同位素內(nèi)標-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定畜禽糞便中6種雌激素

賀德春，胡嘉梧，梁紫薇，李艷，鄒夢遙，吳錦豪

1. 生態(tài)環(huán)境部華南環(huán)境科學(xué)研究所，廣東 廣州 510530；2. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣東 廣州 510225；3. 重慶三峽學(xué)院，重慶 404199

雌激素是一類由生物體內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生或人工合成的具有較強內(nèi)分泌干擾性的化合物，主要包括雌酮（E1）、雌二醇（E2）、雌三醇（E3）等天然雌激素和炔雌醇（EE2）、己烯雌酚（DES）等人工合成的雌激素。研究表明雌激素污染對動植物和人類均能產(chǎn)生一定影響，能擾亂水中魚類的生理功能，影響其生殖與發(fā)育，影響植物根和芽的發(fā)育和開花，誘發(fā)人類乳腺癌和前列腺癌等，是一類備受學(xué)術(shù)界關(guān)注的有機污染物（Adeel et al.，2017；Zhao et al.，2019）。糞便是環(huán)境雌激素的重要來源之一，據(jù)Lange et al.（2002）的估算，歐盟和美國農(nóng)場畜禽糞便雌激素的年排放總量分別為33 t和49 t，其中奶牛糞便雌激素排放占比分別為 63.6%和87.76%；中國豬糞、牛糞和人糞的雌激素年排放量估計值分別為16.7、9.55和2.03 （tLiu et al.，2012）；另有報道采用模型估算中國人和動物的類固醇雌激素總排放量為3069 t·a-1，其中三分之二來源于動物（Zhang et al.，2014a）。通常畜禽糞便會作為有機肥被還田使用，糞污還田過程中雌激素的流失會對農(nóng)田土壤和周邊地下水造成污染（Zhao et al.，2019）。因此，建立高效、準確、重現(xiàn)性好的糞便中雌激素分析方法，對研究畜禽糞便雌激素的含量及組成特征、堆肥等處理過程中降解轉(zhuǎn)化規(guī)律、還田后環(huán)境影響及控制對策有重要意義。

相比其他基質(zhì)，畜禽糞便樣品基質(zhì)較復(fù)雜，含有較多的干擾物質(zhì)，儀器定量時易產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)（Marchi et al.，2010）。因此，樣品前處理，尤其是凈化方法是分析過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。常見的凈化方法有自制硅膠柱凈化（Liu et al.，2012）和固相萃取凈化（付銀杰等，2013；Gineys et al.，2010）。自制硅膠柱凈化易因填料和填充過程的差異而不穩(wěn)定，難以普遍采用。與自制硅膠柱相比，固相萃取小柱具有更寬的pH范圍、更高的吸附容量和更好的重現(xiàn)性等。儀器方法主要有液相色譜法（付銀杰等，2013）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（王建華等，2007；Derrien et al.，2011）和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（Mat?j??ek et al.，2007；張洪昌等，2016）等。液相色譜法操作簡便，但靈敏度低，結(jié)果重復(fù)性較差；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法雖靈敏、準確，但不能直接分析，需衍生化，操作繁瑣；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法則是一種具有分析時間短、無需衍生化反應(yīng)、可實現(xiàn)雌激素高靈敏度和快速準確分析的方法（余薇薇等，2020；Liu et al.，2014；Arioli et al.，2008）。

目前，國內(nèi)外有關(guān)雌激素檢測的方法大多是針對水體、活性污泥和土壤等基質(zhì)，而專門針對畜禽糞便中雌激素測定的方法報道較少?，F(xiàn)有報道中，付銀杰等（2013）優(yōu)化了畜禽糞便中17β-E2、E3和EE2測定的超聲提取-固相萃取-高效液相色譜法，加標回收率為 75.1%—89.6%（RSD為 0.6%—5.7%）；韓進等（2019）采用超聲提取-固相萃取-高效液相色譜法對堆肥糞便中17β-E2、E3和EE2分析的加標回收率為75.1%—117.0%（RSD為1.5%—5.7%）。在固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法應(yīng)用方面，劉敏等（2011）優(yōu)化了豬糞中E1、17α-E2、17β-E2和E3的測定方法，加標回收率在 92.3%—137.4%；Singh et al.（2013）對豬糞中游離態(tài)雌激素分析的加標回收率為 (91%±13%)；Andaluri et al.（2012）對堆肥糞便中17α-E2、17β-E2、E1和E3等7種雌激素進行分析，加標回收率在 11%—185%（RSD＜8.4%）。此外，胡雙慶等（2020）等采用微波輔助萃取-高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法分析豬糞中的E1、E2、E3、EE2和DES，加標回收率為61.3%—91.2%（RSD＜7.1%）。針對畜禽糞便基質(zhì)復(fù)雜、干擾嚴重等問題，本研究引入同位素內(nèi)標進行基質(zhì)效應(yīng)校正，同時進一步優(yōu)化前處理方法，最終建立了一種高靈敏度且定量準確的畜禽糞便中雌激素測定的同位素內(nèi)標-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與實驗材料

UltiMate 3000高效液相色譜儀（美國Thermo公司）；TSQ Vantage三重四級桿質(zhì)譜儀（美國Thermo公司）；Thermo Accucore Biphenyl（TAB）液相色譜柱（100×2.1 mm，2.6 μm，美國Thermo公司）；固相萃取裝置（Mediwax-12，上海旌派公司）；冷凍干燥機（SCIENTZ-18N，新芝生物公司）；數(shù)控超聲波清洗機（KQ-250E，昆山超聲儀器公司）；離心機（TDL-5-A，上海安亭公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BüCHI Rotavapor? R-300，瑞士步琦公司）；氮吹儀（NDK 100-2，上海百典公司）；CNW Poly-Sery HLB Pro固相萃取柱（500 mg，6 mL）；親水性PVDF針式濾膜（25 mm×0.45 μm）和有機相尼龍針式濾膜（13 mm×0.22 μm），均購自上海安譜公司。

6種目標物雌酮（E1）、17α-雌二醇（17α-E2）、17β-雌二醇（17β-E2）、雌三醇（E3）、17α-炔雌醇（17α-EE2）和己烯雌酚（DES），購自德國Dr. E公司；與目標物相對應(yīng)的6種氘代同位素雌酮-d2（E1-d2）、雌二醇-d2（E2-d2）、雌二醇-d3（E2-d3）和雌三醇-d2（E3-d2），純度均為＞99%，購于加拿大CDN公司；炔雌醇-d4（EE2-d4，99%）和己烯雌酚-d8（DES-d8，99%），購于加拿大TRC公司；甲醇、乙腈（HPLC級、LC-MS級，德國CNW公司）、氟化銨（LC-MS級，美國Fluka公司）；高純氮氣（99.999%，廣州丹歐童公司）。

1.2 標準溶液的配制

標準儲備液及工作液的配制：分別準確稱取 6種雌激素（E1，17α-E2，17β-E2，E3，17α-EE2，DES）標準品 (10.00±0.01) mg，用甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至5 mL棕色容量瓶中定容，得到濃度為 2.00×106ng·mL-1的單一標準儲備液；然后用甲醇稀釋上述單一標準儲備液，配制成含各組分濃度為 2.00×104ng·mL-1的混合標準儲備液，于-20 ℃條件下保存。使用時，用甲醇稀釋混合標準儲備液，配制成2000 ng·mL-1的混合標準工作液。同法配制6種同位素內(nèi)標的單一、混合標準儲備液和工作液。定量工作曲線配制時需同時混合6種雌激素和同位素內(nèi)標，工作曲線目標物的濃度梯度為1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000 ng·mL-1，同位素內(nèi)標的濃度為 100 ng·mL-1。

1.3 樣品采集和制備

在廣東省選取生豬養(yǎng)殖場，奶牛養(yǎng)殖場和肉雞養(yǎng)殖場各1家，采集單頭牲畜某一天排泄的所有新鮮糞便，用密封袋裝好后盡快運回實驗室，冷凍干燥48 h后研磨過20目篩，避光冷藏保存。

1.4 樣品前處理

準確稱取糞便樣品 (1.00±0.01) g于 35 mL具塞玻璃離心管中，加入50 μL濃度為2000 ng·mL-1的同位素混合內(nèi)標工作液，混勻后于4 ℃下冷藏放置12 h以平衡。向離心管加入10 mL乙腈，超聲提取15 min后，3500 rpm離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至梨形燒瓶中，繼續(xù)重復(fù)上述操作2次。合并3次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加1 mL甲醇復(fù)溶，再加7 mL純水稀釋，超聲混勻后轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，5000 r·min-1離心5 min，取上清液過0.45 μm PVDF濾膜后待凈化。

HLB柱先后用5 mL甲醇、10 mL水及5 mL甲醇—水溶液（1:7，V/V）活化。將提取液上柱，調(diào)節(jié)過柱流速不超過1 drop·s-1，過完柱后用10 mL乙腈水溶液（15%）淋洗固相萃取柱，待無液體流過萃取柱后，繼續(xù)抽真空20 min。樣品用10 mL甲醇洗脫，洗脫液氮吹至1 mL左右，用甲醇定容至1 mL，過0.22 μm有機相尼龍濾膜后待測。

1.5 色譜和質(zhì)譜條件

液相條件：Thermo Accucore Biphenyl液相色譜柱（100×2.1 mm，2.6 μm，美國Thermo公司）柱溫為室溫，流動相A為2 mM氟化銨溶液，B為甲醇；流速為0.4 mL·min-1，進樣量為3 μL。梯度淋洗程序為：0—3.5 min，B從 50%升至 80%；3.5—6.5 min，B從 80%升至 100%；6.5—9.0 min，B保持100%；9.0—9.5 min，B從100%降至50%；9.5—12 min，B保持50%。

質(zhì)譜條件：選擇反應(yīng)監(jiān)測（Selected Reaction Monitoring，SRM）掃描模式，電噴霧離子源（Electrospray ionization，ESI）。使用負離子電離模式，噴霧電壓2.5 kV。離子源溫度350 ℃，鞘氣20.7 kPa，輔助氣5.18 kPa，離子傳輸毛細管溫度350 ℃，碰撞氣0.2 Pa。各目標化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1 各化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 Tandem mass spectrometric parameters for target compounds

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 色譜柱選擇

本研究選取了 Agilent SB-C18（SB-C18）和Thermo Accucore Biphenyl（TAB）兩種色譜柱進行分離效果的對比。當進樣濃度均為 50 ng·mL-1時，在優(yōu)化儀器參數(shù)的基礎(chǔ)上，使用TAB色譜柱分離時，包括E3、17α-E2、17β-E2和17α-EE2在內(nèi)的大部分目標物的特征離子峰峰形和分離效果均好于SB-C18色譜柱。同時，相應(yīng)同位素內(nèi)標的特征離子峰在TAB上的分離效果也明顯優(yōu)于在 SB-C18色譜柱上的分離效果。因此選用TAB色譜柱分離雌激素。

2.1.2 流動相選擇

選用常見的反相色譜流動相乙腈和甲醇進行對比。在樣品的濃度為50 ng·mL-1時，乙腈作為流動相能得到雌激素良好的分離峰形，然而當樣品中雌激素濃度較低時（1 ng·mL-1），乙腈作為流動相會導(dǎo)致部分目標物無法出峰或峰形變差；以甲醇為流動相時，分離的6個化合物可正常出峰且峰形較好，響應(yīng)值也更高，如圖1所示。因此選擇甲醇為流動相。

圖1 流動相為乙腈（a）和甲醇（b）時E1、17α-E2、17β-E2、E3、17α-EE2和DES特征離子質(zhì)量色譜圖（濃度為1 ng·mL-1）Fig. 1 Characteristic ion mass chromatograms of estrone,17α-estradiol, 17β-estradiol, estriol, 17α-ethinyl estradiol, and diethylstilbestrol under mobile phase of (a) acetonitrile and (b) methanol (1 ng·mL-1)

2.2 固相萃取條件的選擇

2.2.1 提取劑選擇

根據(jù)Human metabolome database（The metabolomics innovation center，2020）的數(shù)據(jù)，待測雌激素的 LogKow值（辛醇/水分配系數(shù)）為 3.13—5.19之間，為弱極性或中極性化合物。根據(jù)相似相溶原理，它們較易溶于弱極性或中極性有機溶劑。已報道的常用提取溶劑有：甲醇水溶液（Mat?j??ek et al.，2007）、乙腈（譚芳等，2014）、丙酮（Han et al.，2011）、甲醇∶丙酮（1∶1）（張洪昌等，2016；Chen et al.，2012；Zhang et al.，2014b）、乙酸乙酯（Liu et al.，2011；韓進等，2019）等，另有研究（劉敏等，2011）表明甲醇:丙酮（1∶1）的效果優(yōu)于甲醇∶丙酮（2∶1），因此本研究選擇甲醇∶丙酮（1∶1）（MeOH∶ACT（1∶1））、乙腈（ACN）與乙酸乙酯（EAC）作為提取溶劑進行對比（溶劑提取后凈化操作相同），結(jié)果如圖2。3種提取劑對6種雌激素均有較好的提取效果，對于加標量為 100 ng·g-1糞便樣品，甲醇∶丙酮（1∶1）、乙腈和乙酸乙酯提取后各雌激素的回收率范圍分別在 87.39%—99.47%、87.61%—97.38%和81.30%—99.12%之間。相對而言，乙酸乙酯對17β-E2提取的回收率相對偏低。此外，從特征離子的質(zhì)量色譜圖可見，使用甲醇∶丙酮（1∶1）提取時個別目標物的定量峰附近有幾個較小的雜峰干擾定量，而使用乙腈提取時定量峰附近的雜峰較少，有利于準確定量，因此最終選擇乙腈作為提取溶劑。

圖2 提取劑對固相萃取回收率的影響Fig. 2 Effect of extraction solvent on the recoveries of SPE

2.2.2 淋洗劑的選擇

合適的淋洗劑能在保留目標物的同時去除吸附在固相萃取柱上的干擾組分。實驗所用SPE萃取體系為反相萃取體系，淋洗劑多為有機溶劑水溶液，對比了甲醇水溶液和乙腈水溶液的淋洗效果，發(fā)現(xiàn)乙腈水溶液的淋洗效果更好。進一步確定淋洗劑的配比，為了避免目標物被淋洗出來，有機溶劑比例不宜過高，因此對比了15%和30%的乙腈水溶液（CAN-Water solution）對目標物回收率的影響。結(jié)果如圖3所示，用15%的乙腈水溶液淋洗效果更好，多數(shù)目標物的回收率在82.64%—116.76%之間。30%乙腈水溶液作為淋洗劑時會導(dǎo)致部分待測目標物（如E3）的流失（回收率降低至74.81%），因此綜合考慮干擾去除效果和回收率，確定選用15%乙腈水溶液為淋洗劑。

圖3 淋洗劑乙腈體積分數(shù)對固相萃取回收率的影響Fig. 3 Effect of volume fraction of acetonitrile in elution on the recoveries of SPE

2.2.3 洗脫劑的選擇

洗脫是影響凈化效果的重要環(huán)節(jié)之一，需要確定合適的洗脫劑及洗脫體積。據(jù)文獻報道，在類固醇雌激素分析中常用的洗脫溶劑主要有甲醇（譚麗超等，2011；袁哲軍等，2017）、乙腈（師博穎等，2018；Zheng et al.，2011）。本研究比較了10 mL體積洗脫下甲醇（MeOH）、乙腈（ACN）不同配比的 5 種洗脫劑，即甲醇、甲醇∶乙腈（1∶9、1∶1、9∶1）和乙腈的洗脫效果，結(jié)果如圖4所示。用甲醇洗脫時，6種目標物的回收率在82.28%—102.22%之間；用乙腈洗脫時，目標物的回收率差異較大，且對DES回收率過低（43.72%）；甲醇-乙腈混合溶劑的洗脫效果也均未表現(xiàn)出優(yōu)勢。此外，實驗過程發(fā)現(xiàn)，乙腈做流動相時對低濃度樣品的分離有影響，會使峰形變差或使部分目標物無法出峰（見圖1），如用甲醇—乙腈溶劑進行洗脫，則需將洗脫溶劑完全吹干后再用甲醇定容，耗時較長且操作繁瑣。因此綜合考慮選擇甲醇作為洗脫劑。對不同用量（8、10、15 mL）洗脫劑的洗脫效果進行了對比研究，3種體積洗脫劑對目標物洗脫的回收率在80.54%—102.44%之間（圖5），均表現(xiàn)出較好的洗脫效率。相對而言，洗脫劑體積為8 mL時回收率較差，10 mL洗脫體積對大部分化合物的洗脫效果要優(yōu)于15 mL的洗脫體積。因此選用10 mL甲醇進行洗脫。

圖4 洗脫劑對固相萃取回收率的影響Fig. 4 Effect of elution solvent on the recoveries of SPE

圖5 洗脫劑體積對固相萃取回收率的影響Fig. 5 Effect of eluent volume on the recoveries of SPE

2.2.4 固相萃取小柱的選擇

Waters Oasis HLB（簡稱 Waters HLB柱）和CNW Poly-Sery HLB Pro（簡稱CNW HLB柱）小柱填料均為親水親脂平衡且水可浸潤的反相吸附劑，對酸性、中性及堿性化合物均具有較好的吸附性能，兩種柱子在功能上差別并不大，但價格相差較大。本研究對比了兩種萃取柱的凈化效果。結(jié)果表明，兩種萃取柱對目標化合物均有較好的凈化效果（圖6）。CNW HLB柱除了對17α-E2的回收率略低（73.32%）外，對其余5種目標物的回收率均在90.11%—99.65%之間；Waters HLB柱對6種目標物的回收率為85.37%—113.26%。CNW HLB柱對3種目標物的回收率優(yōu)于Waters HLB柱，綜合考慮樣品預(yù)處理效果與檢測成本，選用CNW HLB柱作為固相萃取柱。

圖6 固相萃取小柱的回收率對比Fig. 6 Recoveries comparisons of SPE columns

2.3 線性范圍、檢出限和定量限

配制 1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000 ng·mL-1系列濃度的混合標準溶液進樣分析，以目標物峰面積與同位素內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標，溶液濃度為橫坐標，繪制定量工作曲線。結(jié)果表明，在1—1000 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)，各目標化合物定量工作曲線的相關(guān)系數(shù)R2均≥0.9990。研究過程發(fā)現(xiàn)，6種目標物中17β-E2能夠準確定量的濃度需要達到5 ng·g-1左右，為所有目標物中最難準確定量的物質(zhì)。因此本研究選擇5 ng·g-1的基質(zhì)加標樣品，根據(jù)公式MDL=t(n-1,0.99)×S（t取值單側(cè)置信度99%，S為7次測定的標準偏差）計算方法檢出限（LODs）和方法定量限（LOQs）（中國環(huán)境科學(xué)研究院，2010），得出各化合物的方法檢出限為0.25—0.95 ng·g-1，方法定量限（4倍檢出限）為1.00—3.82 ng·g-1，計算得到的方法定量限與實際研究情況相符（最高5 ng·g-1左右）。6種雌激素標準曲線的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限等見表2。與其他方法相比（表3），在5—1000 ng·g-1的范圍內(nèi)，本方法 6種雌激素的回收率均在90.2%—103.2%以內(nèi)，方法更穩(wěn)定，選擇性更好，檢出限也較其他方法低?？梢姡凰貎?nèi)標的使用能有效校正基質(zhì)效應(yīng)，提高定量的準確性。

表2 6種雌激素定量工作曲線的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、加標回收率和精密度Table 2 Linear equations, correlation coefficients (R2), LODs, LOQs, spiked recoveries and precisions of 6 estrogens

表3 方法回收率及方法檢出限比較Table 3 Comparisons of Recovery and LODs of different methods

2.4 回收率和精密度

取豬糞樣品進行低（5、50 ng·g-1）、中（200 ng·g-1）高（1000 ng·g-1）4 個濃度水平的基質(zhì)加標重復(fù)實驗以驗證方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，每個濃度水平重復(fù) 5次。加標樣品在-4 ℃條件下放置過夜后用優(yōu)化方法測定各目標物的濃度，并計算回收率與相對標準偏差（表2）。由表2可知，4個濃度添加水平的平均回收率為 90.2%—103.2%，RSD為0.09%—9.08%，方法適用濃度范圍廣，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好。

2.5 實際樣品檢測

應(yīng)用優(yōu)化方法對某養(yǎng)豬場、某養(yǎng)牛場和某養(yǎng)雞場不同生長時期或孕育階段的樣品進行檢測，共分析了6個豬糞樣品（保育豬、育成育肥豬和能繁母豬各2個）、3個牛糞樣品（犢牛、育成牛和泌乳牛各1個）和3個雞糞（肉雞）樣品，結(jié)果如表4所示。糞便雌激素種類及含量與畜種及其生長時期或孕育階段有關(guān)。E1在所有畜禽糞便中都能檢出，為檢出率最高、含量也最高的雌激素，與部分相關(guān)研究的結(jié)果一致（Han et al.，2011），且泌乳牛糞便中E1含量高于犢牛和育成牛。17α-EE2和DES的可定量檢出率較低，表明人工合成雌激素的使用已得到有效控制。雞糞中雌激素的含量遠高于豬糞和牛糞中的含量。17α-E2和17β-E2在保育期和妊娠期豬糞中能檢出，而在育成育肥期未能定量檢出，說明 E2與生殖和發(fā)育過程相關(guān)。此次分析的畜禽糞便樣品中雌激素含量范圍為＜LOQ—778.32 ng·g-1，與相關(guān)研究報道的含量水平一致（Andaluri et al.，2012；Hanselman et al.，2003）。

表4 畜禽糞便樣品中6種雌激素的含量Table 4 The contents of 6 estrogens in livestock manures

3 結(jié)論

本研究建立了同時測定畜禽糞便中 6種雌激素的同位素內(nèi)標-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。同位素內(nèi)標的應(yīng)用有效校正了前處理過程中基質(zhì)效應(yīng)及目標物損失導(dǎo)致的結(jié)果偏差，提高了方法的準確性和對不同糞便基質(zhì)的適應(yīng)性。該方法靈敏度高，準確性和重復(fù)性好，能夠滿足各類畜禽糞便中不同濃度水平雌激素的分析要求，為研究糞便雌激素含量水平、污染現(xiàn)狀及控制技術(shù)提供了有效檢測手段。