土壤中稀有放線菌選擇性分離方法

劉蓮娜,劉淑艷,王夢珂,徐 婷,李亞寧

(1.河北北方學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，河北 張家口 075000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，河北 保定 071001)

放線菌是抗生素及其它生物活性物質(zhì)的主要生產(chǎn)者，作為一類重要的功能性微生物資源，日益受到科研工作者的關(guān)注。放線菌可以產(chǎn)生多種類型的抗生素、抗腫瘤物質(zhì)、免疫抑制劑等。世界上已發(fā)現(xiàn)的抗生素大約有三分之二是由放線菌產(chǎn)生的，其中70%以上由鏈霉菌產(chǎn)生[1-3]。越來越多的鏈霉菌被重復(fù)發(fā)現(xiàn)，使得從鏈霉菌中獲得新的活性物質(zhì)的幾率越來越低。為了獲得新的物種并從中分離得到新的活性代謝產(chǎn)物，人們逐漸將研究對象轉(zhuǎn)為稀有放線菌(rare actinomycetes)[4-5]。稀有放線菌通常指非鏈霉菌，采用常規(guī)分離手段進(jìn)行分離，其分離頻率遠(yuǎn)低于鏈霉菌。近年來，隨著新的選擇性分離方法及基因技術(shù)的開發(fā)，稀有放線菌的分離數(shù)量不斷增加。稀有放線菌的分離，不僅可以減少對菌株的重復(fù)分離，還可以發(fā)現(xiàn)更多生物活性物質(zhì)，為新藥的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

自然界的絕大多數(shù)稀有放線菌難以純培養(yǎng)。對稀有放線菌資源進(jìn)行勘探，并設(shè)計(jì)有效的稀有放線菌分離方法對發(fā)現(xiàn)放線菌新種屬至關(guān)重要。土壤中稀有放線菌選擇性分離方法包括對土壤樣品進(jìn)行預(yù)處理與富集、抑制劑的添加、培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)等，本文對此作一綜述，以期為科研人員分離稀有放線菌提供參考。

1 樣品預(yù)處理

從土壤中選擇性分離稀有放線菌，土樣預(yù)處理尤為關(guān)鍵。土樣預(yù)處理不但可以抑制一部分包括細(xì)菌和真菌在內(nèi)的非目的菌的生長，還有利于稀有放線菌孢子的萌發(fā)，提高目的稀有放線菌的出菌率。土樣預(yù)處理方法不同，稀有放線菌的分離效果也不同。

1.1 物理手段

物理處理包括自然風(fēng)干、熱處理、分散和差速離心法(dispersion and differential centrifugation，DDC)、密度梯度離心法、微波、超聲波、極高頻輻射法(extremely high frequency radiation，EHF)、電脈沖及紫外線照射等。

1.1.1 自然風(fēng)干 土壤風(fēng)干20 d，可使90%以上的細(xì)菌死亡。很多學(xué)者對土壤進(jìn)行自然風(fēng)干處理，從土壤中分離得到了不同種類的稀有放線菌。樊炳君等[6]將土壤樣品在無菌條件下風(fēng)干，分離得到小單孢菌屬(Micromonospora)和野野村氏菌屬(Nonomuraea)。田華[7]發(fā)現(xiàn)土壤樣品風(fēng)干6 d，可從中分離得到較多的放線菌?？灯贾8]的研究結(jié)果表明，風(fēng)干處理土樣7-10 d，放線菌的分離效果較好，分離到的放線菌數(shù)量和種類較多，且易于純化，雜菌明顯減少。

1.1.2 熱處理 熱處理包括干熱處理和濕熱處理，干熱處理是普遍使用的預(yù)處理方法[9-10]。對土壤100 ℃或120 ℃干熱處理1 h，可以有效分離多種稀有放線菌[11]。李載淵[12]對五指山原始林區(qū)采集的土樣120 ℃干熱處理1 h，分離得到了90株稀有放線菌。在50～70℃條件下，對土壤懸浮液加熱處理一定時(shí)間(5～20 min)即為濕熱法。該法可促使稀有放線菌孢子萌發(fā)，有利于稀有放線菌的分離[13]。Niyomvong等[14]對樣品同時(shí)進(jìn)行濕熱處理(50℃，6 min)和干熱處理(120℃，1 h)，同時(shí)采用1.5%苯酚預(yù)處理樣品，可減少非目的細(xì)菌的數(shù)量，提高選擇性分離多種稀有放線菌的效果。

1.1.3 分散和差速離心法 分散和差速離心法的主要原理是綜合運(yùn)用物理和化學(xué)手段，破壞土壤團(tuán)粒的聚集，使微生物從土壤顆粒充分釋放后，進(jìn)行差速離心，可顯著提高稀有放線菌的分離效率[15-17]。羅紅麗等[18]從西藏地區(qū)采集土樣，使用酵母麥芽浸汁瓊脂培養(yǎng)基(ISP 2)和高氏一號培養(yǎng)基，通過分散差速離心法分離得到放線菌156株，其中包括5個(gè)稀有放線菌屬。崔慶鋒[19]采用分散和差速離心法和常規(guī)分離方法分離出20株稀有放線菌。何建清等[20]用分散差速離心法分離了拉魯濕地中的諾卡氏菌屬(Nocardia)、小鏈孢菌屬(Microstreptospora)、馬杜拉放線菌屬(Actinomadura)、小單孢菌屬等稀有放線菌。丁蕓等將土壤樣品經(jīng)分散差速離心預(yù)處理后，涂布添加了抗生素的GTV培養(yǎng)基，選擇性分離出酸性土壤中多種嗜酸放線菌。

1.1.4 密度梯度離心法 濃氯化銫溶液和蔗糖等一些小分子溶液可被用作制備濃度梯度，對土壤中存在的稀有放線菌孢子進(jìn)行選擇性分離。Karwowski等[22]根據(jù)放線菌孢子浮力密度的差異，利用氯化銫密度梯度超速離心法從土壤中分離出小單孢菌。Yamamura等[23]利用蔗糖密度梯度離心法選擇性分離出諾卡氏菌。

1.1.5 微波及超聲波 適度微波處理可使部分不可培養(yǎng)放線菌的孢子萌發(fā)，轉(zhuǎn)化為可培養(yǎng)放線菌。R.S.Ferriss[24]對土壤進(jìn)行微波輻射處理，顯著提高了稀有放線菌的分離效果。楊斌等[25]通過微波對土壤進(jìn)行預(yù)處理后發(fā)現(xiàn)，微波處理可提高原小單孢菌屬和鏈輪絲菌屬等稀有放線菌屬分離效率。王東勝[26]采用120 W、2 450 MHz微波對土壤進(jìn)行預(yù)處理，分離得到諾卡氏菌屬和倫茨菌屬(Lentzea)，提高了土壤中稀有放線菌的分離效果。

超聲波處理使用槽式超聲波清洗器處理土壤懸液40 s，可大大增加放線菌的出菌種類和數(shù)量，顯著提高分離稀有放線菌的效率，是一種經(jīng)濟(jì)且簡便易行的方法。徐小雄等[27]利用50 Hz超聲波處理土壤樣品30 min，篩選得到假諾卡氏菌屬(Pseudonocardia)、野野村氏菌屬、小單孢菌屬等多種稀有放線菌。

1.1.6 極高頻輻射法 極高頻輻射法(extremely high frequency radiation，EHF)可以選擇性地分離那些能耐受EHF輻射強(qiáng)度，甚至受到EHF刺激后可被其激活生長的稀有放線菌，如原小單孢菌屬(Promicromonospora)、珊瑚狀放線菌屬(Actinocorallia)、野野村氏菌屬和荒漠?dāng)M孢囊菌屬(Kibdelosporangium)等。研究表明，EHF處理可以增加稀有放線菌的分離數(shù)量[28]。

1.2 化學(xué)處理

化學(xué)處理主要是通過添加適當(dāng)濃度的化學(xué)物質(zhì)來篩選目的稀有放線菌。不同的放線菌孢子對化學(xué)試劑的耐受能力不同，可在土壤中添加不同的化合物進(jìn)行預(yù)處理，用于特殊稀有放線菌的分離。常用的化學(xué)物質(zhì)有苯酚、SDS(十二烷基磺酸鈉)、葡萄糖酸氯己定、芐索氯胺、氯胺-T、萘啶酮酸、重鉻酸鉀等。苯酚可殺滅土壤中的細(xì)菌、真菌和鏈霉菌，利用1.5%苯酚預(yù)處理土樣可有效提高土壤中稀有放線菌的分離效果[29-31]。M.Hayakawa[32]使用氯胺-T對土壤進(jìn)行預(yù)處理，細(xì)菌、鏈霉菌和其它非目的放線菌在HV瓊脂培養(yǎng)基上的生長受到嚴(yán)格抑制，可選擇性分離出小單孢菌屬、小四孢菌屬(Microtetraspora)和鏈孢囊菌屬(Streptosporangium)。

1.3 化學(xué)趨化處理

趨化法最初由Palleroni[33]為選擇分離游動放線菌而提出，利用游動放線菌的游動孢子囊能被Cl-和Br-吸引的特性，在特殊設(shè)置的分離裝置中加入KCl緩沖液，選擇性分離該屬放線菌。該分離方法因需要特殊的分離裝置，使用范圍較小，相關(guān)的研究不是很多。

1.4 生物學(xué)手段(噬菌體定向分離法)

噬菌體技術(shù)將對一種或幾種鏈霉菌有裂解作用的噬菌體加入土樣中，以減少非目標(biāo)菌的數(shù)量，提高目的稀有放線菌的出現(xiàn)頻率。Kurtboke[34]利用該技術(shù)已從南極土壤和海洋沉積物中分離得到一些具有活性的稀有放線菌。彭云霞等[35]研究發(fā)現(xiàn)，利用噬菌體S3和S7專一性感染裂解鏈霉菌，抑制大多數(shù)鏈霉菌的生長，結(jié)合多種預(yù)處理方法，可提高從土壤中篩選稀有放線菌的效果。Esther等[36]設(shè)計(jì)了一種以細(xì)菌噬菌體作為指示物，對環(huán)境樣品中的野野村氏菌屬進(jìn)行快速篩選和分離的新方法。首先確定土樣中是否含有能感染目標(biāo)菌的噬菌體，對能產(chǎn)生噬菌斑的土樣，采用常規(guī)的選擇性分離方法對目標(biāo)菌進(jìn)行分離。近年來，鮮有文獻(xiàn)報(bào)道使用噬菌體定向分離法分離稀有放線菌。

2 富集培養(yǎng)

富集培養(yǎng)又稱增殖培養(yǎng)、加富培養(yǎng)。在分離培養(yǎng)基中加入目的菌所需的特殊營養(yǎng)物質(zhì)和微量元素(如氨基酸、維生素等)，同時(shí)加入非目的菌的抑制劑，并創(chuàng)造有利于目的菌生長的條件，使目的微生物迅速生長繁殖，使其變?yōu)閮?yōu)勢菌群，更利于分離出該特定微生物，提高選擇性分離效果[37]。

2.1 天然材料誘捕法(誘餌法)

天然材料誘捕法是利用天然物質(zhì)作為誘餌捕獲放線菌，主要用于游動放線菌的分離。使用預(yù)消毒的誘物毛發(fā)或花粉作為誘導(dǎo)劑，可分離得到小瓶菌屬、螺孢菌屬、小雙孢菌屬、小單孢菌屬和發(fā)仙菌屬(Pilimelia)[38]。Hayakawa[10]通過添加木糖、氯化物、溴化物、γ-三甲基吡啶及香草醛等趨化物分離得到多種可產(chǎn)生游動孢子的稀有放線菌。鈣離子可以刺激放線菌菌絲的形成，利用CaCO3能富集分離放線動孢菌屬[39]。用蛇皮作誘餌可分離瓶孢菌屬[40]。Suzuki等[41]用脫脂牛奶對土樣進(jìn)行預(yù)處理，能刺激魚孢菌屬孢子運(yùn)動，pH=8.0時(shí)，孢子運(yùn)動頻率最大。脫脂牛奶結(jié)合離心法還可選擇性有效分離動孢菌屬。CaCl2可促進(jìn)雙孢放線菌屬(Actinobispora)氣生孢子的形成[42]。

2.2 再水化-離心過濾法(rehydration and centrifugation，RC)

Hayakawa等[16]在Makkar和Cross的再水化法基礎(chǔ)上發(fā)明了再水化-離心法，用于稀有放線菌的分離。Otoguro等[43]通過碳酸鈣及離心過濾相結(jié)合的方法成功地從土壤和植物落葉中分離得到了動孢放線菌屬和其它放線菌。Qin等[44]使用該法分離得到糖多孢菌屬、迪茨氏菌屬、芽生球菌屬等稀有放線菌。Duong等[45]利用再水化-離心法分離出小單孢菌和鏈孢霉菌。

3 抑制劑的選擇

可采用選擇性抑制劑分離稀有放線菌。選擇抑制劑有兩方面要求：一是抑制真菌和細(xì)菌，而又不抑制目的菌；二是抑制非目的放線菌(如常見鏈霉菌)，而不抑制目的菌。目前實(shí)驗(yàn)中廣泛使用的兩組高效抑制劑為①100 mg·L-1的放線菌酮(或100 mg·L-1制霉菌素)和20 mg·L-1的萘啶酮酸；②50～75 mg·L-1的重鉻酸鉀。萘啶酮酸可抑制細(xì)菌生長，放線菌酮和制霉菌素可抑制真菌生長。王書睿[46]采用高氏一號培養(yǎng)基和腐殖酸培養(yǎng)基作為選擇培養(yǎng)基，以萘啶酮酸、放線菌酮和重鉻酸鉀為抑制劑，分離得到了小單孢菌屬、野野村氏菌屬、糖絲菌屬和小鏈孢菌屬等稀有放線菌。李小俊[47]用萘啶酮酸、放線菌酮、重鉻酸鉀作為抑制劑，從九蓮城淖爾土壤樣品中分離到優(yōu)勢菌屬擬諾卡氏菌屬和涅斯捷連科氏菌屬的嗜堿放線菌。M.Hayakawa等[48]使用1.5%的苯酚溶液和0.03%葡萄糖酸洗必泰作為抑制劑，可富集培養(yǎng)得到小單孢菌。劉文祥[49]在土壤樣品中加入阿米卡星，并用苯酚對樣品預(yù)處理后，可有效分離具有抑菌活性的小單孢菌。部分稀有放線菌種屬及其選擇性抑制劑見表1。

表1 部分稀有放線菌屬及其選擇性抑制劑

表1(續(xù))

4 培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)

放線菌的傳統(tǒng)分離常采用高氏一號合成培養(yǎng)基作為分離培養(yǎng)基。然而，大多數(shù)稀有放線菌生長較慢，對培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求比較苛刻，使用目前常見的培養(yǎng)方法與分離手段，難以獲得大量的稀有放線菌。合適培養(yǎng)基的選擇對稀有放線菌的分離及培養(yǎng)至關(guān)重要。不同類型的稀有放線菌對碳源、氮源的利用情況也不盡相同，幾丁質(zhì)、甘油、淀粉、葡萄糖、腐殖酸、MOPS、丙烯酰胺、海藻糖和EDTA等已廣泛用作稀有放線菌分離培養(yǎng)基的碳源。精氨酸、天冬氨酸、酪氨酸或硝酸鹽可作為分離培養(yǎng)基的氮源，腐殖酸也可作為培養(yǎng)基的唯一碳氮源[50]。

腐殖酸-維生素瓊脂培養(yǎng)基(HVA)最早由日本學(xué)者Hayakawa設(shè)計(jì)，用于土壤樣品中放線菌的分離，黑色的腐殖酸培養(yǎng)基背景尤其適合辨認(rèn)和分離白色放線菌菌落，但是，沒有氣生菌絲或者產(chǎn)孢不好的小菌落在HVA培養(yǎng)基上不好觀察[51-52]。目前，該培養(yǎng)基仍被眾多研究者改良后用于分離多種稀有放線菌[53-55]。HVG培養(yǎng)基(HVA培養(yǎng)基中添加吉蘭糖膠和2 mmol·L-1CaCl2)有助于魚孢菌屬的生長，結(jié)合離心法最早用于魚孢菌屬的分離[41]。S.L.Suzuki[56]采用HSG(腐殖酸微量鹽吉蘭糖膠)培養(yǎng)基對游動雙孢菌屬進(jìn)行分離，微量鹽和堿性培養(yǎng)基(pH=9.0)可刺激游動雙孢菌屬孢子囊的形成，且堿性環(huán)境可抑制鏈霉菌的生長，從而有助于游動雙孢菌屬的選擇性分離。HMG選擇性分離培養(yǎng)基，即HVG培養(yǎng)基中加入1 g·L-1嗎啉丙磺酸(MOPS)。HMG分離培養(yǎng)基中添加100μg·mL-1硫酸慶大霉素、20μg·mL-1氨芐青霉素鈉鹽、50μg·mL-1三甲氧芐啶、10μg·mL-1萘啶酮酸，結(jié)合干熱法預(yù)處理土樣(120°C，60 min)，用于分離A.rugatobispora菌[57]。劉最等[58]利用聚乳酸(PLA)和絲蛋白粉分別作為選擇性碳源、氮源，可以有效提高稀有放線菌的分離效率。王霏[59]以聚乳酸培養(yǎng)基(PLA)、甘油-天門冬酰胺培養(yǎng)基(ISP 5)、脯氨酸-MOPS培養(yǎng)基、淀粉酪蛋白培養(yǎng)基(SC)、R2A培養(yǎng)基和2216E培養(yǎng)基6種培養(yǎng)基進(jìn)行稀有放線菌的選擇性分離，總共分離到106株稀有放線菌，占所分離到的放線菌總數(shù)比例為51.5%，有極高的稀有放線菌出菌率。

稀有放線菌種類繁多，不同種的放線菌所需的營養(yǎng)物質(zhì)和培養(yǎng)條件各不相同，在設(shè)計(jì)選擇性分離培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)采取菌株分離時(shí)“投其所好，取其所抗”的基本原則，根據(jù)稀有放線菌自身的生理生化特性，在培養(yǎng)基中加入適合其生長的物質(zhì)，不斷對培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行改進(jìn)，以便于發(fā)現(xiàn)更多稀有放線菌新種，從而獲得更多的新型次生代謝產(chǎn)物。在分離土壤中稀有放線菌時(shí)，必須考慮采用更多的培養(yǎng)基，才可能更大限度地獲得土壤中的微生物資源。研究者常采用多種選擇性分離培養(yǎng)基從土壤樣品中分離稀有放線菌，還可在培養(yǎng)基中加入微量元素，有利于稀有放線菌的生長。

5 結(jié) 論

近年來，國內(nèi)外學(xué)者綜合運(yùn)用不同的選擇性分離方法及多種分離培養(yǎng)基對稀有放線菌進(jìn)行選擇性分離，顯著提高了稀有放線菌的分離效果。但受分離條件和技術(shù)的限制，自然界中至少還有80%的放線菌沒有被分離出來。因此，新型高效選擇性分離方法的開發(fā)及合適培養(yǎng)基的選擇仍然是藥用微生物篩選人員重點(diǎn)研究的課題。

研究者們還從極特殊生態(tài)環(huán)境(如高溫、高鹽堿、極地、洞穴、海洋、沙漠、高海拔山脈、火山口等地)中分離得到多種新的稀有放線菌資源，從中獲得了豐富的天然活性物質(zhì)。一般認(rèn)為極端環(huán)境中的放線菌具有較為特殊的生理代謝機(jī)制和生物學(xué)特性，可產(chǎn)生獨(dú)特的生物活性物質(zhì)。

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，多種新型放線菌篩選策略也被用于稀有放線菌的分離，且更有針對性和目的性，菌株和其產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物被重復(fù)發(fā)現(xiàn)的幾率變低。通過設(shè)計(jì)引物或探針可利用PCR技術(shù)快速篩選土壤稀有放線菌的某種基因，還可以發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生特定化合物的放線菌新種[60]。熱解質(zhì)譜法(PyMS)可以對放線菌進(jìn)行快速、可回收分離，是一種新型全細(xì)胞指紋技術(shù)[61]。原位培養(yǎng)技術(shù)可最大程度還原微生物的自然生長環(huán)境，使用特殊的原位培養(yǎng)裝置從土壤中俘獲稀有放線菌，較傳統(tǒng)分離篩選技術(shù)分離效果更好，提高了微生物的可培養(yǎng)性[62]。

總之，從土壤中分離出新的稀有放線菌，還需結(jié)合現(xiàn)代生物化學(xué)與分子生物學(xué)方法，采用多種行之有效的分離方法與手段，提高分離效果。我們期望更多新型簡便、有效的分離方法的開發(fā)，用以挖掘土壤中的未知稀有放線菌，從而為放線菌資源開發(fā)及天然產(chǎn)物篩選奠定基礎(chǔ)。