局部微電流刺激對兔脛骨骨缺損部位降鈣素基因相關(guān)肽表達(dá)的影響

姚玉英 張宏 范雅麗 楊東浩 金玉祥 賈麗麗 郭志利△

脛骨骨折是臨床常見的膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷之一，可包括脛骨平臺和干骨骨折，多因摔傷、重物打擊及車禍傷形成，尤其隨著我國交通事業(yè)的快速發(fā)展，其發(fā)生率呈逐年增加趨勢[1-2]。因脛骨特殊的解剖結(jié)構(gòu)，其周圍皮下組織及外周肌肉較少，一旦受損，易導(dǎo)致局部滋養(yǎng)血管及組織損傷，給臨床治療帶來較大的難度，且脛骨骨折后感染引起的骨缺損等并發(fā)癥，會導(dǎo)致極高的傷殘率，給患者生活質(zhì)量帶來嚴(yán)重影響，一直是骨科研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)[3-4]。電刺激治療對脛骨骨缺損修復(fù)有著明顯的療效，近些年在臨床上得到越來越多的應(yīng)用[5]。本研究通過對兔脛骨骨缺損部位進(jìn)行局部微電流刺激，分析其對降鈣素基因相關(guān)肽表達(dá)的影響，闡明其對骨缺損愈合機(jī)制，以期為脛骨骨缺損的愈合提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選用新西蘭家兔(動物批準(zhǔn)號為SCXK(冀)2018-0013)40只，雌雄各半，3個(gè)月月齡，體質(zhì)量2.0～3.0 kg，由河北醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，飼養(yǎng)于清潔級實(shí)驗(yàn)室中(室溫22～25 ℃，濕度50%～65%)，給予普通飼料喂養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑

兔多隆抗體CGRP和兔多隆抗體CGRPR-1(武漢博士德公司)、 射用異戊巴比妥鈉(廣東新亞藥業(yè))。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

電子天平(型號為AEL-40SM，日本島津)、骨密度儀(型號為XR-46，美國 NORLAND公司)、顯微鏡(型號為Olympus IX71，日本OLYMPUS)、神經(jīng)刺激儀(型號為LH202H，北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司)。

1.4 方法

1.4.1分組、模型制備及干預(yù) 將40只新西蘭家兔隨機(jī)分模型組和治療組(各20只)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，給予2%戊巴比妥鈉溶液麻醉，無菌條件下對右膝關(guān)節(jié)下脛骨上端1/3處進(jìn)行縱行切口(切口約3 cm)，分離黏膜、筋膜、肌肉至骨膜，采用動力鉆形成10 mm×3 mm脛骨近端骨缺損(10 mm×3 mm)，術(shù)后清理創(chuàng)口碎骨組織并止血，無菌縫合后包扎，構(gòu)建脛骨骨缺損模型。兩組家兔術(shù)后均常規(guī)飼養(yǎng)，自由活動，治療組術(shù)后第1天，將電刺激儀正負(fù)置于骨缺損所在脛骨近端，負(fù)極置于遠(yuǎn)端神經(jīng)處，對周圍神經(jīng)點(diǎn)進(jìn)行刺激，脈沖時(shí)間0.6～1.0 ms，脈沖頻率2～20 Hz，刺激電流50 mA，1次/d，每次30 min。

1.4.2骨密度(BMD)及骨礦物含量(BMC)檢測 造模后1、2、3和4周，各組取5只兔處死后，取右脛骨，并剔除周圍附著的肌肉及筋膜。對骨痂BMD和BMC進(jìn)行檢測。

1.4.3三點(diǎn)彎曲力學(xué)實(shí)驗(yàn) 造模后4周，取各組家兔右脛骨樣本，置于MTS試驗(yàn)機(jī)上采用三點(diǎn)彎曲法進(jìn)行生物力學(xué)檢測，通過儀器記錄彈性載荷、彎曲能量、斷裂載荷，并計(jì)算出剛性系數(shù)。

1.4.4免疫組織化檢測 造模后1、2、3和4周，各組取5只兔處死后，取右脛骨，切取包含骨缺損在內(nèi)長度為1 cm的骨組織作為標(biāo)本，置入10%中性福爾馬林溶液固定，15%EDTA溶液中脫鈣，脫水，透明，石蠟包埋后連續(xù)切片，按照SABC試劑盒劑盒說明書行免疫組織化學(xué)染色檢測CGRP及受體(CGRPR-1)表達(dá)情況，用已知CGRP及CGRPR-1陽性表達(dá)的切片作為陽性對照，PBS液代替一抗液作為陰性對照，光鏡下觀察CGRP及CGRPR-1陽性表達(dá)部位與表達(dá)強(qiáng)弱并拍照。采用HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)對結(jié)果進(jìn)行定量分析，應(yīng)用平均積分吸光度對CGRP及CGRPR-1表達(dá)程度進(jìn)行定量檢測分析，平均光度值越高，表示該部位CGRP及CGRPR-1表達(dá)越強(qiáng)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組家兔的骨痂BMD值

造模1周后，兩組家兔骨痂BMD差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，2、3及4周后，治療組家兔的新生骨區(qū)BMD均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組家兔的脛骨BMD值

2.2 兩組家兔的骨痂BMC值

造模1周后，兩組家兔骨痂BMC差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，2、3及4周后，治療組家兔的新生骨區(qū)骨痂BMC高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.3 兩組家兔骨生物力學(xué)性能

造模4周后，三點(diǎn)彎曲檢測結(jié)果顯示，治療組脛骨的彈性載荷、彎曲能量、斷裂載荷及剛性系數(shù)比模型組明顯上升(P<0.05)，見表3。

表2 兩組家兔的脛骨BMC值

表3 兩組家兔脛骨生物力學(xué)性能

2.4 兩組家兔的新生骨組織CGRP表達(dá)

造模1周后，兩組家兔新生骨組織CGRP表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，2、3及4周后，治療組家兔的新生骨組織CGRP表達(dá)均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4及圖1。

2.5 兩組家兔的新生骨組織CGRPR-1表達(dá)

表4 兩組家兔的新生骨組織CGRP表達(dá)

圖1 造模后CGRP的陽性表達(dá)

造模1周后，兩組家兔新生骨組織CGRPR-1表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，2、3及4周后，治療組家兔的新生骨組織CGRPR-1表達(dá)均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表5及圖2。

3 討論

脛骨骨折是常見的骨折類型之一，通過外科手術(shù)可對脛骨骨折進(jìn)行有效治療，但因脛骨解剖結(jié)構(gòu)獨(dú)特，缺乏有效的軟組織和血運(yùn)保護(hù)，易造成明顯骨缺損，術(shù)后患者愈合較慢，修復(fù)過程復(fù)雜[6-7]。受病情延誤、傷勢嚴(yán)重、治療方法不當(dāng)及護(hù)理失誤等因素影響，脛骨骨折患者會發(fā)生骨缺損等并發(fā)癥，從而造成骨折不愈合，需要進(jìn)行二期手術(shù)促進(jìn)其愈合，不僅增加了患者及家屬的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，還嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量[8-9]。本研究以新西蘭兔為研究對象，其與人類骨組織代謝速率相似，造模手術(shù)時(shí)損傷組織較少，術(shù)后并發(fā)癥少，可減少模型的其他影響因素，更利于研究電刺激對脛骨骨缺損家兔模型骨組織愈合的影響。

表5 兩組家兔的新生骨組織CGRPR-1表達(dá)

圖2 造模后CGRPR-1的陽性表達(dá)

電刺激是一種電療方法，是將低頻脈沖電流輸入人體特定部位進(jìn)行治療的一種手段，具有無創(chuàng)傷、無痛的優(yōu)點(diǎn)，是骨科傳統(tǒng)的有效治療手段之一[10-11]。本研究結(jié)果顯示，造模2、3及4周后，治療組家兔的新生骨區(qū)BMD和BMC均高于模型組。這是因?yàn)橥ㄟ^局部微電流刺激，可使家兔脛骨骨折區(qū)域產(chǎn)生各種“感應(yīng)電產(chǎn)物”，從而有效激活成骨細(xì)胞，促進(jìn)破骨細(xì)胞吸收，使骨形成大于骨吸收，利于骨形成，加快骨塑形，增加骨痂形成，促進(jìn)骨修復(fù)。

骨組織的生物力學(xué)是生物物理學(xué)的一個(gè)重要分支，通過對骨組織的力學(xué)性能進(jìn)行檢測，可有效反應(yīng)骨組織的整體性能[12-13]。本研究造模后4周，三點(diǎn)彎曲檢測結(jié)果顯示，治療組脛骨的彈性載荷、彎曲能量、斷裂載荷及剛性系數(shù)比模型組明顯上升，這可能是因?yàn)榻?jīng)過局部微電流刺激，可刺激破骨細(xì)胞早期前提分化和增殖，促進(jìn)骨吸收，加快骨重塑，增加骨痂形成速度，隨著骨密度增高及骨礦物含量的增加，其力學(xué)性能測試結(jié)果也變大，從而維持骨的正常生物力學(xué)性能，最終加快骨折愈合的速度和質(zhì)量[14]。

脛骨缺損的修復(fù)過程十分復(fù)雜，會受到各種因素的影響，如激素、多種細(xì)胞因子及神經(jīng)肽等因素調(diào)控[15-16]。感覺神經(jīng)和自主神經(jīng)會分泌神經(jīng)肽類物質(zhì)影響骨組織的代謝，其中CGRP是影響成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的關(guān)鍵神經(jīng)肽，并可與CGRPR-1結(jié)合參與調(diào)節(jié)骨生長及骨重塑過程[17-18]。骨折愈合最根本的因素是局部血液供應(yīng)，CGRP具有很強(qiáng)的血管調(diào)節(jié)活性，可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，促進(jìn)血管生成，從而參與骨折早期修復(fù)及晚期塑形[19-20]。本研究結(jié)果顯示，造模2、3及4周后，治療組家兔的新生骨組織CGRPR-1表達(dá)均高于模型組。這可能是因?yàn)橥ㄟ^局部微電流刺激治療，可有效刺激骨膜上豐富的感覺神經(jīng)末梢纖維，提高神經(jīng)元的興奮性，增加CGRP的分泌釋放，并激活膠質(zhì)細(xì)胞上CGRPR-1，促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞增殖，神經(jīng)突起生長及加強(qiáng)軸漿運(yùn)輸能力，改善神經(jīng)損傷后其支配區(qū)局部的血供情況，調(diào)節(jié)骨的生長、修復(fù)及改建。

綜上所述，通過對兔脛骨骨缺損部位進(jìn)行局部微電流刺激，可提高降鈣素基因相關(guān)肽表達(dá)，促進(jìn)骨缺損的愈合，改善骨痂質(zhì)量。后期應(yīng)用于臨床治療將促進(jìn)骨缺損患者的康復(fù)，值得臨床推廣與應(yīng)用。