消癭方對甲狀腺FRTL細胞增殖與凋亡的影響

[摘要]目的探討消癭方對甲狀腺FRTL細胞增殖與凋亡影響及其機制。方法取4周齡SD大鼠15只，隨機分為低濃度、中濃度、高濃度消癭方組和陽性藥組、空白組，每組3只。消癭方低、中、高濃度組分別給予7.47、14.94、29.88 g/kg消癭方中藥復(fù)方藥液，陽性藥組給予左甲狀腺素鈉片（0.18 mg/kg），空白組給予蒸餾水，連續(xù)灌胃5 d，腹主動脈取血，分離血清。體外培養(yǎng)大鼠甲狀腺FRTL細胞，分別應(yīng)用各組血清進行干預(yù)。MTT法檢測含藥血清對FRTL細胞增殖率的影響，Hoechst 33258熒光染色法檢測細胞凋亡形態(tài)，Western blotting和RT-PCR法檢測凋亡因子Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白和基因表達。結(jié)果高濃度消癭方含藥血清干預(yù)后，F(xiàn)RTL細胞增殖率顯著下降（F=6.71、5.85，Plt;0.05）;細胞密度下降，細胞排列散亂、細胞核碎裂、細胞透亮，呈現(xiàn)典型凋亡形態(tài)學特征;促凋亡因子Bax蛋白和基因表達上調(diào)，而抗凋亡因子Bcl-2蛋白和基因表達下調(diào)，促/抗凋亡因子bax/bcl-2間的平衡被打破，凋亡執(zhí)行因子Caspase-3蛋白和基因表達顯著上調(diào)，差異有顯著性（F=9.97～63.20，Plt;0.01）。結(jié)論消癭方能夠抑制甲狀腺FRTL細胞增殖，促進其凋亡，其機制可能與促/抗凋亡因子bax/bcl-2間平衡破壞、caspase-3表達上調(diào)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]消癭方;甲狀腺;FRTL細胞;凋亡因子;細胞增殖;細胞凋亡

[中圖分類號]R259[文獻標志碼]A[文章編號]2096-5532（2021）01-0105-05

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of Xiaoying prescription on the proliferation and apoptosis of thyroid FRTL cells and related mechanism. MethodsA total of 15 Sprague-Dawley rats， aged 4 weeks， were randomly divided into blank group， positive drug group， and low-， medium-， and high-concentration Xiaoying prescription groups， with 3 rats in each group. The rats in the low-， medium-， and high-concentration Xiaoying prescription groups were given the solution of Xiaoying prescription at a dose of 7.47， 14.94， and 29.88 g/kg， respectively， those in the positive drug group were given levothyroxine sodium tablets （0.18 mg/kg）， and those in the blank group were given distilled water， by gavage for 5 consecutive days. Blood samples were collected from the abdominal aorta and serum was separated. Rat thyroid FRTL cells were cultured in vitro， and the serum containing each drug was used for intervention. MTT assay was used to observe the effect of the serum containing drug on the proliferation rate of FRTL cells， Hoechst 33258 fluorescence staining was used to observe apoptotic morphology， and Western blotting and RT-PCR were used to measure the protein and mRNA expression of the apoptotic factors Bax， Bcl-2， and Caspase-3. ResultsThere was a significant reduction in the proliferation rate of FRTL cells after intervention with the serum containing high-concentration Xiaoying prescription （F=6.71，5.85;Plt;0.05）， with the typical apoptotic morphological features of reduced cell density， scattered arrangement， nucleus fragmentation， and translucent cells. The protein and mRNA expression of the pro-apoptotic factor Bax was upregulated， while the protein and mRNA expression of the anti-apoptotic factor Bcl-2 was downregulated， and the ba-lance between the pro-apoptotic factor bax and the anti-apoptotic factor bcl-2 was broken; there were significant increases in the protein and mRNA expression of the apoptosis execution factor caspase-3 （F=9.97-63.20，Plt;0.01）. ConclusionXiaoying prescription can inhibit the proliferation and promote the apoptosis of thyroid FRTL cells， possibly by breaking the balance between the pro-apoptotic factor bax and the anti-apoptotic factor bcl-2 and upregulating the expression of caspase-3.

[KEY WORDS]Xiaoying recipe; thyroid gland; thyroid FRTL cells; apoptotic factor; cell proliferation; apoptosis

甲狀腺結(jié)節(jié)是最常見的內(nèi)分泌疾病之一，發(fā)病率高達6%～7%，以良性結(jié)節(jié)多見[1-2]。已有研究顯示，甲狀腺結(jié)節(jié)的發(fā)生是遺傳、免疫紊亂、激素失調(diào)等多種原因共同觸發(fā)而導致甲狀腺結(jié)構(gòu)及功能異常，其中甲狀腺細胞的增殖與凋亡平衡破壞在疾病的發(fā)生過程中起重要作用[3-4]。西醫(yī)治療甲狀腺結(jié)節(jié)常出現(xiàn)結(jié)節(jié)復(fù)發(fā)、骨質(zhì)疏松、甲狀腺功能下降等副作用[5-6]，而中醫(yī)藥具有毒小效優(yōu)、多環(huán)節(jié)、多途徑治療特點，在防治甲狀腺結(jié)節(jié)、改善癥狀、調(diào)節(jié)機體免疫等方面優(yōu)勢明顯[7]。消癭方以“益氣養(yǎng)陰、祛痰散結(jié)”為治則，為中藥治療“癭病”代表性方劑，臨床常用該方加減治療甲狀腺疾病。本研究旨在探討消癭方對甲狀腺FRTL細胞增殖與凋亡的影響，為中醫(yī)藥治療甲狀腺結(jié)節(jié)提供基礎(chǔ)理論支撐。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物SPF級4周齡SD大鼠15只，雌雄不拘，體質(zhì)量200～220 g，由上海斯萊克動物有限公司提供。

1.1.2藥物消癭方組方：黃芪30 g，玄參15 g，黨參15 g，白芍15 g，北沙參15 g，制香附15 g，浙貝母15 g，夏枯草10 g，當歸10 g，柴胡10 g，海浮石10 g，白芥子6 g，原藥材均購自上海群力中草藥店。全方加8倍體積水煎煮2次，并濃縮至人臨床等效劑量的0.5、1.0、2.0倍劑量。左甲狀腺素鈉片購自默克雪蘭諾有限公司，規(guī)格每粒50 μg。

1.1.3主要試劑與儀器大鼠甲狀腺FRTL細胞株（武漢普諾賽）;DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco）;bax、bcl-2、caspase-3多克隆抗體（英國Abcam）;GAPDH單克隆抗體（美國CST）;HRP-IgG二抗（武漢博士德）;MTT粉末、Hoechst 33258染液（上海碧云天）;RIPA、Trizol（北京中杉金橋）;CO2培養(yǎng)箱、酶標儀（美國Thermo）;超微量核酸蛋白測定儀（英國BioDrop）;凝膠成像分析系統(tǒng)、實時熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad）。

1.2實驗方法

1.2.1含藥血清的制備SD大鼠隨機分為空白組、低濃度消癭方組、中濃度消癭方組、高濃度消癭方組和陽性藥組，每組3只。低、中、高濃度消癭方組分別給予7.47、14.94、29.88 g/kg的中藥復(fù)方煎液（相當于臨床等效劑量的0.5、1.0、2.0倍），陽性藥組給予0.18 mg/kg（臨床等效劑量）左甲狀腺素鈉片水溶液，空白組則給予等量蒸餾水。各組均于每天上、下午固定時間灌胃給藥1次，連續(xù)灌胃5 d。第6天上午灌胃完成后1 h麻醉大鼠，腹主動脈取血，室溫靜置2 h，以3 000 r/min離心10 min，分離血清，56 ℃水浴滅活30 min，分裝、保存?zhèn)溆?，使用前?.22 μm微孔濾膜過濾。

1.2.2細胞培養(yǎng)取大鼠甲狀腺FRTL細胞株，用含體積分數(shù)0.10胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2飽和濕度下培養(yǎng)，待細胞基本長滿培養(yǎng)瓶底部（2～3 d）時消化傳代，取對數(shù)生長期細胞，隨機分為5組。 空白對照組（A組）：加入空白組血清;低濃度消癭方組（B組）：加入低濃度消癭方組含藥血清;中濃度消癭方組（C組）：加入中濃度消癭方組含藥血清;高濃度消癭方組（D組）：加入高濃度消癭方組含藥血清;左甲狀腺素鈉組（E組）：加入陽性藥組含藥血清。

1.3檢測指標及方法

1.3.1MTT法檢測細胞增殖率采用胰蛋白酶消化并調(diào)整細胞密度，以每孔5 000個細胞接種于96孔板中，待細胞完全貼壁后，棄去培養(yǎng)液，各組分別加入對應(yīng)的含藥或者正常血清。每組設(shè)6個復(fù)孔，同時設(shè)置空白孔。分別于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48 h，加入MTT液避光孵育4 h，然后加入DMSO液，室溫下振蕩10 min，酶標儀測定450 nm波長處各孔的吸光度（A）值，計算細胞增殖率。增殖率（%）=（A含藥血清-A空白孔）/（A空白血清-A空白孔）×100%。

1.3.2Hoechst染色法檢測細胞凋亡情況調(diào)整細胞密度，加入含藥或者正常血清后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出96孔板，棄去培養(yǎng)液，加入PBS液洗滌3次，然后每孔加入Hoechst 33258染液100 μL，37 ℃避光孵育30 min;孵育完成后，棄去孔內(nèi)染液，PBS液洗滌3次后，倒置熒光顯微鏡下觀察各組細胞的凋亡形態(tài)。

1.3.3Western blotting法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達收集含藥或者正常血清培養(yǎng)24 h后的細胞，加入裂解液冰上裂解20 min，以4 ℃、12 000 r/min離心10 min后取上清液，應(yīng)用超微量核酸蛋白測定儀測定細胞總蛋白含量。制備分離膠和濃縮膠，蛋白上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉后，加入稀釋后的一抗（1∶1 000稀釋），4 ℃孵育過夜。洗滌條帶，加入二抗（1∶500稀釋）室溫下孵育4 h，洗滌，化學發(fā)光法顯影。用Image-Pro Plus軟件分析各條帶的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參照，計算目的蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3的相對表達水平。

1.3.4RT-PCR法檢測凋亡相關(guān)基因表達收集含藥或者正常血清培養(yǎng)24 h細胞于EP管內(nèi)，加入1 mL Trizol試劑提取細胞總RNA，檢測含量合格后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA（按反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求操作），采用PCR擴增目的基因產(chǎn)物，以β-actin基因為內(nèi)參照。引物由深圳華大基因公司合成，序列見表1。用2-△△CT法對細胞目的基因bax、bcl-2、caspase-3水平進行定量分析。

以上指標檢測各組均用3份血清進行3次獨立重復(fù)實驗。

1.4統(tǒng)計學處理

采用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料結(jié)果用±s表示，多組間比較用單因素或析因設(shè)計資料的多因素方差分析，兩組間比較用Dunnet-t檢驗。Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1各組FRTL細胞增殖率比較

析因設(shè)計資料的多因素方差分析顯示，不同處理方式對FRTL細胞增殖率影響差異有顯著意義（F=12.40，Plt;0.01），而相同處理方式不同時間處理對FRTL細胞增殖率沒有顯著影響（Pgt;0.05），且處理方式和處理時間無交互效應(yīng)（Pgt;0.05）。與空白對照組比較，高濃度消癭方含藥血清培養(yǎng)能顯著降低FRTL細胞的增殖率（F=6.71、5.85，Plt;0.05）。與陽性藥左甲狀腺素鈉組比較，高濃度消癭方含藥血清培養(yǎng)后FRTL細胞增殖率差異無顯著性（Pgt;0.05）。見表2。

2.2各組FRTL細胞凋亡形態(tài)觀察

空白對照組FRTL細胞密集、分布均勻，細胞形態(tài)正常，熒光呈暗藍色，無明顯的凋亡特征;中、低濃度消癭方組FRTL細胞數(shù)量稍有減少，但細胞形態(tài)、密度及熒光顏色與空白對照組比較差異不明顯;高濃度消癭方組及左甲狀腺素鈉組FRTL細胞數(shù)目明顯減少，排列散亂無規(guī)則，部分細胞核碎裂，細胞透亮，熒光顏色明顯，呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學特征。見圖1。

2.3各組FRTL細胞凋亡相關(guān)蛋白表達比較

與空白對照組比較，中、高濃度消癭方含藥血清培養(yǎng)能顯著增加FRTL細胞促凋亡因子Bax蛋白的表達（F=9.97，Plt;0.01），降低抗凋亡因子Bcl-2蛋白的表達（F=14.73，Plt;0.01），升高Bax/Bcl-2比值（F=63.20，Plt;0.01），上調(diào)凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3的表達（F=53.82，Plt;0.01）。與左甲狀腺素鈉組相比較，高濃度消癭方含藥血清培養(yǎng)后FRTL細胞凋亡相關(guān)蛋白表達差異無顯著性（Pgt;0.05），而中濃度消癭方含藥血清培養(yǎng)后Bax/Bcl-2比值和凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3表達降低（Plt;0.01）。與中濃度消癭方組比較，高濃度消癭方組Bax/Bcl-2比值和凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3的表達增高（Plt;0.01）。見圖2和表3。

2.4各組FRTL細胞凋亡相關(guān)基因表達比較

與空白對照組比較，中、高濃度消癭方含藥血清培養(yǎng)能顯著增加FRTL細胞促凋亡因子Bax基因表達（F=15.52，Plt;0.01），降低抗凋亡因子bcl-2基因的表達（F=12.83，Plt;0.01），升高基因bax/bcl-2比值（F=45.89，Plt;0.01），上調(diào)凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3基因的表達（F=21.91，Plt;0.01）。與左甲狀腺素鈉組比較，高濃度消癭方含藥血清培養(yǎng)后FRTL細胞凋亡相關(guān)基因表達差異無顯著意義（P>0.05），而中濃度消癭方含藥血清培養(yǎng)后FRTL細胞基因bax/bcl-2比值降低（Plt;0.01）。與中濃度消癭方組相比較，高濃度消癭方含藥血清培養(yǎng)后FRTL細胞基因bax/bcl-2比值顯著增高，差異有顯著性（Plt;0.01）。見表4。

3討論

甲狀腺結(jié)節(jié)屬中醫(yī)“癭病”范疇，病始在肝，肝氣郁滯而化火，灼傷津液而生痰，痰濁內(nèi)阻，瘀阻脈絡(luò)，以致氣機逆亂，氣血通行不暢，集結(jié)于頸部，導致此病發(fā)生[8]。其中醫(yī)病機關(guān)鍵是臟腑功能紊亂，氣血陰虛失和，氣滯、痰凝等有形之邪蘊結(jié)于局部而成癭腫，治當以“益氣養(yǎng)陰、祛痰散結(jié)”為法。

消癭方由黃芪、玄參、黨參、白芍、北沙參、制香附、浙貝母、夏枯草、柴胡、當歸、海浮石、白芥子等藥組成。方中以黃芪為君藥，益氣固表，消腫生肌，并能調(diào)節(jié)機體免疫及激素平衡;玄參、黨參、白芍、北沙參為臣藥，助黃芪益氣消腫之功效;制香附、浙貝母、夏枯草、柴胡、當歸、海浮石及白芥子為佐使藥，以行氣活血、消腫散瘀、養(yǎng)陰化痰、軟堅散結(jié)。諸藥合用，共奏益氣養(yǎng)陰、祛痰散結(jié)兼扶正之功。臨床研究證實，消癭方治療甲狀腺結(jié)節(jié)、橋本甲狀腺炎等甲狀腺疾病療效顯著[9-11]。

甲狀腺細胞的正常增殖與凋亡是維持甲狀腺功能的基礎(chǔ)，細胞增殖速度過快以及細胞凋亡功能降低均參與了甲狀腺結(jié)節(jié)的形成過程[12]?；謴?fù)甲狀腺細胞增殖與凋亡的平衡，是治療該疾病的重要策略[13-14]。本實驗采用MTT法觀察消癭方對甲狀腺FRTL細胞增殖的影響，結(jié)果顯示，高濃度消癭方刺激的含藥血清能有效抑制FRTL細胞增殖;但其抑制FRTL細胞增殖效果不呈時間依賴性，因此后續(xù)研究中將干預(yù)時間設(shè)定為24 h。本文應(yīng)用Hoechst 33258熒光染色法觀察細胞凋亡形態(tài)，結(jié)果顯示，高濃度的消癭方含藥血清能導致FRTL細胞數(shù)量下降，分布散亂，細胞核碎裂、固縮、透亮，呈現(xiàn)明顯的凋亡特征。

Bcl-2家族是目前公認與凋亡密切相關(guān)的基因，包括bax、bad等促凋亡因子和bcl-2、bcl-xl等抗凋亡因子基因，其中bax和bcl-2的相對表達水平高低直接決定細胞對凋亡刺激的反應(yīng)程度[15-16]?？沟蛲鲆蜃觔cl-2主要是通過抗氧化或抑制氧自由基產(chǎn)生來阻止細胞凋亡，促凋亡因子bax則是通過線粒體途徑形成同源二聚體而誘導細胞凋亡，bax/bcl-2間的平衡決定細胞凋亡是否發(fā)生[17-20]。研究顯示，在甲狀腺結(jié)節(jié)疾病狀態(tài)下，抗凋亡的bcl-2表達增加而促凋亡的bax下降，導致bax/bcl-2比值異常，凋亡相對不足[21-23]。

Caspase家族是一組存在于細胞質(zhì)中具有特定結(jié)構(gòu)的蛋白酶，該家族相關(guān)蛋白的激活能誘發(fā)細胞凋亡，而Caspase家族成員的活性受到Bcl-2家族系列因子的調(diào)控[16，24]。其中，Caspase-3是Caspase家族中最關(guān)鍵的成員之一，是細胞凋亡過程中最關(guān)鍵的執(zhí)行者[26]。本文研究結(jié)果顯示，消癭方含藥血清能有效增加促凋亡因子bax表達而降低抗凋亡因子bcl-2表達，打破促/抗凋亡因子bax/bcl-2間的平衡，同時上調(diào)caspase-3表達，從而誘導甲狀腺FRTL細胞凋亡。

綜上所述，以“益氣養(yǎng)陰、祛痰散結(jié)”為治則的消癭方能抑制甲狀腺FRTL細胞增殖，促進其凋亡，其機制可能與破壞促/抗凋亡因子bax/bcl-2間平衡、上調(diào)caspase-3表達有關(guān)。本研究從細胞層面明確了消癭方對甲狀腺疾病的治療作用，為該方的臨床應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。下一步擬對該方進行拆解，篩選并明確其發(fā)揮療效的有效成分。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）