磷肥種類對(duì)李氏禾富集銅、鉻的影響及其生理響應(yīng)

劉昭君，林華*，王義安，覃輝，Kong CHHUON

1. 桂林理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，廣西 桂林 541004；2. 柬埔寨技術(shù)研究所水文與水資源工程學(xué)院，柬埔寨 金邊 12000

李氏禾（Leersia HexandraSwartz）是中國境內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)的濕生鉻超富集植物（張學(xué)洪等，2006），其具有多年生、繁殖能力強(qiáng)、單位面積生物量大、生長(zhǎng)迅速、適合生長(zhǎng)在潮濕和水生環(huán)境中，且一年內(nèi)可多次收割等特點(diǎn)。因此，李氏禾是實(shí)現(xiàn)植物修復(fù)技術(shù)的一種理想植物。磷是組成植物體內(nèi)細(xì)胞原生質(zhì)的元素之一，對(duì)植物細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖有重要作用；且是植物光合作用所需的重要元素，參與能量轉(zhuǎn)移過程（張存款，2018）。磷濃度影響著光合作用，過高或過低的磷濃度都不利于光合作用的正常進(jìn)行（楊晴等，2006）。缺磷會(huì)導(dǎo)致葉綠素含量降低，最終導(dǎo)致光合速率降低（Jacob et al.，1991；張永麗等，2004）。過量磷會(huì)減少植物對(duì)銅的吸收或形成Ca-P難溶鹽導(dǎo)致植物缺鈣（陳屏昭等，2004；郭延平等，2002）。

李氏禾作為鉻的超富集植物對(duì)銅同樣有超富集效果（滿向甜等，2019）。施加適量的磷對(duì)提高生物量和重金屬含量有促進(jìn)作用（Huang et al.，2018；姚詩源，2019），但不同種類的磷肥的化學(xué)性質(zhì)和作用效果也有所不同，陳青云等（2013）證明不同磷肥種類對(duì)蔬菜中重金屬累積有一定的影響，劉昭兵等（2012）證明鈣鎂磷和過磷酸鈣降低水稻莖葉和糙米中鎘含量的效果最好，由此看出磷肥種類對(duì)植物對(duì)重金屬的累積存在某種作用，但哪種磷肥可最大限度地提高植物累積重金屬的量還需實(shí)驗(yàn)確定。本研究通過比較幾種常見的磷肥對(duì)李氏禾生長(zhǎng)、重金屬累積以及蛋白質(zhì)、丙二醛、葉綠素、抗氧化酶等生理響應(yīng)的影響，來確定效果最佳的磷肥類型，探討可能磷肥種類對(duì)李氏禾對(duì)銅、鉻累積的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)所用的李氏禾采自廣西省桂林市雁山鎮(zhèn)的農(nóng)戶魚塘邊，未受重金屬污染。采回后選取生長(zhǎng)一致的李氏禾用清水清洗凈根部至無淤泥后，然后置于15 cm直徑的圓形塑料瓶中，加入25%全Hoagland營養(yǎng)液，置于人工氣候箱中（光照周期14 h、白天25 ℃晚上20 ℃，相對(duì)濕度70%—75%，光照強(qiáng)度7000 Lx）。7 d后進(jìn)行銅、鉻處理。配制去磷霍格蘭營養(yǎng)液（具體配方見表1）。分別加入4種不同的磷肥：磷酸氫二銨（DAP）、磷酸二氫銨（MAP）、磷酸氫鈣（DCP）、過磷酸鈣（SSP），每種磷肥分別設(shè)置 4組處理：A組（無磷，0P，0 mg·L-1），B 組（低磷，1/2P，11.38 mg·L-1）、C組（中磷，1P，22.76 mg·L-1），D組（高磷，2P，45.52 mg·L-1），設(shè)置兩組對(duì)照組（CK1為無磷無銅鉻培養(yǎng)，CK2為無銅鉻培養(yǎng)），每組處理均采用重鉻酸鉀及五水硫酸銅進(jìn)行配制成10 mg·L-1Cr(Ⅵ)和10 mg·L-1Cu(Ⅱ)的水溶液進(jìn)行進(jìn)行復(fù)合處理。每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)20—25株植物。處理15 d后收獲李氏禾并進(jìn)行重金屬含量、葉綠素含量、蛋白含量、抗氧化酶活性的測(cè)定。在培養(yǎng)期間，每3天添加一次去磷Hoagland營養(yǎng)液以保持營養(yǎng)物質(zhì)濃度和種類。收獲時(shí)，先用自來水沖洗干凈，再用20 mmol·L-1EDTA-2Na浸泡并用超聲波震蕩去除表面附著的重金屬，最后用去離子水清洗。

表1 去磷霍格蘭營養(yǎng)液配方Table 1 The formula of modified Hoagland’s nutrient solution without P

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 株高、生物量

利用直尺隨機(jī)測(cè)量（周品成等，2019）李氏禾株高。每盆隨機(jī)選10株李氏禾置于烘箱，65 ℃烘干48 h至恒質(zhì)量（陳方圓等，2020），得到植物干質(zhì)量，即生物量。

1.2.2 元素含量

收獲時(shí)，取培養(yǎng)液并用0.45 μm濾膜過濾，用電感耦合等離子光譜儀（ICP）測(cè)定銅和鉻的濃度。將李氏禾根部用去離子水清洗干凈后置于烘箱，溫度調(diào)整為105 ℃，時(shí)間為30 min，這一步是為了保持植物葉片中化學(xué)成分不發(fā)生轉(zhuǎn)變和消耗，通過殺青及時(shí)終止植物體內(nèi)氧化酶的活性，而后溫度調(diào)整為75 ℃烘干至恒重，粉碎。利用HNO3-H2O2濕法消解，用ICP測(cè)定李氏禾植株根、莖和葉部的Cu含量。

1.2.3 生理指標(biāo)

葉綠素含量測(cè)定采用乙醇勻漿，分光光度法測(cè)定，取0.1 g植物葉片鮮樣，在黑暗中加10 mL無水乙醇進(jìn)行勻漿，10000 g離心10 min，在470、649、665 nm測(cè)量上清液的吸光度。根據(jù)Dijk et al.（1988）的描述計(jì)算葉綠素濃度；

丙二醛（MDA）含量采用Heath et al.（1968）描述的方法，用5%三氯乙酸勻漿，0.67%硫代巴比妥酸（TBA）提取，在波長(zhǎng)532、600 nm處測(cè)定吸光度；

可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)染色法（張志良，2009），595 nm波長(zhǎng)下測(cè)定；

POD活性采用愈創(chuàng)木酚法（張志良，2009），在波長(zhǎng) 470 nm測(cè)定；CAT活性采用紫外吸收法（Song et al.，2007），在波長(zhǎng)240 nm下測(cè)定；SOD活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑（NBT）光化還原法（張志良，2009），在560 nm波長(zhǎng)下測(cè)定。每個(gè)指標(biāo)測(cè)定進(jìn)行3個(gè)重復(fù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2019處理，統(tǒng)計(jì)分析采用軟件SPSS 24.0 LSD法進(jìn)行差異顯著分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類磷肥對(duì)李氏禾生長(zhǎng)的影響

株高和生物量是反映植物生長(zhǎng)狀態(tài)和對(duì)重金屬耐性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)。與 0P處理組相比，各磷肥處理組對(duì)李氏禾生物量和株高（表2）均有顯著作用。低、中、高磷酸鹽濃度處理組均以 DAP處理組生物量和株高最大，分別達(dá)到了6.491、7.406、9.260 g和53.667、56.533、59.067 cm。與0P處理組相比，施用磷肥的李氏禾株高均存在顯著性差異（P＜0.05），且各組間的差異性均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。各磷肥處理組的生物量相對(duì)于對(duì)照顯著（P＜0.05），且各組間的差異性均達(dá)到顯著水平。其中 DAP、MAP、DCP處理組間生物量達(dá)到極其顯著水平（P＜0.01）。

表2 不同磷肥處理李氏禾的生物量和株高Table 2 Biomass andplant height of L. hexandra with different phosphate treatment

2.2 不同種類磷肥處理對(duì)李氏禾富集鉻的影響

由表3可知，施用SSP的處理組的李氏禾對(duì)重金屬鉻的富集最高。并在磷質(zhì)量濃度為 22.76 mg·L-1時(shí)達(dá)到最大，根、莖、葉中鉻質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 828.08、202.00、64.00 mg·kg-1，SSP 組李氏禾地下和地上部分鉻富集量均高于對(duì)照和其他磷肥組，且差異性顯著（P＜0.05）。

表3 不同磷肥處理李氏禾根、莖、葉中的Cr含量Table 3 Cr concentration in root, stem and leaf of L. hexandra with different phosphate treatment

2.3 不同種類磷肥處理對(duì)李氏禾富集銅的影響

由表4可知，施用SSP的處理組的李氏禾對(duì)重金屬銅的富集最高。并在中磷時(shí)達(dá)到最大，根、莖、葉中銅質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 674.125、89.250、57.750 mg·kg-1，SSP組李氏禾地下和地上部分銅富集量均高于對(duì)照和其他磷肥組，且差異性顯著（P＜0.05）。

表4 不同磷肥處理李氏禾根、莖、葉中的Cu含量Table 4 Cu concentration in root, stem and leaf of L. hexandra with different phosphate treatment

2.4 不同種類磷肥處理對(duì)李氏禾富集銅、鉻的生理響應(yīng)

如表5所示，施用DAP組的李氏禾葉綠素含量在所有處理組中最高。這是由于氮元素是葉綠素的重要組成元素，可能是由于MAP中氮元素含量最高，這更加有利于李氏禾進(jìn)行光合作用和葉綠素的合成。在低、中、高磷酸鹽水平下，相比于 0P處理組，DAP組李氏禾葉綠素含量分別增加了49.48%、70.81%和136.08%；與DCP組和SSP組相比分別提高了 28.68%、35.19%、71.51%和22.02%、27.55%、61.52%，并與其他各組存在顯著性差異（P＜0.05）。DCP和SSP中無氮元素，所以相應(yīng)的葉綠素含量均小于其余含氮元素的兩個(gè)處理組。

表5 不同磷肥處理李氏禾葉中的葉綠素含量Table 5 The content of chlorophyll in L. Hexandra leaves with different phosphate treatment

如表6所示，各磷濃度處理組可溶性蛋白質(zhì)含量均與0P處理組存在極顯著差異（P＜0.01），DAP組李氏禾蛋白質(zhì)含量在所有處理組中最高，這與葉綠素研究結(jié)果相同。在低、中、高濃度磷酸鹽處理水平下，DAP組李氏禾蛋白質(zhì)含量達(dá)到最大，相比于 0P處理組，分別提高了 38.10%、50.00%和84.52%；而SSP處理組李氏禾可溶性蛋白的促進(jìn)作用最小，相對(duì)于 0P處理組，分別提高了 7.23%、20.48%和28.92%。MAP和DCP處理組效果處于以上兩者之間，且隨著磷酸鹽濃度的增加，均出現(xiàn)上升趨勢(shì)。

表6 不同磷肥處理李氏禾葉中的蛋白質(zhì)含量Table 6 The content of protein in L. Hexandra leaves with different phosphate treatment

由表7、8可知，各處理組丙二醛含量均低于0P處理組，其中NH4HPO4處理組在中磷時(shí)出現(xiàn)最小值，且與其他處理組間存在顯著性差異（P＜0.05），此時(shí)李氏禾細(xì)胞受到的損傷最小；在低、中、高磷酸鹽處理水平下，NH4HPO4處理組李氏禾丙二醛含量分別降低了14.10%、19.40%和3.35%，有效的緩解了銅、鉻對(duì)李氏禾的傷害。各磷濃度處理組SOD酶活性均與 0P處理組存在顯著差異（P＜0.05），隨著磷濃度增加，低、中、高磷酸鹽處理組 SOD活性先升高后下降，相較于 0P處理組，各種磷肥處理組的李氏禾葉片中的 SOD活性均有提高，其中SSP處理組促進(jìn)效果最好，分別增加了62.41%、72.07%和24.10%。隨著磷濃度的提升，李氏禾葉片中的 POD酶活性呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，在磷質(zhì)量濃度為22.76 mg·L-1時(shí)葉片中POD酶活性達(dá)到最大，此后呈明顯下降趨勢(shì)，在45.52 mg·L-1時(shí)POD酶活性減小。與0P處理組相比，SSP處理組的促進(jìn)效果最好，當(dāng)磷質(zhì)量濃度為22.76 mg·L-1時(shí)均達(dá)到最大，分別增加了 37.81%、73.76%、38.82%。所有處理組中 CAT酶的活性都隨磷濃度增加出現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，且SSP處理組均達(dá)到最大，與0P處理組相比，SSP處理組李氏禾CAT酶活性分別增加了25.64%、43.23%和21.75%。

表7 不同磷肥處理李氏禾葉中的丙二醛含量和SOD活性Table 7 The content of MDA and the activity of SOD in L. Hexandra leaves with different phosphate treatment

表8 不同磷肥處理李氏禾葉中的POD、CAT活性Table 8 The activity of POD and CAT in L. Hexandra leaves with different phosphate treatment

3 討論

磷是植物的組成成分之一，也是植物生長(zhǎng)過程中的必需元素，在植物代謝、酶活性調(diào)節(jié)、光合作用等方面都扮演著重要的角色。磷在植物光合作用、呼吸作用和生理生化調(diào)節(jié)過程中起著重要作用（Rao et al.，1990；賀軍軍等，2016）。在本實(shí)驗(yàn)中，與 0P處理組相比較可知，磷肥處理組李氏禾的株高均存在顯著性差異，DAP處理組的李氏禾株高和生物量最大。隨著營養(yǎng)液中磷濃度的增大，李氏禾株高和生物量都呈上升趨勢(shì)，說明施加磷肥明顯促進(jìn)植物生長(zhǎng)。這一結(jié)果與Huang et al（.2013）、Singh et al.（2015）和 Dai et al.（2017）的研究一致。DAP和MAP含有利于光合作用的元素氮和磷，相對(duì)其他2種磷肥而言更有利于植物進(jìn)行光合作用，這可能是導(dǎo)致DAP和MAP處理組株高和生物量大于其他兩組的原因（Zhang et al.，2017）。此外，施加磷肥降低了重金屬對(duì)植物的脅迫，并有助于葉綠素的形成從而葉綠素增加（Bustingorri et al.，2017；楊晴等，2006）。

植物體內(nèi)可溶性蛋白大部分是參與植物生理代謝的酶類，可溶性蛋白是重要的生理生化指標(biāo)，其含量可以反映出植物體總代謝程度（王英，2018），也可以衡量植物在某種條件下是否會(huì)發(fā)生重金屬脅迫。Hartley et al.（2001）證明砷誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激在植物中引起許多毒性效應(yīng)，使可溶性蛋白質(zhì)含量降低。而Kamran et al.（2018）證明加入磷酸鹽可以有效減輕砷的毒性。在本研究中，可溶性蛋白含量隨供磷水平的提高而增加，在磷供給濃度最大時(shí)值最高，這與孫海龍（2005）得出的結(jié)論相同。DAP和MAP處理組的可溶性蛋白含量均高于其他0P處理組，這可能是因?yàn)榱讜?huì)促進(jìn)植物對(duì)氮元素的吸收，有利于蛋白質(zhì)的合成，從而提高了葉片可溶性蛋白的含量，可能是適宜磷能促進(jìn)植物體內(nèi)銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的同化；磷又可以加強(qiáng)植物的呼吸作用，呼吸作用會(huì)形成多種有機(jī)酸，從而轉(zhuǎn)化為氨基酸，使蛋白質(zhì)含量升高，在進(jìn)一步合成蛋白質(zhì)中，ATP又是能量的供應(yīng)者（馬佩玲，2018）。

作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中增加產(chǎn)量的一種重要方式，施肥也可用于加強(qiáng)植物修復(fù)（廖曉勇等，2007）。Barrutia et al.（2009）報(bào)道了施肥極大地刺激了植物的生長(zhǎng)并提高了植物富集的效率。Zhou et al.（2020）證明施加磷肥可以有效提高植物對(duì)銅的吸收。在本研究中也出現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，施加適量的磷肥能有效地增加李氏禾對(duì)銅、鉻的富集量，添加過磷酸鈣的實(shí)驗(yàn)組銅、鉻的富集量明顯高于其他處理組，可能是過磷酸鈣水溶液為弱酸性，而重金屬銅、鉻可能在堿性條件下發(fā)生了共沉淀作用，導(dǎo)致營養(yǎng)液中有效銅、鉻含量降低，并且pH還可能影響了Ca離子通道轉(zhuǎn)運(yùn)銅、鉻。王寶奇（2007）的研究證明隨著土壤pH的升高，重金屬銅鋅共沉淀作用，大多以沉淀態(tài)的形式存在于土壤中，有效性顯著下降。田靜等（2014）證明單一元素銅和鉻處理的李氏禾對(duì)銅、鉻的吸收與鈣離子通道有關(guān)。李氏禾重金屬富集地上部分大于地下部分，相關(guān)研究也有類似情況（Zhang et al.，2007；陳俊等，2008）。

當(dāng)植物處在逆境條件下，會(huì)直接或間接形成過量ROS，而ROS對(duì)細(xì)胞內(nèi)的膜系統(tǒng)、脂類、蛋白質(zhì)和核酸等大分子存在破壞作用（鄭榮梁，2007）。丙二醛（MDA）含量越高，說明植物細(xì)胞膜質(zhì)過氧化程度越高，細(xì)胞膜受到的傷害越嚴(yán)重（李兆君等，2004；王曉維等，2014）。本實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組X相比，在銅、鉻脅迫下MDA含量降低，說明重金屬毒性降低。Dai et al.（2017）證明，施加磷肥能降低鎘脅迫下李氏禾葉片中丙二醛的含量，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似。施加磷肥后，抗氧化系統(tǒng)被激發(fā)以消除ROS，這與丙二醛含量降低有關(guān)（Zhou et al.，2020）。超氧化歧物酶（SOD）、過氧化物酶（POD）等可清除有害的體內(nèi)活性氧保護(hù)植物細(xì)胞免受活性氧的損傷（顧艾博，2014；唐茜等，2009），從而保護(hù)植物的膜系統(tǒng)。在植物受到重金屬脅迫時(shí)，POD和CAT酶活性會(huì)改變，從而間接反映植物受傷害的程度（潘芳慧等，2018）。本實(shí)驗(yàn)中，在低濃度磷脅迫下，各處理組 SOD活性均有所升高，增加其抗性以適應(yīng)逆境生長(zhǎng)環(huán)境。SOD和POD酶在低、中、高濃度磷處理時(shí)呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，說明SOD和POD酶在低濃度磷處理時(shí)對(duì)李氏禾有一定的保護(hù)作用，在高濃度磷處理時(shí)，活性氧和抗氧化系統(tǒng)平衡被破壞，從而被抑制。

4 結(jié)論

施用不同磷肥能明顯提高銅、鉻污染土壤上生長(zhǎng)李氏禾的生物量，其中以施用DAP的效果最好。磷肥的施用對(duì)李氏禾吸附銅、鉻均有促進(jìn)作用，施用SSP的李氏禾各部分銅、鉻積累量均高于其他3種磷肥。施用磷肥減弱了銅、鉻對(duì)李氏禾的脅迫，施用DAP的李氏禾葉片中葉綠素含量遠(yuǎn)高于其他3組。

李氏禾葉片中的丙二醛隨磷濃度的變化而變化，其中SSP處理組對(duì)李氏禾的影響最大。當(dāng)植物遭受重金屬脅迫時(shí)，植物的代謝活動(dòng)會(huì)受到影響，施用SSP時(shí)李氏禾葉片中的SOD、POD、CAT含量均在磷質(zhì)量濃度為22.76 mg·L-1時(shí)達(dá)到最大。