經(jīng)支氣管鏡防污染采樣刷檢在兒童難治性肺炎病原學(xué)診斷中的價(jià)值

吳振波，蔡志明，黃寶瑤，孟雪，陳泳言，李秋波，陳卓杰，張麗霞，鄧籌芬

（江門(mén)市婦幼保健院1.兒科；2.檢驗(yàn)科，廣東 江門(mén)529000）

肺炎是兒童最常見(jiàn)的疾病之一，也是目前全球5歲以下兒童死亡的主要原因之一[1]。近年來(lái)，隨著兒童社區(qū)獲得性肺炎（community acquire pneumonia，CAP）診療的不斷規(guī)范，我國(guó)兒童CAP診療水平有了明顯進(jìn)步，經(jīng)系統(tǒng)規(guī)范治療的大部分CAP均可治愈，但仍有部分病情不能控制，甚至進(jìn)展為難治性肺炎（refractory pneumonia，RP）[2]。RP具有起病急、進(jìn)展快、病情重、常規(guī)治療效果差、并發(fā)癥多和死亡率高的特點(diǎn)，臨床治療十分棘手，如何盡早獲得準(zhǔn)確的病原體信息、并使用有效的抗菌藥物是治療的關(guān)鍵[3-5]。

本研究將經(jīng)支氣管鏡防污染采樣刷檢培養(yǎng)與傳統(tǒng)的痰培養(yǎng)和支氣管肺泡灌洗（bronchoalveolar lavage，BAL）培養(yǎng)進(jìn)行比較分析，以尋找有效的兒童RP 病原學(xué)診斷采樣方法，從而提高病原學(xué)診斷的準(zhǔn)確性和敏感性，為臨床抗菌藥物的使用提供參考依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

回顧性分析2019年9月－2020年5月90例于本院兒內(nèi)科住院的RP 患兒的臨床資料。其中，男52例，女38 例；年齡0～14 歲，嬰幼兒（0～3 歲）58例，學(xué)齡前兒童（3～6歲）21例，學(xué)齡期兒童（＞6歲）11例。納入標(biāo)準(zhǔn)：血清降鈣素原（procalcitonin，PCT）、C反應(yīng)蛋白（c-reaction protein，CRP）、白細(xì)胞計(jì)數(shù)（white blood cell，WBC）和/或中性粒細(xì)胞百分比等感染指標(biāo)升高，結(jié)合臨床考慮存在細(xì)菌感染；同時(shí)符合以下至少1 項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)[6]：①病程在3 周以上，且療效不佳；②常規(guī)治療1周后，癥狀、體征、X線胸片或胸部CT 等均無(wú)明顯好轉(zhuǎn)跡象；③病程在1 周以內(nèi)，但X 線胸片或胸部CT 有明顯實(shí)變或不張。所有患者均排除先天性支氣管、血管畸形和呼吸系統(tǒng)腫瘤等疾病。所有患兒均符合可彎曲支氣管鏡檢查指征[7]，家屬于術(shù)前簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

90 例患兒均在住院期間先后進(jìn)行痰培養(yǎng)、BAL取材和經(jīng)支氣管鏡防污染采樣刷檢取材。

1.2.1 設(shè)備與耗材①Olympus 公司生產(chǎn)的EVIS LUCERA BF-260系列支氣管鏡（型號(hào)：BF-XP260F，外徑2.8 mm，工作孔道為1.2 mm），Seesheen 公司生產(chǎn)的QG 系列電子支氣管鏡（型號(hào)：QG 3320，外徑3.1 mm，工作孔道為1.2 mm）；②杭州富陽(yáng)精銳醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)的單套管一次性使用毛刷（刷頭構(gòu)造為尼龍刷，外套單層塑料管，有效長(zhǎng)度1 200 mm，適用內(nèi)鏡通道≥1.2 mm），毛刷先端開(kāi)口用相對(duì)分子質(zhì)量為4 000 的聚乙二醇滅菌后封堵、栓塞；③一次性吸痰管、一次性痰液收集器、吸痰器。

1.2.2 完善術(shù)前準(zhǔn)備根據(jù)《中國(guó)兒科可彎曲支氣管鏡術(shù)指南（2018年版）》[7]，完善以下術(shù)前準(zhǔn)備：①輸血前檢查；②出、凝血時(shí)間；③心肝腎功能；④心電圖；⑤患兒監(jiān)護(hù)人簽署支氣管鏡診療知情同意書(shū)；⑥根據(jù)胸部CT 等影像學(xué)資料充分評(píng)估肺部情況，擬定刷檢及灌洗的取材部位；⑦做好術(shù)前禁食。

1.2.3 取材方法①痰培養(yǎng)：使用一次性吸痰器，在無(wú)菌操作下負(fù)壓抽取咽喉部分泌物至痰液收集器，常溫下立即送檢；②經(jīng)支氣管鏡防污染采樣刷檢：患兒局麻，操作者常規(guī)使用支氣管鏡檢查；從一側(cè)鼻孔進(jìn)鏡（一般為右側(cè)），檢查順序?yàn)橄冉?cè)后患側(cè)，到達(dá)病變部位后，對(duì)局部病變進(jìn)行觀察，再固定內(nèi)鏡于擬取材位置，助手持聚乙二醇封堵后的單套管毛刷經(jīng)支氣管鏡工作孔道進(jìn)入，毛刷伸出內(nèi)鏡先端后，緩慢送入取材部位，直至遇到阻力不能繼續(xù)深入時(shí)，再回退1.0～2.0 cm，通過(guò)毛刷手柄推出毛刷，過(guò)程中其前端的聚乙二醇保護(hù)塞將被頂?shù)簦缓笥檬直倏孛⒎磸?fù)伸縮3次，縮回毛刷至套管內(nèi)，再?gòu)闹夤茜R工作孔道中退出，將毛刷刷頭部分伸出并置入葡萄糖腦心浸液肉湯管中，充分震蕩，使標(biāo)本與毛刷脫離，取出毛刷，無(wú)菌密封肉湯試管，常溫下立即送檢；③BAL[7]：完成毛刷取材后，局麻下用支氣管鏡對(duì)取材后的病變部位進(jìn)行灌洗，以37℃無(wú)菌生理鹽水注入[1 mL/（kg·次）]，同時(shí)評(píng)估該肺段回流和通氣情況，然后以100～200 mmHg （1 mmHg=0.133 kPa）的負(fù)壓將液體回收至一次性無(wú)菌痰液收集器中，常溫下立即送檢。

1.2.4 標(biāo)本處理①痰培養(yǎng)：標(biāo)本在無(wú)菌條件下四分區(qū)劃線法分別接種至血平板、巧克力平板和沙保氏平板；②經(jīng)支氣管鏡防污染采樣刷檢物培養(yǎng)：將含標(biāo)本的葡萄糖腦心浸液肉湯培養(yǎng)管置于37℃普通恒溫孵育箱，待24 h后，用無(wú)菌四分區(qū)劃線法分別接種至血平板、巧克力平板和沙保氏平板；③BAL培養(yǎng)：離心灌洗液，去上清，混勻沉淀，無(wú)菌四分區(qū)劃線法分別接種至血平板、巧克力平板及沙保氏平板。

1.2.5 細(xì)菌鑒定3 種標(biāo)本完成上述步驟后，均置于37℃的5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，用VITEK MS 質(zhì)譜儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定，VITEK 2 COMPACT細(xì)菌鑒定藥敏儀結(jié)合紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[8-11]。用校正的接種環(huán)換轉(zhuǎn)成閾值，分離菌陽(yáng)性截?cái)帱c(diǎn)設(shè)定：經(jīng)支氣管鏡防污染采樣刷檢物培養(yǎng)≥103CFU/mL；BAL培養(yǎng)≥104CFU/mL；痰培養(yǎng)分離出致病菌或條件致病菌，若菌落數(shù)≥106CFU/mL，則認(rèn)定為病原菌，若菌落數(shù)達(dá)不到上述指標(biāo)或培養(yǎng)出的菌株與臨床表現(xiàn)不相符，又不能排除污染可能，則予以重復(fù)送檢，如兩次送檢均培養(yǎng)出菌落數(shù)接近的相同菌株，也認(rèn)定為病原菌。但在某些情況下，如：疾病早期在病原體采樣前使用過(guò)抗菌素，有可能影響到培養(yǎng)的結(jié)果，會(huì)出現(xiàn)假陰性。

1.3 臨床療效判定標(biāo)準(zhǔn)

參照《抗菌藥物臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則（2015版）》[12]，制定評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：①痊愈或顯效：癥狀、體征均完全或明顯消失，如肺部啰音、咳嗽、咳痰和氣促等癥狀明顯減輕或消失，體溫正常，呼吸音強(qiáng)度恢復(fù)正常，復(fù)查血小板壓積（plateletcrit，PCT）、CRP和（或）WBC等感染指標(biāo)恢復(fù)正常，X線檢查滲出影完全或明顯吸收，肺不張復(fù)張；②有效：癥狀、體征均好轉(zhuǎn)，肺部啰音、咳嗽、咳痰和氣促等癥狀減輕，體溫正常，呼吸音強(qiáng)度增強(qiáng)，復(fù)查PCT、CRP 和（或）WBC 等感染指標(biāo)好轉(zhuǎn)，X 線檢查滲出影較前吸收好轉(zhuǎn)，肺不張減輕；③無(wú)效：癥狀、體征無(wú)改善甚至惡化，復(fù)查PCT、CRP和（或）WBC等感染指標(biāo)無(wú)改變或加重，X線檢查滲出影及肺不張加重。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

選用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料用例（%）表示，行χ2檢驗(yàn)，P＜0.01 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3種取材方法致病菌培養(yǎng)陽(yáng)性率比較

90 例標(biāo)本培養(yǎng)，經(jīng)支氣管鏡防污染采樣刷檢、BAL、痰培養(yǎng)3種取材方法的細(xì)菌培養(yǎng)總陽(yáng)性率分別為60.0%（54/90）、32.2%（29/90）和14.4%（13/90），3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=41.41，P＜0.01）。痰培養(yǎng)陽(yáng)性率與BAL 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），經(jīng)支氣管鏡防污染采樣刷檢陽(yáng)性率與痰培養(yǎng)和BAL 陽(yáng)性率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表1～4。

表1 3種取材方法致病菌培養(yǎng)陽(yáng)性率比較 例（%）Table 1 Comparison of the positive rate of pathogenic bacteria culture among the three sampling methods n（%）

2.2 經(jīng)支氣管鏡防污染采樣刷檢的不同年齡組患兒病原學(xué)情況

嬰幼兒組58 例，細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性39 株，前三位病原菌分別為金黃色葡萄球菌、緩癥鏈球菌和肺炎鏈球菌。學(xué)齡前兒童組21例，細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性9株，前三位病原菌分別為肺炎鏈球菌、糞腸球菌和銅綠假單胞菌。學(xué)齡期兒童組11例，細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性6株，前三位病原菌為大腸埃希氏菌、流感嗜血桿菌和肺炎鏈球菌。

2.3 臨床療效

經(jīng)支氣管鏡防污染采樣刷檢取樣、細(xì)菌定量培養(yǎng)陽(yáng)性的所有病例，都遵照經(jīng)支氣管鏡防污染采樣刷檢培養(yǎng)及藥敏結(jié)果選擇敏感抗菌藥物進(jìn)行抗感染治療，總有效率為100.0%。其中痊愈或顯效占92.2%（83/90）；有效6.7%（6/90），6例患兒全部發(fā)熱消退，咳嗽、氣促減輕，肺部啰音減少，具體情況如下：3例復(fù)查感染指標(biāo)及影像學(xué)較前好轉(zhuǎn)，2 例自動(dòng)出院，未予以復(fù)查感染指標(biāo)及影像學(xué)，1例肺膿腫患兒入院時(shí)病情嚴(yán)重，已錯(cuò)過(guò)最佳抗感染時(shí)機(jī)，雖然根據(jù)病原學(xué)結(jié)果積極抗感染治療，臨床癥狀逐漸好轉(zhuǎn)，但是仍發(fā)生了嚴(yán)重的氣胸、包裹性胸腔積液及纖維板形成，后轉(zhuǎn)胸外科治療。

表2 經(jīng)支氣管鏡防污染采樣刷檢細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)果 例Table 2 Positive results of bacterial culture by bronchoscope anti contamination sampling brush n

表3 BAL法細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)果 例Table 3 Positive results of bacterial culture by BAL n

表4 痰培養(yǎng)法細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性結(jié)果 例Table 4 Positive results of bacterial culture by sputum culture n

2.4 3種采樣方法不良反應(yīng)和并發(fā)癥

2.4.1 痰培養(yǎng)本組患兒全部存在惡心和干嘔，不良反應(yīng)發(fā)生率為100.0%（90/90）；咳嗽發(fā)生率為94.4%（85/90）；黏膜出血發(fā)生率為36.7%（33/90）。

2.4.2 BAL低氧血癥發(fā)生率42.2%（38/90），支氣管痙攣和喉痙攣發(fā)生率31.1%（28/90），發(fā)熱發(fā)生率12.2%（11/90），出血發(fā)生率7.8%（7/90）。絕大多數(shù)患兒癥狀輕微，并發(fā)癥發(fā)生時(shí)暫停操作、加大給氧濃度和加強(qiáng)麻醉鎮(zhèn)靜后都可緩解。

2.4.3 經(jīng)支氣管鏡防污染采樣刷檢黏膜出血發(fā)生率為81.1%（73/90），多發(fā)生于小嬰兒（＜6 個(gè)月）。1例患兒發(fā)生氣胸，發(fā)生率為1.1%（1/90），該患兒在刷檢后第2天查胸片，發(fā)現(xiàn)氣胸，但肺壓縮體積不大，臨床癥狀輕微，無(wú)呼吸困難及發(fā)紺，未予穿刺抽氣，予吸氧監(jiān)護(hù)觀察5 d后復(fù)查胸片完全吸收。

3 討論

RP 的診治中，病原學(xué)的準(zhǔn)確判斷及敏感抗菌藥物的正確選擇是診治關(guān)鍵。采集患者下呼吸道感染標(biāo)本的方法有咳/吸痰法、經(jīng)皮肺穿刺吸引、局限性開(kāi)胸肺活檢、氣管內(nèi)吸引、經(jīng)支氣管鏡肺活檢和BAL等[13]。由于上呼吸道正常定植菌可達(dá)200多種，常規(guī)痰培養(yǎng)因陽(yáng)性率低或污染嚴(yán)重，病原菌與污染菌不易區(qū)分，臨床參考價(jià)值不大[14]。經(jīng)皮肺穿刺和開(kāi)胸肺活檢是診斷肺部疾患的金標(biāo)準(zhǔn)，可用于組織病理學(xué)檢查、病原學(xué)檢查和培養(yǎng)，確診率較高，但由于其創(chuàng)傷大、風(fēng)險(xiǎn)高、費(fèi)用高和并發(fā)癥相對(duì)較多，難以作為常規(guī)檢查方法在臨床推廣使用[15]。

近年來(lái)，支氣管鏡在兒童呼吸系統(tǒng)疾病中已廣泛應(yīng)用。大量研究[16-18]表明，BAL 明顯提高了兒童RP病原體診斷的陽(yáng)性率及準(zhǔn)確率，但操作時(shí)支氣管鏡需經(jīng)鼻腔、口腔和咽喉部到達(dá)下呼吸道，在缺乏防污染保護(hù)措施下，容易將上呼吸道的定植菌帶至下呼吸道，造成標(biāo)本污染，直接影響培養(yǎng)結(jié)果的可靠性。RP 患兒炎性分泌物往往多而黏稠，容易栓塞細(xì)小的遠(yuǎn)端支氣管，外徑4.0 mm 甚至2.8 mm 的支氣管鏡常難以進(jìn)入到深部病灶，加上肺泡通氣、回流障礙和灌洗面積及負(fù)壓吸力不足等，導(dǎo)致單純的BAL 有時(shí)難以獲得足夠量的病原體標(biāo)本，影響了BAL 培養(yǎng)陽(yáng)性率。

本研究采用單套管一次性使用毛刷，用無(wú)菌聚乙二醇封堵先端，通過(guò)影像學(xué)定位及超細(xì)支氣管鏡輔助進(jìn)入病變最重的部位進(jìn)行病原學(xué)取材。該取材方法具有以下優(yōu)勢(shì)：①毛刷能輕易進(jìn)入支氣管鏡不能到達(dá)的病灶根源，從而獲得精準(zhǔn)而濃度高的病原體標(biāo)本，提升了培養(yǎng)陽(yáng)性率；②毛刷通過(guò)支氣管鏡工作通道進(jìn)入下呼吸道，避開(kāi)了與上呼吸道直接接觸，減少了定植菌的污染，經(jīng)無(wú)菌聚乙二醇封堵先端后，進(jìn)一步加強(qiáng)了防污染能力，取材的培養(yǎng)結(jié)果可靠性高，可以有效地區(qū)分致病菌和定植菌[19-20]；③刷檢可以幫助深部痰栓的清除：RP 患兒常存在較重的遠(yuǎn)端支氣管分泌物栓塞，尤其在塑型性支氣管炎患兒中多見(jiàn)，常規(guī)的灌洗及負(fù)壓吸引很難將痰栓取出，但刷檢過(guò)程中通過(guò)毛刷的進(jìn)出和轉(zhuǎn)動(dòng)，可以將部分痰栓帶出，或先將痰栓松動(dòng)，再在完成刷檢取材后加大負(fù)壓將其吸出。但為保證取材質(zhì)量及減少并發(fā)癥，操作者應(yīng)注意：①支氣管鏡從上呼吸道進(jìn)入下呼吸道前禁止負(fù)壓吸引，以免吸入上呼吸道的定植菌；②進(jìn)入下呼吸道后，在完成刷檢前也應(yīng)盡可能避免負(fù)壓吸引，防止支氣管鏡工作孔道被污染，以保證刷檢結(jié)果的準(zhǔn)確性；③毛刷送入取材部位遇到阻力后，應(yīng)回退1.0～2.0 cm 再進(jìn)行刷檢，以降低出血及氣胸的風(fēng)險(xiǎn)；④遇到黏膜上有隆起且表面血運(yùn)豐富的組織時(shí)，應(yīng)盡量避免刷檢，以免引起大出血；⑤術(shù)中做好鎮(zhèn)靜，避免在患兒躁動(dòng)、劇烈咳嗽時(shí)進(jìn)行刷檢。聚乙二醇無(wú)毒性，可在之后的BAL過(guò)程中負(fù)壓吸引出或融化后自行咳出。

筆者對(duì)90例RP患兒進(jìn)行痰培養(yǎng)、經(jīng)支氣管鏡防污染采樣刷檢和BAL，3種細(xì)菌培養(yǎng)總陽(yáng)性率分別為14.4%（13/90）、60.0%（54/90）和32.2%（29/90），與國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道[21]基本一致。本研究顯示，經(jīng)支氣管鏡防污染采樣刷檢陽(yáng)性結(jié)果中，革蘭氏陽(yáng)性菌占比64.8%（35/54），革蘭氏陰性菌占比35.2%（19/54）；嬰幼兒（0～3 歲）前三位病原菌分別為金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌和緩癥鏈球菌；學(xué)齡前患兒（3～6歲）前三位病原菌分別為肺炎鏈球菌、糞腸球菌和銅綠假單胞菌；學(xué)齡期患兒（＞6 歲）前三位病原菌分別為大腸埃希氏菌、流感嗜血桿菌和肺炎鏈球菌，與華春珍等[22]報(bào)道基本相符。由于3 歲以內(nèi)（尤其1歲以內(nèi)）的嬰幼兒正常菌群及黏膜的屏障功能尚未完善，加上二胎政策的開(kāi)放增加了居家交叉感染的概率，本研究采集病史時(shí)發(fā)現(xiàn)，此年齡段的患兒發(fā)病前，大多有明確的呼吸道感染患者（哥哥/姐姐）密切接觸史，以金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌感染居多，緩癥鏈球菌感染則全部發(fā)生在1 歲以內(nèi)的患兒中，考慮與該年齡患兒體內(nèi)特異性IgM不足和免疫功能低下有關(guān)。3～6 歲的幼兒免疫系統(tǒng)雖有提升，但體內(nèi)IgG 仍相對(duì)不足[23]，且大多為入托兒童，集體生活交叉感染引發(fā)的CAP 較為多見(jiàn)，肺炎鏈球菌居病原體首位。本研究中6歲以上患兒最少，可能與該年齡段兒童免疫功能逐步完善、感染及進(jìn)展為RP 的概率相對(duì)較低相關(guān)，且病原體以大腸埃希氏菌為主，不排除與季節(jié)有關(guān)。

綜上所述，RP 的治療在臨床上是棘手問(wèn)題，盡早獲取可靠的病原學(xué)信息對(duì)診斷及治療至關(guān)重要。本研究所有RP 患兒均先后聯(lián)合使用痰培養(yǎng)、經(jīng)支氣管鏡防污染采樣刷檢及BAL 3 種方法進(jìn)行病原學(xué)取材，采用經(jīng)無(wú)菌聚乙二醇封堵的單套管一次性使用毛刷，在超細(xì)外徑的可彎曲支氣管鏡引導(dǎo)下，對(duì)深部支氣管進(jìn)行采樣刷檢取材，標(biāo)本細(xì)菌培養(yǎng)的陽(yáng)性率和可靠性最高，對(duì)兒童RP 病原體的正確診斷和抗生素的合理選擇有很好的指導(dǎo)作用，值得臨床推廣應(yīng)用。而B(niǎo)AL培養(yǎng)的陽(yáng)性率和可靠性次之，但BAL操作性更靈活，可以選擇多段多葉進(jìn)行灌洗，通過(guò)反復(fù)負(fù)壓吸引可以獲得更多的病原體標(biāo)本量及細(xì)胞數(shù)，為病原體的診斷提供了寶貴的信息，與經(jīng)支氣管鏡防污染采樣刷檢聯(lián)合使用，具有互補(bǔ)作用，可進(jìn)一步提高病原體的檢出率。