不同濃度植物根系分泌物微生態(tài)效應(yīng)研究

沈鳳英 ，吳偉剛，李亞寧，劉大群 ，滕云

1. 國(guó)家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心/河北省植物病蟲(chóng)害生物防治工程技術(shù)研究中心/河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河北 保定 071001；2. 河北北方學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院，河北 張家口 075000；3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081

植物在生長(zhǎng)過(guò)程中由根系不同部位分泌產(chǎn)生的無(wú)機(jī)離子或小分子有機(jī)物統(tǒng)稱為根系分泌物（何為等，2017；章帆等，2018；尹華軍等，2019）。根系分泌物的產(chǎn)生是植物在長(zhǎng)期進(jìn)化和生長(zhǎng)過(guò)程中形成的一種適應(yīng)機(jī)制。根系分泌物的產(chǎn)生受外界環(huán)境的影響，而根系分泌物本身對(duì)根際環(huán)境具有改變作用（蔣錚等，2018；劉小明等，2018）。關(guān)于植物根系分泌物的研究已有200多年歷史。Syrennius早在1768年就提出植物根系能分泌某種物質(zhì)；隨后，Plenk（1795年）和Decardolle（1830年）觀察到根系分泌物對(duì)鄰近植株有促生和抑制作用。20世紀(jì)50年代，有研究揭示了根系分泌物的作用；到20世紀(jì)70年代，根系分泌物的研究出現(xiàn)了蓬勃發(fā)展的趨勢(shì)。近年來(lái)的研究表明，根系分泌物是保持根際生態(tài)系統(tǒng)活力的關(guān)鍵因素，也是根際微生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)遷移和調(diào)控的重要組成部分（Tian et al.，2019；Zhang et al.，2019；María et al.，2020）。

根系分泌物是健康植株在一定生長(zhǎng)狀態(tài)下，由根系通過(guò)分泌或溢泌作用釋放到根際環(huán)境中的具有一定溶解性有機(jī)物的總稱，是植物與外界環(huán)境之間進(jìn)行物質(zhì)、信息交流的重要載體和通訊物質(zhì)（劉艷霞等，2016；王婷等，2018；張文明等，2018；字淑慧等，2019）。常作為化感物質(zhì)影響植物根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和數(shù)量、土壤酶活性及理化性狀等，進(jìn)而影響植物生存環(huán)境的物理、化學(xué)和生物學(xué)性狀（Chang，2019；Holz et al.，2019；Lv et al.，2020）。土壤中的微生物是生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和循環(huán)的動(dòng)力，其潛在的生物化學(xué)活性對(duì)土壤發(fā)揮其生態(tài)功能有重要意義；同時(shí)，由于植物根系的分泌物中包含有大量的有機(jī)物質(zhì)，為土壤中的微生物提供了碳源，使得土壤中的微生物群落組成及數(shù)量不同于根外土壤，而土壤微生物直接參與土壤中氮、磷等養(yǎng)分物質(zhì)的循環(huán)和轉(zhuǎn)化，它的代謝產(chǎn)物也影響著植物的定植、生長(zhǎng)、繁殖和群落演替，因而土壤微生物的數(shù)量和種類構(gòu)成對(duì)評(píng)價(jià)土壤養(yǎng)分和肥力狀況有重要意義（王吉秀等，2016；孫燕等，2017；王婷等，2018）。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于根系分泌物的研究主要集中在農(nóng)作物連作障礙、農(nóng)田肥力、重金屬污染等農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，而對(duì)園林植物根系分泌物及其生態(tài)功能的研究相對(duì)較少（唐希望等，2018；張建聰?shù)龋?019）。本研究以?shī)A竹桃（Nerium oleander）為對(duì)象，通過(guò)水培法收集種植物的根系分泌物，將收集的分泌物原位土壤培養(yǎng)。分析其對(duì)土壤理化性質(zhì)、土壤微生物群落功能多樣性、微生物量碳、微生物熵、基礎(chǔ)呼吸和代謝熵的影響，以期為深入揭示園林植物根系分泌物的形成機(jī)理，為園林植物的大力推廣提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

園林植物選擇夾竹桃（Nerium oleander）（城市道路長(zhǎng)勢(shì)較好的100株夾竹桃，高度約為3 m），將采集到的夾竹桃根系清洗干凈后置于Hoagland完全營(yíng)養(yǎng)液中復(fù)性3 d（增氧泵通氣）。復(fù)性后的根系用1% NaClO消毒15 min，用無(wú)菌水沖洗干凈后定植于1000 mL的燒杯中，加無(wú)菌水使根部全部浸沒(méi)。在室溫條件下分別培養(yǎng)6、12、24 h后將根系取出（記錄液體體積），燒杯中的液體即為夾竹桃根系不同收集時(shí)間段的分泌物收集液。收集液經(jīng)過(guò)濾后，減壓濃縮10倍后低溫密封保存。同時(shí)采集夾竹桃根區(qū)新鮮土壤，4 ℃保存后用于測(cè)定土壤微生物特性。

1.2 根系分泌物回接土壤

分別取上述根系分泌物濃縮液10 mL，加入80 g過(guò)1 mm篩的原位土中，置于100 mL螺口玻璃瓶中，密封，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)3周。試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理[低濃度LC為5 mL分泌物+10 mL去離子水；中濃度MC為10 mL分泌物+5 mL去離子水；高濃度HC為15 mL分泌物；并以15 mL去離子水作為對(duì)照(CK)]，每種處理設(shè)3次重復(fù)。

1.3 土壤有機(jī)碳、微生物量碳及基礎(chǔ)呼吸測(cè)定

土壤有機(jī)碳（SOC）采用重鉻酸鉀外加熱法測(cè)定。在外加熱的條件下（油浴溫度為180 ℃，沸騰5 min），用一定濃度的重鉻酸鉀-硫酸溶液氧化土壤有機(jī)質(zhì)（碳），剩余的重鉻酸鉀用硫酸亞鐵來(lái)滴定，從所消耗的重鉻酸鉀量，計(jì)算有機(jī)碳的含量（譚雪蓮等，2018）。

土壤微生物量碳（MBC）采用氯仿熏蒸提取法測(cè)定。準(zhǔn)確稱取相當(dāng)于烘干土樣10 g的新鮮土樣，放入真空干燥器中，同時(shí)分別放入裝有NaOH溶液和無(wú)乙醇氯仿的小燒杯，用真空泵抽成真空并保證氯仿沸騰3—5 min，在25 ℃避光黑暗條件下放置24 h（同時(shí)設(shè)相應(yīng)未熏蒸對(duì)照土樣），提取過(guò)程浸提液采用 0.5 mol·L-1K2SO4溶液（土液比為 1∶4），并用0.45 μm濾膜抽濾，濾液中碳用High TOC Ⅱ+N（Elementar Ⅱ，Germany）測(cè)定。MBC以熏蒸和未熏蒸土樣提取液中碳含量的差值 Ec除以轉(zhuǎn)換系數(shù)0.45而得到。

土壤基礎(chǔ)呼吸（BRC）采用培養(yǎng)法測(cè)定。稱取相當(dāng)于20 g干土的新鮮土壤放入培養(yǎng)瓶中，調(diào)節(jié)土壤含水量為田間持水量的60%，在25 ℃條件下培養(yǎng)24 h，CO2產(chǎn)生量使用氣相色譜儀測(cè)定，以單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生CO2-C的量表示基礎(chǔ)呼吸大小。微生物代謝熵為基礎(chǔ)呼吸和微生物量碳的比值（王吉秀等，2016；孫燕等，2017；王婷等，2018）。

采用Biolog Eco微平板法進(jìn)行微生物群落多樣性的測(cè)定。每塊微平板含3組各32孔，其中1孔為不含任何碳源的對(duì)照，其余31孔各含有1種碳源和氧化還原染料四氮唑藍(lán)，底物利用后產(chǎn)生氧化還原電勢(shì)的變化可導(dǎo)致染料顏色發(fā)生變化。稱取5 g不同處理的土樣置于50 mL無(wú)菌生理鹽水中，180 r·min-1振蕩30 min，然后用無(wú)菌生理鹽水稀釋至10倍，通過(guò)排孔加樣器接種至Biolog微平板上，每孔150 μL，3個(gè)重復(fù)接種在同一個(gè)微平板上。25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，每隔24小時(shí)用Biolog自動(dòng)讀板儀在590 nm下讀數(shù)。計(jì)算平均吸光度值（AWCD）和多樣性指數(shù)，選取96 h的平均光密度值進(jìn)行主成分分析（唐希望等，2018；張建聰?shù)龋?019）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

運(yùn)用Excel 2003和SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析，所有數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，單因素方差分析檢驗(yàn)各處理之間的差異顯著性，通過(guò)主成分分析法分析土壤微生物群落代謝功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 根系分泌物對(duì)土壤理化性狀的影響

根系分泌物不同收集時(shí)間根系分泌物回接培養(yǎng)后的土壤養(yǎng)分變化情況見(jiàn)表1。由表可知，根系分泌物回接到土壤中培養(yǎng)3周后，土壤pH值、有機(jī)碳、含水量、全氮、堿解氮、速效磷均有較明顯變化，而土壤全磷無(wú)明顯差異（P＞0.05）。土壤pH值變化范圍在6.01—7.32之間，其中不同濃度根系分泌物處理pH值顯著低于CK（P＜0.05）；不同濃度根系分泌物處理下有機(jī)碳、含水量、全氮、堿解氮、速效磷含量顯著高于 CK（P＜0.05），其大小表現(xiàn)為 HC＞MC＞LC＞CK。

表1 根系分泌物對(duì)土壤理化性狀的影響Table 1 Effect of root exudates on soil physical and chemical properties

2.2 植物根系分泌物對(duì)土壤微生物數(shù)量的影響

由圖1可知，不同濃度植物根系分泌物對(duì)土壤微生物數(shù)量有顯著影響，不同濃度植物根系分泌物處理下細(xì)菌、真菌、放線菌和微生物總數(shù)均顯著高于對(duì)照（P＜0.05），不同處理之間差異均顯著（P＜0.05），其大小表現(xiàn)為 HC＞MC＞LC＞CK。

圖1 植物根系分泌物對(duì)土壤微生物數(shù)量的影響Fig. 1 Effect of root exudates on soil microbial population

2.3 植物根系分泌物對(duì)土壤微生物學(xué)特征的影響

由圖2可知，不同濃度植物根系分泌物對(duì)土壤微生物學(xué)特征有顯著影響，不同濃度植物根系分泌物處理下微生物量碳、微生物熵和基礎(chǔ)呼吸均顯著高于對(duì)照（P＜0.05），不同處理之間差異均顯著（P＜0.05），其大小表現(xiàn)為HC＞MC＞LC＞CK。土壤代謝熵表現(xiàn)為HC＞MC＞LC＞CK，HC和MC差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 植物根系分泌物對(duì)土壤微生物學(xué)特征的影響Fig. 2 Effect of root exudates on soil microbial characteristics

2.4 土壤微生物群落代謝平均吸光值變化

由圖3可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理微生物碳源利用總體上呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)。在 24—72 h內(nèi)土壤微生物群落AWCD值快速增長(zhǎng)，此時(shí)微生物活性旺盛，之后則趨于平穩(wěn)進(jìn)入平臺(tái)期，培養(yǎng)至156 h時(shí)AWCD又出現(xiàn)小幅度上升。高濃度根系分泌物處理土壤的 AWCD值在整個(gè)培養(yǎng)期內(nèi)均高于對(duì)照及其他處理，且在 72 h后幅度明顯上升。AWCD值大小順序?yàn)椋焊邼舛龋局袧舛龋緦?duì)照＞低濃度。

圖3 土壤微生物群落代謝平均吸光值變化Fig. 3 Changes of mean metabolic absorbance value of soil microbial community

2.5 植物根系分泌物對(duì)土壤微生物群落代謝的影響

圖4為96 h的平均吸光值計(jì)算土壤微生物群落多樣性指數(shù)。由圖可知，不同濃度植物根系分泌物對(duì)土壤微生物群落多樣性有顯著影響，不同濃度植物根系分泌物處理下平均吸光值、物種豐富度指數(shù)、Mcintosh指數(shù)均顯著高于對(duì)照（P＜0.05），不同處理之間差異均顯著（P＜0.05），其大小表現(xiàn)為HC＞MC＞LC＞CK。不同處理間優(yōu)勢(shì)度指數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。

圖4 植物根系分泌物對(duì)土壤微生物群落代謝的影響Fig. 4 Effect of root exudates on soil microbial community metabolism

2.6 土壤微生物群落代謝功能主成分分析

主成分分析（Principal component analysis，PCA）采取降維的方法，使用少數(shù)相互無(wú)關(guān)的綜合指數(shù)反映原始數(shù)據(jù)中所包含的絕大多數(shù)信息。對(duì)不同處理培養(yǎng)96 h后土壤微生物碳源利用能力進(jìn)行主成分分析，取第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）做圖表征微生物群落的代謝特征（圖5）。由圖可知，主成分分析中提取的兩個(gè)主成分因子分別可以解釋所有變量方差的43%和32%。CK和中濃度主要分布在PC2軸的正值端，高濃度主要分布在PC2軸的負(fù)值端，而低濃度則在正負(fù)方向均有分布。4個(gè)處理在PC1軸的正負(fù)兩端均有分布，并未實(shí)現(xiàn)很好的分離。由此可見(jiàn)，中濃度根系分泌物處理的土壤與 CK土壤微生物群落代謝特征相近，其明顯不同于高濃度根系分泌物處理的土壤，說(shuō)明它們對(duì)單一碳源的利用能力不同，其群落代謝特征存在差異。

圖5 土壤微生物群落代謝功能主成分分析Fig. 5 Metabolic function principal component analysis of soil microbial community

不同濃度植物根系分泌物處理下平均吸光值、物種豐富度指數(shù)、Mcintosh指數(shù)均顯著高于對(duì)照（P＜0.05），不同處理之間差異均顯著（P＜0.05），其大小表現(xiàn)為 HC＞MC＞LC＞CK。不同處理間優(yōu)勢(shì)度指數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。主成分分析表明：中濃度根系分泌物處理的土壤與CK土壤微生物群落代謝特征相近，其明顯不同于高濃度根系分泌物處理的土壤，說(shuō)明它們對(duì)單一碳源的利用能力不同，其群落代謝特征存在差異。

3 討論

根系分泌物在改善土壤屬性、提高污染物生物可利用性、緩解環(huán)境脅迫等方面具有重要作用。一方面，根系分泌的某些胞外酶能夠直接參與污染物的降解過(guò)程（高雪峰等，2016；易艷靈等，2019；張小全等，2019）；另一方面，分泌物中的可溶性糖、低分子量有機(jī)酸、氨基酸等物質(zhì)，為根際微生物提供充足的營(yíng)養(yǎng)，增加根際微生物的數(shù)量、提高微生物活性，進(jìn)而加速養(yǎng)分的分解。植物根系土壤理化性狀變化是植物對(duì)土壤樣分的充分吸收、利用，及其適應(yīng)環(huán)境能力的最直接體現(xiàn)（劉海等，2019）。研究結(jié)果表明，不同濃度根系分泌物處理pH值顯著低于CK（P＜0.05）；不同濃度根系分泌物處理下有機(jī)碳、含水量、全氮、堿解氮、速效磷含量顯著高于 CK（P＜0.05），其大小表現(xiàn)為HC＞MC＞LC＞CK ；而土壤全磷無(wú)明顯差異（P＞0.05），與前人的研究結(jié)果一致（徐煒杰等，2017；王璐等，2019）。主要是由于根系分泌物中酸類物質(zhì)水解增加土壤H＋濃度，使土壤pH降低。

土壤微生物量碳與代謝熵等雖是反映土壤質(zhì)量的重要微生物學(xué)指標(biāo)，但卻不能反映微生物群落結(jié)構(gòu)組成，在評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量方面有一定的局限性。土壤微生物種群組成決定了土壤養(yǎng)分周轉(zhuǎn)及退化土壤質(zhì)量的恢復(fù)進(jìn)程，因此，對(duì)進(jìn)入土壤的根系分泌物引起的土壤微生物群落組成與功能變化的評(píng)價(jià)十分重要（Chang，2019）。Biolog方法是基于微生物群落對(duì)碳源的利用度來(lái)描述微生物功能的動(dòng)態(tài)變化，該方法具有靈敏度高，無(wú)需分離純培養(yǎng)微生物，簡(jiǎn)便、快速等特點(diǎn)，被研究人員廣泛應(yīng)用于土壤微生物群落多樣性的研究（Du et al.，2020）。本試驗(yàn)中共檢測(cè)了 3種微生物的數(shù)量變化，結(jié)果顯示，不同濃度植物根系分泌物處理下細(xì)菌、真菌、放線菌和微生物總數(shù)均顯著高于對(duì)照（P＜0.05），不同處理之間差異均顯著（P＜0.05），其大小表現(xiàn)為HC＞MC＞LC＞CK，與前人的研究結(jié)果吻合。他們的結(jié)果證實(shí)了植物根系分泌物中的葡萄糖、有機(jī)酸和酚酸等小分子化合物可以增加細(xì)菌和真菌的豐富度，同時(shí)可以促進(jìn)土壤中細(xì)菌及真菌數(shù)量的生長(zhǎng)。植物對(duì)土壤環(huán)境的重要影響之一是改變土壤微生物群落特征。研究證實(shí)不同的作物對(duì)土壤微生物群落的影響不同，作物通過(guò)根系分泌物在塑造土壤微生物群落中起著重要的作用，不同作物根系分泌物的成分和含量不同，其為根際微生物提供大量的營(yíng)養(yǎng)和能量物質(zhì)，使土壤微生物的活性和生態(tài)分布發(fā)生改變，并改變了土壤微生物群落的生長(zhǎng)代謝，從而產(chǎn)生明顯的根際效應(yīng)（Wang et al.，2018）。

4 結(jié)論與展望

研究了不同濃度植物根系分泌物的微生態(tài)效應(yīng)（土壤理化性質(zhì)、土壤微生物群落功能多樣性、微生物量碳、微生物熵、基礎(chǔ)呼吸和代謝熵）。不同濃度根系分泌物處理 pH值顯著低于 CK（P＜0.05）；有機(jī)碳、含水量、全氮、堿解氮、速效磷含量顯著高于 CK（P＜0.05）。細(xì)菌、真菌、放線菌、微生物總數(shù)、微生物量碳、微生物熵和基礎(chǔ)呼吸均顯著高于對(duì)照（P＜0.05）。綜合分析表明：中濃度根系分泌物處理的土壤與CK土壤微生物群落代謝特征相近，其明顯不同于高濃度根系分泌物處理的土壤，說(shuō)明它們對(duì)單一碳源的利用能力不同，其群落代謝特征存在差異。然而，在實(shí)際的根系環(huán)境中，根系分泌物成分復(fù)雜，根系微環(huán)境組成和影響因素多種多樣。本試驗(yàn)在相同的土壤條件下，僅澆灌不同提取時(shí)間的根系分泌物而使得植物根際土壤微生物數(shù)量和土壤理化性狀產(chǎn)生差異，這說(shuō)明根際土壤微環(huán)境與植物根系分泌物產(chǎn)生和釋放的種類和濃度有密切關(guān)系。雖然根系分泌物中小分子化合物、有機(jī)酸、酚酸等物質(zhì)的功能已有大量研究，但大多數(shù)物質(zhì)在復(fù)雜多樣的根際環(huán)境中的作用是否與其單獨(dú)作用對(duì)土壤微生物和理化性狀的影響是否具一致性，仍需進(jìn)一步研究。