敲除Rbpj降低小鼠子宮蛻膜對(duì)孕酮的敏感性

謝 娟，康勁文，劉曉征，顏婉錕，蘇仁偉 (華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

哺乳動(dòng)物通過妊娠為發(fā)育期的胎兒提供穩(wěn)定環(huán)境以保護(hù)胎兒的生長(zhǎng)。孕酮(progesterone,P4)是維持雌性哺乳動(dòng)物妊娠最重要的甾類激素之一，在妊娠早期，維持妊娠所需的P4幾乎全部由卵巢黃體分泌，而妊娠后期P4的主要來源則為發(fā)育完成的胎盤[1]。P4通過多種途徑執(zhí)行其維持妊娠的功能，包括促進(jìn)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化、將子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)化為接受態(tài)以接受胚胎的著床、抑制母體免疫系統(tǒng)對(duì)胎兒的免疫排斥以及抑制子宮肌層的收縮等[2]。蛻膜化是指子宮基質(zhì)細(xì)胞由成纖維狀分化為上皮樣并成為具有分泌功能的蛻膜細(xì)胞的過程，是妊娠的成功建立所必須。蛻膜細(xì)胞可為著床后的胚胎發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，調(diào)節(jié)胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵入和胎盤形成，蛻膜還可保護(hù)胎兒免受母體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)的侵害。不同程度的蛻膜化受損都會(huì)導(dǎo)致胚胎著床失敗、早期妊娠丟失、流產(chǎn)或早產(chǎn)[3]。

重組信號(hào)結(jié)合蛋白Jκ(recombination signal binding protein Jκ,Rbp-Jκ,由Rbpj基因編碼)是Notch信號(hào)通路的核心轉(zhuǎn)錄因子。哺乳動(dòng)物的Notch信號(hào)通路由Notch1～4四個(gè)受體、Delta-like1,3,4和Jagged1,2五個(gè)配體以及核心轉(zhuǎn)錄因子Rbp-Jκ和其他共激活因子組成[4]。當(dāng)與相鄰細(xì)胞的配體蛋白結(jié)合后，Notch受體接受2次切割后釋放其C端裂解產(chǎn)物胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域(intracellular domain,ICD)，該片段是Notch的活性形式，被釋放后能夠立即轉(zhuǎn)位到核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子Rbp-Jκ結(jié)合并將其轉(zhuǎn)換為轉(zhuǎn)錄激活因子，從而啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[5]。Notch信號(hào)通路在雌性哺乳動(dòng)物妊娠過程中起著重要作用，在小鼠妊娠前期的子宮基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化過程中，Notch1受體表達(dá)增加，抑制Notch信號(hào)通路會(huì)使蛻膜反應(yīng)受到影響，并誘導(dǎo)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)[6]。除此之外，Notch信號(hào)通路還與P4相互調(diào)節(jié)，小鼠子宮中Notch1信號(hào)的異常激活導(dǎo)致P4受體(progesterone receptor,Pgr)的基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度增加并引起Pgr表達(dá)的降低和不孕[7]。在人子宮內(nèi)膜異位癥病人的異位子宮內(nèi)膜中，Notch1的異常高表達(dá)與PGR表達(dá)量的降低具有相關(guān)性，可能導(dǎo)致內(nèi)異癥婦女的子宮內(nèi)膜對(duì)P4處理的抵抗[8]。

Rbpj在小鼠胚胎著床和蛻膜化過程中也具有重要的作用，子宮特異性敲除Rbpj會(huì)導(dǎo)致著床、妊娠和產(chǎn)后修復(fù)異常，而特異性敲除滋養(yǎng)層細(xì)胞中的Rbpj則會(huì)導(dǎo)致絨毛膜尿囊形態(tài)發(fā)生異常和滋養(yǎng)層細(xì)胞分化不良[9-11]。本研究使用子宮特異性敲除Rbpj基因小鼠，結(jié)合人工誘導(dǎo)蛻膜化模型試驗(yàn)，探討Rbpj影響雌性生殖的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物將Pgr啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Cre酶表達(dá)的PgrCre/+小鼠(由貝勒醫(yī)學(xué)院贈(zèng)予)與在Rbpj基因21～23外顯子兩側(cè)添加了Flox位點(diǎn)的RbpjF/F小鼠(由東京大學(xué)贈(zèng)予)雜交，獲得子宮特異性敲除Rpbj的PgrCre/+RbpjF/F(簡(jiǎn)寫為Rbpjd/d)或作為對(duì)照的Pgr+/+RbpjF/F(簡(jiǎn)寫為Rbpjf/f小鼠。所有小鼠均在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房中飼養(yǎng)，自由取食飲水，光照(7:00至19:00)和黑暗(19:00至次日7:00)各12 h，室內(nèi)溫度維持在22～24℃，相對(duì)濕度維持在60%～70%。

1.2 緩釋管的制作與孵育參考COHEN等[12]所述，并在此基礎(chǔ)上修改制備P4緩釋管。緩釋管由1.5和2.5 cm 2種不同長(zhǎng)度的硅橡膠管(內(nèi)徑1.57 mm，外徑3.18 mm,Dow Corning,Midland,MI,USA)制備。該硅膠管的管壁上有細(xì)小空隙，可以維持釋放管中的藥物穩(wěn)定。內(nèi)套管為普通聚乙烯管(兩端共插入0.5 cm)。每個(gè)緩釋管的有效長(zhǎng)度，即兩端聚乙烯管之間的長(zhǎng)度為有效釋放長(zhǎng)度，為1或2 cm。稱取一定量的P4(Sigma)到芝麻油中配成P4質(zhì)量濃度為250或500 g/L的白色油-P4混懸液。用1 mL注射器吸取混勻后的混懸液，通過一端的聚乙烯管注入硅膠管中，直到填充整個(gè)長(zhǎng)度的硅橡膠和聚乙烯管且無氣泡，將從硅橡膠管兩端突出的聚乙烯末端熱密封、備用。使用前將緩釋管在90%乙醇中清洗干凈，再用蒸餾水清洗，在37℃,1% FBS(1×PBS配制，pH 7.35)中孵育過夜(≥16 h)；小鼠麻醉后，緩釋管埋植入背部皮下。

1.3 人工誘導(dǎo)蛻膜化蛻膜化模型參考FIONA等[13]方法并稍作修改，如圖1所示。將成年的Rbpjd/d雌性小鼠和Rbpjf/f雌性小鼠于6～7周齡切除兩側(cè)卵巢后繼續(xù)飼養(yǎng)2周，以清除體內(nèi)殘余激素。第1～3天每天上午9:00皮下注射0.1 mL的雌二醇(17β-estradiol,E2,Sigma,100 μg/0.1 L)，第6天上午8:30將小鼠麻醉后在背部皮下埋植緩釋管，之后連續(xù)3 d進(jìn)行皮下注射0.1 mL的E2(6.7 μg/0.1 L)。第8天下午15:00(當(dāng)天注E2之后6 h)進(jìn)行單側(cè)子宮人工誘導(dǎo)蛻膜化手術(shù)，從小鼠背部一側(cè)開口(非緩釋管埋植側(cè))，暴露子宮角，使用7號(hào)注射針頭在系膜對(duì)側(cè)刮擦6～8次，縫合肌肉層和皮膚的手術(shù)創(chuàng)口；另一側(cè)作為對(duì)照。于術(shù)后72或120 h將小鼠麻醉，采集血液，再將小鼠經(jīng)頸椎脫臼處死，取出子宮，拍照并取材固定。

圖1 人工誘導(dǎo)蛻膜化模型示意圖

1.4 基因型鑒定剪尾于小鼠出生后的第21～23天進(jìn)行(PND21～23)。記錄小鼠出生信息，給小鼠打上耳標(biāo)，剪掉5～10 mm的鼠尾組織，保存用于基因型鑒定。

用鼠尾溶解液(tail dissolve buffer,TDB)溶解鼠尾組織。TDB配制方法如下：KCl 0.745 5 g,Tris 0.242 3 g,Triton-X100 200 μL,dH2O定容至200 mL(pH調(diào)至9.0)。按每根鼠尾100 μL TDB配置裂解體系，體系中加入2 μL、20 g/L的蛋白酶K，終質(zhì)量濃度為0.4 g/L。恒溫振蕩儀60℃振蕩加熱3 h，轉(zhuǎn)為94℃，15 min后停止；將混懸液室溫13 000 r/min 離心5 min，取上清液(鼠尾DNA樣品)轉(zhuǎn)入新的離心管中，-20℃保存?zhèn)溆?提取DNA,基因型鑒定 PCR引物見表1。

表1 基因型鑒定PCR引物序列

1.5 HE染色與免疫組織化學(xué)小鼠頸椎脫臼法處死后收集子宮，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片厚度5 μm。切片經(jīng)脫蠟復(fù)水后進(jìn)行常規(guī)的HE染色。免疫組化脫蠟復(fù)水步驟同HE染色，后對(duì)切片進(jìn)行抗原修復(fù)，10%馬血清封閉后與Rbpj抗體(1∶100)孵育過夜，再進(jìn)行二抗孵育和DAB染色，脫水封片。

1.6 血清P4濃度的檢測(cè)小鼠麻醉、眼球采血，4℃過夜后離心取上層血清，分裝在離心管中并標(biāo)記小鼠信息，-80℃儲(chǔ)存，血清樣本P4濃度由上海研輝生物科技有限公司測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 確認(rèn)小鼠子宮中Rbpj的敲除成功

2.1.1基因型鑒定 以4只小鼠的鑒定結(jié)果為例，PgrCre/+和Rbpj基因型鑒定結(jié)果如圖2所示，在PgrCre/+基因型PCR鑒定中，只擴(kuò)增出WT(302 bp)條帶而無Cre(522 bp)條帶的為基因型Pgr+/+(A0462和A0495)，同時(shí)含有Cre條帶和WT條帶的基因型為PgrCre/+(A0508和A0512)。在Rbpj基因型的擴(kuò)增結(jié)果中顯示，4只鼠都擴(kuò)增出Rbpj-Flox條帶(600 bp)，而無Rbpj-WT條帶(500 bp)，證實(shí)這些小鼠的基因型均為RbpjF/F。綜上所述，A0462和A0495的基因型為Pgr+/+RbpjF/F(Rbpjf/f)，作為對(duì)照組；其余的基因型為PgrCre/+RbpjF/F(Rbpjd/d)，為子宮特異性敲除Rbpj小鼠，將其作為試驗(yàn)組。

A.PgrCre/+小鼠的基因型鑒定；B.RbpjF/F小鼠的基因型鑒定 M.DL1000 DNA Marker;1.A0462;2.A0495;3.A0508;4.A0512;5.陰性對(duì)照

2.1.2Rbpj轉(zhuǎn)錄因子在敲除鼠子宮中表達(dá)量降低 將確認(rèn)過基因型的雌性小鼠與已知可育的雄性小鼠合籠，以見到陰道栓為妊娠第1天。免疫組織化學(xué)結(jié)果如圖3所示，在妊娠第8天的子宮中，相比于Rbpjf/f小鼠，Rbpjd/d小鼠Rbp-Jκ的蛋白水平表達(dá)量在胚胎周圍的基質(zhì)中明顯降低，證明子宮特異性敲除Rbpj成功。

A.Rbpjf/f小鼠子宮；B.Rbpjd/d小鼠子宮(500 μm)

2.2 子宮特異性敲除Rbpj小鼠對(duì)P4敏感性的影響首先測(cè)試能夠維持野生型小鼠蛻膜化所需的正常P4劑量下Rbpjd/d小鼠對(duì)人工誘導(dǎo)蛻膜化的響應(yīng)能力。結(jié)果表明，在此劑量下(1 cm+250 g/L P4)，雖然對(duì)照組Rbpjf/f小鼠的子宮可以正常響應(yīng)人工誘導(dǎo)蛻膜化刺激(圖4A)，但Rbpjd/d小鼠子宮在術(shù)后120 h已無法維持蛻膜化狀態(tài)(圖4B)。Rbpjd/d小鼠的蛻膜側(cè)子宮相較Rbpjf/f小鼠的同側(cè)子宮細(xì)且顏色更深；HE染色結(jié)果顯示，Rbpjf/f小鼠蛻膜仍然完整，而Rbpjd/d小鼠的蛻膜組織已經(jīng)開始脫落，脫落組織剝落進(jìn)子宮腔中，壞死伴有出血現(xiàn)象(圖4)。術(shù)后72 h的蛻膜化情況如圖5A所示，在1 cm+250 g/L P4劑量組，與對(duì)照側(cè)子宮角相比，Rbpjf/f小鼠蛻膜側(cè)子宮角體積腫大且充血呈粉紅色；相比之下，Rbpjd/d小鼠蛻膜側(cè)子宮角體積明顯小于對(duì)照組，且有部分敲除鼠未成功蛻膜化。對(duì)蛻膜側(cè)/對(duì)照側(cè)子宮角的重量比分析發(fā)現(xiàn)，Rbpjd/d小鼠的蛻膜化程度顯著小于Rbpjf/f小鼠(圖5A)。HE染色顯示Rbpjf/f小鼠子宮的蛻膜明顯大于敲除鼠的子宮蛻膜；在Rbpjf/f小鼠子宮中，被蛻膜化組織包裹的上皮部分完整呈柱狀(圖5C)。而在敲除鼠中，系膜側(cè)附近的子宮基質(zhì)細(xì)胞有較大部分并沒有發(fā)生蛻膜化，腔上皮完整，這可能是造成子宮體積偏小的原因之一(圖5C)。此外，與Rbpjf/f小鼠(n=106)對(duì)人工誘導(dǎo)蛻膜化刺激100%的響應(yīng)率相比，Rbpjd/d小鼠(n=100)的蛻膜化響應(yīng)率僅為88%，低于對(duì)照組的成功率(圖5B)。

2.3 高劑量P4可以部分挽救Rbpj敲除導(dǎo)致的蛻膜化能力下降為了測(cè)試高劑量的P4是否可以挽救Rbpj敲除導(dǎo)致的蛻膜化能力下降，將試驗(yàn)所用P4質(zhì)量濃度提高為500 g/L，并且將緩釋管的有效長(zhǎng)度提高為2 cm(2 cm+500 g/L P4)。結(jié)果顯示，在人工誘導(dǎo)蛻膜化術(shù)后72 h，Rbpjd/d小鼠的蛻膜化程度和蛻膜重量仍然顯著低于Rbpjf/f小鼠(圖5F～G)。但是，在提高P4劑量后，2種基因型小鼠蛻膜重量之間的差異明顯變小(圖5E,H)。在術(shù)后120 h，與Rbpjf/f小鼠相比，Rbpjd/d小鼠子宮的蛻膜化程度仍較低，且出現(xiàn)大面積壞死和出血，與基底層界限清晰，僅在系膜側(cè)可見小部分形態(tài)完整的蛻膜化細(xì)胞，表明中心蛻膜組織即將從邊緣脫落(圖5C,D)。但與低劑量P4組相比，高劑量P4組Rbpjd/d小鼠子宮蛻膜化程度已有明顯改善(圖4B,D)。無論是低劑量還是高劑量P4組，緩釋管在試驗(yàn)結(jié)束取出時(shí)仍存有大量P4的殘余，證明Rbpjd/d小鼠蛻膜化的維持與P4的總量無關(guān)，而與緩釋管的有效長(zhǎng)度有關(guān)，隨單位時(shí)間內(nèi)釋放的P4量增大，更有助于敲除鼠蛻膜化的維持。

A,B.1 cm+250 g/L P4條件下的子宮；C,D.2 cm+500 g/L P4條件下的子宮;A,C.Rbpjf/f小鼠;B,D.Rbpjd/d小鼠；(100 μm)

A,C,D,E.1 cm+250 g/L P4條件下子宮；F～H.2 cm+500 g/L P4條件下子宮；C,F.Rbpjf/f小鼠；D,G.Rbpjd/d小鼠；(100 μm)；B.蛻膜化成功率

2.3.1不同P4劑量和基因型對(duì)蛻膜側(cè)與對(duì)照側(cè)子宮重量比的影響 進(jìn)一步對(duì)所有試驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠兩側(cè)子宮角的質(zhì)量比進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在術(shù)后120(圖6A)和72 h(圖6B)，相同劑量P4下Rbpjd/d小鼠與Rbpjf/f小鼠相比，子宮重量比都有顯著降低。然而，不同劑量P4組中的Rbpjf/f小鼠子宮質(zhì)量比值無明顯差異，但Rbpjd/d小鼠在術(shù)后120 h時(shí)在高劑量P4組的蛻膜程度顯著高于低劑量組(圖6A)(P<0.05)。在500 g/L P4中，敲除鼠(2 cm緩釋管)和對(duì)照鼠(1 cm緩釋管)的蛻膜化程度較接近(圖6C)，進(jìn)一步證明敲除鼠對(duì)P4的依賴性更強(qiáng)，高劑量的P4可以挽救因Rbpj敲除導(dǎo)致的蛻膜化程度降低。

A.術(shù)后120 h；B.術(shù)后72 h；C.500 g/L P4，不同長(zhǎng)度緩釋管，術(shù)后72 h

2.3.2Rbpjd/d小鼠對(duì)P4的消耗量 對(duì)小鼠血清中的P4質(zhì)量濃度進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，2 cm+500 g/L P4在術(shù)后120 h時(shí)，敲除鼠血清中的P4質(zhì)量濃度顯著低于對(duì)照鼠血清中的質(zhì)量濃度(圖7)，這表明Rbpj敲除鼠可能對(duì)P4需求更大。

圖7 血清中P4濃度

3 討論

3.1Rbpj敲除小鼠對(duì)蛻膜化的反應(yīng)能力下降經(jīng)典的Notch信號(hào)通路通過其核心轉(zhuǎn)錄因子Rbpj激活下游靶基因來介導(dǎo)重要的細(xì)胞分化和個(gè)體發(fā)育功能，包括器官的自我更新[14]。全身性Rbpj缺失會(huì)導(dǎo)致妊娠早期胚胎致死，而子宮特異性敲除Rbpj小鼠則因胚胎著床角度異常而導(dǎo)致妊娠的丟失[9,15]。此外，子宮特異性敲除Rbpj小鼠的子宮內(nèi)膜產(chǎn)后修復(fù)能力受到顯著影響，從而導(dǎo)致繼發(fā)性不孕[10]。

有研究表明，Rbpj敲除小鼠的子宮對(duì)人工誘導(dǎo)蛻膜化的響應(yīng)能力下降，但該研究采用皮下注射方式給予P4，不能精確的控制不同小鼠間單位時(shí)間內(nèi)釋放到血液中的P4劑量[16]。本研究中使用緩釋管方式，通過控制有效長(zhǎng)度精確地控制單位時(shí)間內(nèi)釋放到血液中的P4劑量，使其在不同小鼠之間盡量保持一致，同時(shí)也能保證P4穩(wěn)定釋放，避免皮下注射P4帶來的血清P4濃度的劇烈波動(dòng)。研究結(jié)果表明，在相同P4劑量下，無論是高劑量還是低劑量P4組，Rbpj敲除小鼠的子宮對(duì)人工誘導(dǎo)蛻膜化的響應(yīng)能力都顯著低于對(duì)照組小鼠，與上述的研究結(jié)果一致。本研究的每種基因型小鼠的樣品數(shù)量超過100只，結(jié)果更接近真實(shí)情況。本研究還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)敲除小鼠蛻膜化能力受損的原因是系膜對(duì)側(cè)部分基質(zhì)細(xì)胞未能成功發(fā)生蛻膜化。

3.2Rbpj敲除影響小鼠P4受體表達(dá)和對(duì)P4的利用P4對(duì)子宮內(nèi)膜蛻膜化的建立和維持至關(guān)重要，P4受體Pgr及P4靶基因如Ihh和Hoxa10等敲除小鼠均表現(xiàn)為蛻膜化能力的喪失或下降[17-18]。在妊娠早期，卵巢黃體是P4的主要來源。而將黃體與Notch信號(hào)通路抑制劑DAPT一起孵育時(shí)，P4合成量減少，表明Notch信號(hào)通路對(duì)P4的合成至關(guān)重要[20]。此外，在子宮中過度激活Notch信號(hào)通路還會(huì)導(dǎo)致P4受體Pgr的下調(diào)，說明Notch信號(hào)通路還可以通過調(diào)節(jié)Pgr的表達(dá)影響P4信號(hào)通路的活性[8]。人子宮成纖維細(xì)胞的體外試驗(yàn)研究中證實(shí)，P4處理能夠促進(jìn)Notch1受體蛋白胞質(zhì)內(nèi)區(qū)的剪切，從而誘導(dǎo)其活性形式N1ICD的上調(diào)[21]。諸多研究表明，無論是在卵巢還是子宮中，Notch信號(hào)通路與P4以及P4受體之間存在一定的聯(lián)系，在哺乳動(dòng)物的蛻膜化和妊娠過程中相互調(diào)節(jié)。

在先前的研究中，Rbpj敲除小鼠蛻膜中P4受體Pgr的表達(dá)量下調(diào)，這很可能是敲除小鼠在相同劑量的P4作用下蛻膜化能力下降的原因之一[16]。除此之外，研究結(jié)果還表明，在給予同樣劑量和有效長(zhǎng)度的P4緩釋管的情況下，Rbpj敲除小鼠的血清P4濃度顯著低于對(duì)照小鼠，表明作為P4的重要靶器官，子宮內(nèi)膜中的Rbp-Jκ對(duì)于P4的代謝也有一定的影響。但是，該影響的具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的探索。

3.3 高劑量P4可部分挽救Rbpj敲除導(dǎo)致的蛻膜化能力下降研究表明，P4的劑量對(duì)子宮內(nèi)膜蛻膜化的維持至關(guān)重要，在不同P4水平下，子宮蛻膜崩解出血的時(shí)間隨P4水平的升高而延遲[22]。本研究中的緩釋管給藥法保證單位時(shí)間內(nèi)釋放到小鼠體內(nèi)的P4水平與緩釋管的有效長(zhǎng)度呈線性正相關(guān)，并證明低劑量的P4對(duì)于對(duì)照組子宮內(nèi)膜的蛻膜化維持已經(jīng)足夠，但是在敲除鼠中子宮內(nèi)膜蛻膜化無法維持到120 h。而提高P4劑量則可以有效的緩解因Rbpj敲除引起的蛻膜化損傷和維持障礙。但是在高劑量P4組，敲除小鼠子宮內(nèi)膜的蛻膜化程度依然低于對(duì)照組小鼠。這些研究結(jié)果表明，提高P4劑量可以部分挽救因缺失Rbp-Jκ造成的小鼠子宮內(nèi)膜對(duì)人工誘導(dǎo)蛻膜化能力降低，但不能完全挽救。進(jìn)一步分析表明，雖然無論使用1還是2 cm的緩釋管，在相同P4劑量下敲除小鼠的蛻膜化反應(yīng)程度都顯著低于對(duì)照小鼠，但敲除小鼠在高劑量P4情況下的蛻膜化程度與對(duì)照小鼠在低劑量P4情況下的較為接近，進(jìn)一步證明相對(duì)于對(duì)照小鼠，敲除小鼠蛻膜對(duì)P4的依賴性更強(qiáng)，但敏感性更低。

綜上所述，Notch信號(hào)通路核心轉(zhuǎn)錄因子Rbpj缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠的蛻膜化能力下降，蛻膜子宮對(duì)P4的敏感性降低且具有劑量依賴性，可以通過提高P4劑量的方式加以部分挽救。其詳細(xì)調(diào)節(jié)機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究和探索。