRNA-7可以有效地抑制卵巢癌細胞整個遷移過程。本探究還需要開展后期對動物的臨床實驗進一步證實?，F(xiàn)階段，已有許多有關(guān)于體內(nèi)研究的文獻。相關(guān)學者利用注射相關(guān)所研究的細胞液體直至小鼠腹腔內(nèi)部，對腫瘤組織中巨噬細胞的CD206的表達能力進行檢測。觀察結(jié)果為卵巢癌細胞外泌體可以對整個分化成為M2型巨噬細胞產(chǎn)生抑制作用，幫助外泌體內(nèi)的miRNA-223發(fā)揮巨大作用。

綜上所述，TWEAK對癌細胞中miRNA-7的表達能力進行上調(diào)，并抑制EGFR表達活化相關(guān)信息通路從而抑制癌細胞的擴散轉(zhuǎn)移[18]。