基于GGE雙標(biāo)圖和BLUP分析篩選鎘砷同步低累積水稻品種

柳賽花，紀(jì)雄輝，謝運(yùn)河，劉昭兵，田發(fā)祥，潘淑芳

湖南省農(nóng)業(yè)環(huán)境生態(tài)研究所/湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410125

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和城市化進(jìn)程的加快，鎘砷等重金屬高含量復(fù)合伴生進(jìn)入土壤系統(tǒng)，嚴(yán)重威脅生態(tài)環(huán)境和人類(lèi)健康，2014年全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)顯示全國(guó)鎘（Cd）和砷（As）點(diǎn)位超標(biāo)率分別為7.0%和2.7%。Cd是一種生物蓄積性強(qiáng)、毒性持久、具有“三致”作用的劇毒元素，攝入過(guò)量鎘對(duì)人體危害極其嚴(yán)重He et al.（2013）。As是一種慢性毒性的類(lèi)金屬，通過(guò)食物與飲用水暴露途徑對(duì)人體健康產(chǎn)生影響，長(zhǎng)期接觸砷可以導(dǎo)致肺損傷、外周神經(jīng)損傷、皮膚病或心血管病，是引起多種癌癥的因素之一（Abernathy et al.，1999）。水稻具有富集重金屬Cd的特點(diǎn)，是吸收Cd能力最強(qiáng)的大宗谷類(lèi)作物之一（Chaney et al.，2004），且水稻也是中國(guó)受As污染的主要糧食作物之一，如中國(guó)人均As攝取量約為 42 μg·d-1，中國(guó)成年男子的膳食中總As的攝人量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于美國(guó)、加拿大和澳大利亞等國(guó)家，其中通過(guò)大米攝人的As占總As攝人量的60%（Li et al.，2011），較高的稻米鎘砷含量使得以稻米為主食的居民健康受到嚴(yán)重威脅（Stroud et al.，2011；Zhou et al.，2018）。

大量報(bào)道認(rèn)為，不同的水稻品種對(duì)Cd、As的吸收和累積能力存在顯著差異（Chen et al.，2018；Duan et al.，2017），目前國(guó)內(nèi)外水稻鎘砷低吸收品種篩選與遺傳改良的研究較多，有研究表明水稻鎘砷低吸收品種能有效降低稻米鎘20%—50%，在鎘污染土壤中種植低鎘水稻品種能使稻米鎘含量低于國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)（0.20 mg·kg-1）（Mu et al.，2019），在孟加拉等地的300多個(gè)水稻品種大田試驗(yàn)中，篩選出了76個(gè)砷低累積品種（Norton et al.，2012），可見(jiàn)應(yīng)用重金屬低累積水稻品種已是目前控制水稻鎘或砷吸收累積的有效措施之一（單天宇等，2017）。在鎘砷復(fù)合污染土壤環(huán)境中，由于鎘砷不同的化學(xué)性質(zhì)，使得稻米鎘砷含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（Duan et al.，2017），但因稻米鎘砷含量除了受品種影響外，環(huán)境對(duì)稻米鎘砷含量影響至關(guān)重要，占稻米鎘砷差異來(lái)源的87%（Chi et al.，2018），從而使得稻米鎘砷同步低累積存在可能。因此本研究選取湖南省瀏陽(yáng)七寶山礦區(qū)典型鎘砷復(fù)合污染稻田土壤，利用基因型主效加基因型-環(huán)境互作效應(yīng)（GGE）雙標(biāo)圖分析了 18個(gè)湖南省應(yīng)急性鎘低累積水稻品種的鎘砷低累積性、穩(wěn)定性、適應(yīng)性和環(huán)境相關(guān)性，利用最佳線(xiàn)性無(wú)偏預(yù)測(cè)（BLUP）法計(jì)算不同品種稻米鎘砷含量育種值，為篩選鎘、砷及鎘砷同步累積水稻品種提供一種新方法，為鎘砷同步低累積水稻品種的選育及推廣提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)品種

試驗(yàn)1、2、3中的品種為湖南省應(yīng)急性鎘低累積水稻品種，總計(jì)18個(gè)，具體名稱(chēng)見(jiàn)表1。

表1 試用所用的水稻品種Table 1 Directory of cultivated rice cultivars

1.2 試驗(yàn)地點(diǎn)和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn) 1：在湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院內(nèi)網(wǎng)室進(jìn)行，采用盆栽試驗(yàn)，每一品種設(shè)置為一個(gè)處理，18個(gè)品種即為18個(gè)處理，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。選用直徑約為15 cm的塑料桶，共計(jì)80桶，每桶裝5 kg土壤，供試土壤采自湖南省瀏陽(yáng)市永和鎮(zhèn)佳成村，為花崗巖發(fā)育的麻砂泥0—20 cm耕層水稻土，肥料分別為尿素、磷酸鈣和氯化鉀的形式按N—P—K以150—90—135 kg·hm-2的量加入，加入肥料充分混勻隨機(jī)區(qū)組排列，設(shè)置保護(hù)行加自來(lái)水浸泡7 d后種子直播，2周后追施一次尿素，用量為N 0.08 g·kg-1灌溉使用自來(lái)水，其 pH 6.91，重金屬鎘含量未檢出。水分管理采取分蘗末期和成熟期2次曬田，病蟲(chóng)害防治與大田相同。

試驗(yàn) 2：在瀏陽(yáng)永和鎮(zhèn)的鎘砷污染稻田開(kāi)展早稻季大田試驗(yàn)（28°29′N(xiāo)，113°89′E）。于 3 月 23 日育秧，4月19日移栽，根據(jù)不同品種的成熟時(shí)間于7月4日—8月9日收獲。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每小區(qū)為一個(gè)品種，6行10列，每個(gè)品種3個(gè)小區(qū)重復(fù)，且周邊設(shè)置0.5 m的保護(hù)行。水分管理采取分蘗末期和成熟期2次曬田，肥料管理按照當(dāng)?shù)毓芾矸绞竭M(jìn)行。

試驗(yàn) 3：在瀏陽(yáng)永和鎮(zhèn)的鎘砷污染稻田開(kāi)展晚稻季大田試驗(yàn)。于6月12日育秧，7月3日移栽，根據(jù)不同品種的成熟時(shí)間于9月18日—10月10日收獲。隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)及水肥管理同試驗(yàn) 2。3個(gè)試驗(yàn)的土壤pH和鎘砷含量見(jiàn)表2。

表2 試驗(yàn)土壤的pH土壤鎘砷含量Table 2 pH and contaminant concentrations of soil inpot experiment and field sites

1.3 樣品處理和測(cè)定

水稻于成熟期取樣，稻谷經(jīng)曬干后去殼粉碎，過(guò)100目尼龍篩待測(cè)。稻米中總鎘和總砷測(cè)定采用微波消解，稱(chēng)取0.5000 g植物樣品，加入5 mL HNO3和2 mL H2O2，利用微波消解儀消解，超純水定容至100 mL，用ICP-MS測(cè)定總Cd、As濃度。樣品分析中所用試劑均為優(yōu)級(jí)純，并添加國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)參比物質(zhì)（大米：GSB-22）為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量控制，分析器皿均以5%硝酸溶液浸泡過(guò)夜，以去離子水洗凈。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2007和SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖，采用GGE-Biplot分析水稻品種的低鎘砷累積能力和穩(wěn)產(chǎn)性，采用ASReml計(jì)算每個(gè)品種關(guān)于鎘和砷的育種值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種稻米中鎘砷含量

從3個(gè)試驗(yàn)來(lái)看，均是稻米鎘含量高于稻米砷含量，且稻米鎘砷含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，-0.10（試驗(yàn)1）、-0.09（試驗(yàn)2）、-0.36（試驗(yàn)3）。從表3中可以看出，試驗(yàn)1和試驗(yàn)2、3中稻米鎘砷含量差異明顯，試驗(yàn)1、試驗(yàn)2和試驗(yàn)3中稻米鎘砷含量的算術(shù)平均值為 1.61、1.33 mg·kg-1，1.45、0.50 mg·kg-1與 1.13、0.15 mg·kg-1。不同水稻品種中鎘砷含量差異顯著，試驗(yàn)1、試驗(yàn)2和試驗(yàn)3的品種間稻米鎘砷含量變幅分別為21.1、12.8倍，1.7、3.7倍與2.4、9.0倍，其變異系數(shù)分別為1.0和1.0、0.3和0.2與0.3與0.1。

表3 3個(gè)試驗(yàn)的稻米鎘砷含量Table 3 Heavy metal concentrations in different cultivars of rice grains in 3 tests

方差分析結(jié)果表明（表4），品種、環(huán)境及品種與環(huán)境互作對(duì)稻米鎘砷含量影響都達(dá)到極顯著水平。在盆栽和大田試驗(yàn)的方差分析來(lái)看，稻米鎘差異來(lái)源主要受品種與環(huán)境互作的影響，占總影響的45.4%，稻米砷差異主要受環(huán)境和品種與環(huán)境互作的影響，分別占總影響的39.8%和33.6%。從早晚季試驗(yàn)的方差來(lái)看，品種、環(huán)境及品種與環(huán)境互作對(duì)稻米鎘含量的影響均大，分別為 32.4%，24.1%和25.7%，而稻米砷的主要差異受環(huán)境影響較大，占整體影響的59.9%。

表4 稻米鎘砷含量差異方差分析Table 4 Analysis of variance for grain Cd and As concentrations from 18 rice cultivars grown at pot and field in two seasons

2.2 品種稻米鎘砷低累積能力及其穩(wěn)定性

圖1中的小圓圈代表平均環(huán)境，通過(guò)原點(diǎn)和平均環(huán)境且?guī)Ъ^的直線(xiàn)為“平均環(huán)境軸”?！捌骄h(huán)境軸”的箭頭所在的位置代表品種在所有環(huán)境下稻米鎘或砷的近似平均含量，越往箭頭方向含量越低；與平均環(huán)境軸垂直并通過(guò)原點(diǎn)的直線(xiàn)代表各品種與各環(huán)境相互作用的傾向性，越偏離“平均環(huán)境軸”越不穩(wěn)定。以“平均環(huán)境軸”上的箭頭為圓心畫(huà)圓，越靠近中心圓的品種，其稻米鎘砷低累積能力越強(qiáng)且越穩(wěn)定。由圖1可以看出，稻米鎘低累積能力和穩(wěn)產(chǎn)性較好的品種為14，其次是15和9等，表現(xiàn)比較差的品種為10、13和8等。稻米砷低累積能力和穩(wěn)產(chǎn)性較好的品種為9，其次是14、17等，表現(xiàn)比較差的品種為5、1和12等。

圖1 GGE雙標(biāo)圖分析品種的稻米鎘砷低累積能力及其穩(wěn)定性Fig. 1 The comprehensive ranking view of the GGE biplot for rice cultivars

2.3 不同品種的適應(yīng)性

將最外面的品種順序連接起來(lái)形成一個(gè)多邊形，過(guò)原點(diǎn)向各個(gè)邊做垂線(xiàn)，這樣多邊形就被分成多個(gè)扇形區(qū)域，多邊形的頂點(diǎn)為所在區(qū)域表現(xiàn)最好的品種，而位于多邊形內(nèi)、靠近原點(diǎn)的品種是對(duì)環(huán)境變化不敏感的品種，藍(lán)色圓圈是根據(jù)環(huán)境進(jìn)行生態(tài)型劃分。圖2可以看出，GGE雙標(biāo)圖的PC1和PC2可以有效的解釋G（基因）和GE（基因×環(huán)境）互作的對(duì)鎘砷影響94.75%和99.65%的變異，可以解釋絕大部分的變異，具有較強(qiáng)的代表性。對(duì)鎘而言，3個(gè)環(huán)境整體分為一個(gè)生態(tài)型，而品種14是該生態(tài)型中表現(xiàn)最好的品種。對(duì)砷而言，3個(gè)環(huán)境整體分為3個(gè)生態(tài)型，品種4是環(huán)境2表現(xiàn)最好的品種，品種9是環(huán)境1表現(xiàn)最好的品種。

圖2 GGE雙標(biāo)圖分析品種的適應(yīng)性Fig. 2 Adaptability view of the GGE biplot for rice cultivars

2.4 試驗(yàn)環(huán)境的相關(guān)性

環(huán)境相關(guān)性評(píng)價(jià)可以直觀(guān)的分析各試點(diǎn)對(duì)品種評(píng)價(jià)的相似性，連接原點(diǎn)和各環(huán)境的直線(xiàn)稱(chēng)為向量，兩環(huán)境向量夾角的余弦值近似于它們的遺傳相關(guān)系數(shù)，夾角越小說(shuō)明環(huán)境對(duì)于參試品種的排序越相似，夾角小于90度為正相關(guān)，大于90度為負(fù)相關(guān)。環(huán)境之間不相關(guān)或者負(fù)相關(guān)表示這些環(huán)境屬于不同的類(lèi)型區(qū)，因此，根據(jù)稻米鎘和砷含量的環(huán)境相關(guān)性評(píng)價(jià)可以看出（圖3），環(huán)境2和環(huán)境3夾角較小，生態(tài)比較相似屬于同一區(qū)域，環(huán)境1為另一區(qū)域。

圖3 GGE雙標(biāo)圖分析環(huán)境相關(guān)性Fig. 3 Envrionment vector view of the GGE biplot for rice cultivars

2.5 品種鎘砷的綜合育種值

根據(jù)表5中稻米鎘砷含量的最佳線(xiàn)性無(wú)偏預(yù)測(cè)（BLUP）值可知，稻米鎘含量育種值排名前5的品種分別為 14＞15＞9＞8＞16，稻米砷含量育種值排名前 5的品種分別為 9＞7＞14＞16＞13，稻米鎘砷含量綜合育種值排名前5的品種分別為14＞9＞15＞16＞8。

表5 不同品種稻米鎘砷BLUP值Table 5 Cadmium and arsenic BLUP values of different rice cultivars

3 討論

在重金屬污染稻田種植低累積水稻品種是中國(guó)農(nóng)田糧食安全生產(chǎn)的一項(xiàng)有效措施，但不同品種稻米鎘砷含量差異很大，如Duan et al.（2017）報(bào)導(dǎo)在中國(guó)華南地區(qū)471個(gè)當(dāng)?shù)刂髟愿弋a(chǎn)品種稻米鎘砷含量差異達(dá)32、4.0倍，Mu et al.（2019）發(fā)現(xiàn)在中國(guó)四大糧食產(chǎn)區(qū)總計(jì)687個(gè)大米樣品的稻米鎘砷含量差異分別為 0.004—1.38、0.011—0.235 mg·kg-1，這為中國(guó)受污染耕地水稻安全生產(chǎn)提供大量鎘砷低累積水稻種質(zhì)資源。

一般而言，水稻品種稻米Cd/As含量差異與水稻生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中Cd/As吸收轉(zhuǎn)運(yùn)遷移的難易程度不同有關(guān)，水稻Cd/As吸收轉(zhuǎn)運(yùn)通道和路徑的不同均會(huì)造成不同水稻品種 Cd/As吸收累積差異（Ishimaru et al.，2012；Kamiya et al.，2013），另外，稻米Cd/As含量易受土壤pH、土壤Cd有效態(tài)含量、水分含量等環(huán)境影響（Cao et al.，2014；Li et al.，2018），多點(diǎn)試驗(yàn)證明環(huán)境不僅對(duì)水稻產(chǎn)量影響至關(guān)重要，對(duì)稻米鎘砷含量影響也很大（Mu et al.，2019），Chi et al.（2018）研究表明年度降雨不均衡會(huì)造成早稻鎘含量低于晚稻稻米，而早稻稻米高于晚稻稻米。何洋等（2016）研究表明溫度是影響水稻籽粒鎘積累的重要因子，不同生育時(shí)期溫度變化導(dǎo)致糙米鎘含量的變化。從本研究稻米鎘砷含量差異分析結(jié)果看出，在盆栽和大田環(huán)境差異較大的情況下，稻米鎘差異主要受環(huán)境與品種交互作用影響，占總影響的45.4%，而稻米砷則更易受環(huán)境影響，占39.8%。因此借助一定的數(shù)學(xué)模型方法綜合評(píng)價(jià)品種、品種與環(huán)境交互作用對(duì)稻米鎘砷低累積能力及其穩(wěn)定性影響，進(jìn)而得到鎘、砷和同步鎘砷低累積品種用于指導(dǎo)中輕度重金屬污染稻田的安全生產(chǎn)具有重要意義。

目前對(duì)于低累積品種的確定，主要是通過(guò)盆栽篩選、多點(diǎn)大田篩選和不同地區(qū)大田驗(yàn)證，根據(jù)各試驗(yàn)點(diǎn)平均鎘含量、超標(biāo)試驗(yàn)點(diǎn)數(shù)和重復(fù)次數(shù)綜合評(píng)價(jià)方法進(jìn)行低累積品種評(píng)價(jià)（張玉燭等，2017），GGE模型是同時(shí)考慮基因型效應(yīng)和基因與環(huán)境互作效應(yīng)的模型，它使用雙標(biāo)圖的形式展示基因與環(huán)境互作，提供鑒別品種高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)性及品種的環(huán)境適應(yīng)性分析。目前主要用于水稻（王磊等，2015）、花生（郭敏杰等，2017）、玉米（孟令聰?shù)龋?019）、大豆（昝凱等，2019）和大麥（趙鋒等，2019）等品種的區(qū)域豐產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)定性及適應(yīng)性的評(píng)價(jià)，顯少用于對(duì)水稻品種鎘砷低累積能力及其穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)，鑒于 GGE本身針對(duì)的是表型數(shù)據(jù)高的品種篩選，因此本研究通過(guò)對(duì)不同品種稻米鎘砷含量數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理并負(fù)數(shù)化的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化后，分析得出稻米鎘低積累品種為 14、15、9，稻米砷低累積品種為9、14、17。GGE分析提供圖形直觀(guān)地表達(dá)，可幫助我們分別評(píng)價(jià)參試品種稻米低鎘或低砷累積能力及其穩(wěn)定性，但不能綜合多個(gè)性狀同時(shí)評(píng)價(jià)，另外品種數(shù)量和點(diǎn)位數(shù)量較多的情況下，圖形中的點(diǎn)位和品種數(shù)據(jù)可能重疊而影響其評(píng)價(jià)判斷。因此在多性狀同時(shí)評(píng)價(jià)的情況下，在計(jì)算單一性狀BLUP值的基礎(chǔ)上，運(yùn)用綜合BLUP值進(jìn)行評(píng)價(jià)。BLUP法具有估計(jì)值無(wú)偏、估計(jì)值方差最小、可消除因選擇和淘汰等原因造成的偏差等特性，是當(dāng)今世界范圍內(nèi)主要的種畜遺傳評(píng)定方法（李晶等，2020；鄭聰慧等，2019），暫無(wú)用于對(duì)水稻稻米鎘砷低累積能力遺傳評(píng)價(jià)，本研究通過(guò)計(jì)算稻米鎘和砷含量單一性狀的BLUP值，稻米鎘和砷含量單一性狀各賦予一個(gè)權(quán)重 0.5，計(jì)算出稻米鎘砷含量綜合BLUP值，根據(jù)其排名可直接得出稻米鎘砷含量同步低累積的品種，最優(yōu)的同步低累積品種為品種14，其次是品種9，和GGE模型評(píng)價(jià)的結(jié)果基本一致。本研究3個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的地點(diǎn)一個(gè)為盆栽，另外兩個(gè)為早稻季和晚稻季相鄰大田，雖然本研究中的試驗(yàn)地點(diǎn)代表性有待加強(qiáng)，但通過(guò) GGE雙標(biāo)圖和BLUP分析多環(huán)境試點(diǎn)中品種的鎘砷低累積能力及穩(wěn)定性和篩選多環(huán)境試點(diǎn)的鎘、砷及鎘砷同步累積水稻品種是一種可行的新方法。

4 結(jié)論

3個(gè)試驗(yàn)中稻米鎘砷含量差異顯著，稻米鎘含量為 0.20—4.21mg·kg-1，稻米砷含量為 0.03—4.24 mg·kg-1，稻米鎘差異來(lái)源主要受品種與環(huán)境互作的影響，稻米砷受環(huán)境影響較大。通過(guò) GGE雙標(biāo)圖篩選出適宜不同環(huán)境種植的低鎘品種和低砷品種分別是品種14（Y兩優(yōu)19）、15（深兩優(yōu)5814）和9（晶兩優(yōu)華占），稻米砷低累積品種為品種 9（晶兩優(yōu)華占）、14（Y兩優(yōu)19）和17（望兩優(yōu)5511），進(jìn)一步通過(guò)BLUP分析得出鎘砷同步低累積品種為品種14（Y兩優(yōu)19）和9（晶兩優(yōu)華占），和GGE模型評(píng)價(jià)的結(jié)果基本一致。總的來(lái)說(shuō)，利用 GGE雙標(biāo)圖和BLUP分析篩選多環(huán)境試點(diǎn)中的鎘砷低累積水稻品種，可為重金屬污染耕地水稻品種選擇提供科學(xué)依據(jù)。