三氯甲烷-水振蕩萃取法建立藥用輔料氫化大豆卵磷脂細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法

劉雪莉 袁坤 趙冬 王鐵戰(zhàn) 崔曉燕 甄曉蘭 施麟 李揮

磷脂是生命的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是制備脂質(zhì)體的主要膜材，在生物體內(nèi)可降解，且無毒性、無免疫原性[1]。磷脂氫化后的氫化大豆卵磷脂(HSPC)增強(qiáng)了其親水性和穩(wěn)定性[2]，從而可增強(qiáng)脂質(zhì)體制劑的穩(wěn)定性，因此在長效靶向制劑鹽酸多柔比星脂質(zhì)體注射液[3,4]、兩性霉素B脂質(zhì)體注射液[5,6]等藥物制劑[7,8]中更多應(yīng)用。作為裝載藥物的輔料，其使用量較大，故控制藥用輔料氫化大豆卵磷脂中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量，對于藥物制劑安全性具有重要作用。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查所用鱟試劑，與內(nèi)毒素的反應(yīng)一般在水溶液中進(jìn)行，但HSPC不溶于水，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無法正常進(jìn)行。查閱用有機(jī)溶劑溶解樣品，再進(jìn)行內(nèi)毒素檢查的相關(guān)研究報道[9-14]后，我們采用三氯甲烷溶解HSPC，再加入BET水振蕩萃取，進(jìn)行HSPC細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的研究。經(jīng)過探索與驗證，通過干擾擴(kuò)大及內(nèi)毒素回收等實驗，證明該法符合《中國藥典》2020年版通則1143[15]與現(xiàn)行美國藥典USP42-<85> 的要求，可用于控制藥用輔料氫化大豆卵磷脂中細(xì)菌內(nèi)毒素含量，其檢查限值可定為：每1毫克氫化大豆卵磷脂中含內(nèi)毒素的量應(yīng)<0.006 EU。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 氫化大豆卵磷脂(批號525600-2160616-01、525600-2160654-01、525600-2160658-01)。鱟試劑1(TAL1，批號1805163，規(guī)格為每支0.1 ml，λ=0.06 EU/ml，湛江安度斯生物有限公司)；鱟試劑2(TAL2，批號1904100，規(guī)格為每支0.1 ml，λ=0.06 EU/ml，湛江博康海洋生物有限公司)。細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(CSE，批號150601-201784，規(guī)格為每支80 EU，中國食品藥品檢定研究院)。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(BET水，批號1706070，規(guī)格50 ml，湛江安度斯生物有限公司)。三氯甲烷(分析純，批號20190103，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 TAL靈敏度復(fù)核試驗：按2020年版《中國藥典》通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[15]進(jìn)行試驗，其靈敏度在0.5～2.0 λ范圍內(nèi)，方可用于后續(xù)實驗。

1.2.2 供試品有效稀釋濃度計算：HSPC在脂質(zhì)體中作為裝載藥物輔料使用，根據(jù)臨床脂質(zhì)體最大使用量以及HSPC在處方中的含量，計算得到HSPC細(xì)菌內(nèi)毒素檢查限值L=0.006 EU/mg，則最低有效濃度為MVC=λ/L=0.06EU/ml/0.006 EU/mg=10 mg/ml。

1.2.3 供試品干擾預(yù)試驗：分別量取5 ml三氯甲烷和5 ml BET水，混合均勻，渦旋振蕩2 min，靜置30 s以上使之分層，獲得三氯甲烷飽和水溶液(上層溶液)和水飽和三氯甲烷溶液(下層溶液)備用。見圖1。

圖1 三氯甲烷-水振蕩萃取法對氫化大豆卵磷脂的處理過程

精密稱取3批HSPC(編號①、②、③)200.0 mg，分別加入1 ml水飽和三氯甲烷溶液，渦旋振蕩使之充分溶解，然后再加入三氯甲烷飽和水溶液4ml，充分渦旋振蕩，靜置分層，使上層成為澄清均一的溶液(相當(dāng)于50 mg/ml的供試品溶液)，取上層溶液1.0 ml加BET水1.0 ml制備成25 mg/ml的溶液(如圖1所示)，將此濃度溶液同時分兩種方式進(jìn)行稀釋：(1)取此溶液1.0 ml加BET水1.0 ml，稀釋后的溶液(12.5 mg/ml)記為供試品溶液(NPC:即為最小有效稀釋濃度的1.25倍)；(2)取溶液1.0 ml加入4 λ濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 ml，使?jié)舛葹?2.5 mg/ml的供試品中均有2λ濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素，此溶液為供試品陽性對照溶液(PPC)。分別取鱟試劑TAL A、TAL B(靈敏度均為0.06 EU/ml)，與上述NPC和PPC進(jìn)行反應(yīng)，陰性(NC：只加入BET水)、陽性(PC：加入2 λ濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素工作品)對照各兩管，于(37±1)℃保溫(60±2)min。

1.2.4 細(xì)菌內(nèi)毒素回收率驗證試驗：上述三氯甲烷溶解，水振蕩萃取操作，是否會造成樣品本身所含細(xì)菌內(nèi)毒素的流失，造成假陰性現(xiàn)象導(dǎo)致誤判?；诖藛栴}，我們建立細(xì)菌內(nèi)毒素回收實驗。見圖2。

圖2 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品回收驗證試驗處理方法

將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(CSE)，用BET水溶解成100 EU/ml的母液備用。取母液20 μl加至1.04 ml的水飽和三氯甲烷液中混勻，再加入三氯甲烷飽和BET水溶液4.16 ml，振蕩萃取，水溶液中內(nèi)毒素含量相當(dāng)于0.48 EU/ml(以上操作與萃取時水與三氯甲烷的比例，與預(yù)實驗中對HSPC的處理完全一致)。再用BET水稀釋，配制2.0 λ、1.0 λ、0.5 λ、0.25 λ濃度(0.12 EU/ml、0.06 EU/ml、0.03 EU/ml、0.015 EU/ml)的CSE溶液，進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素回收驗證。

1.2.5 供試品干擾確證試驗：干擾確證試驗根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果而設(shè)定，操作方法嚴(yán)格執(zhí)行2020年版《中國藥典》通則1143及 USP42-<85>細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。

2 結(jié)果

2.1 TAL靈敏度復(fù)核 按2020年版《中國藥典》通則1143[15]進(jìn)行TAL靈敏度復(fù)核試驗，結(jié)果其靈敏度均在0.5～2.0 λ范圍內(nèi)，符合規(guī)定，可用于細(xì)菌內(nèi)毒素干擾試驗及樣品檢測實驗(“+”表示鱟試劑安瓿從恒溫箱中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°，所形成凝膠不變形，不滑脫?！?” 表示未形成凝膠或凝膠不堅實，變形并滑脫)。見表1。

表1 TAL靈敏度復(fù)核試驗結(jié)果

2.2 供試品干擾預(yù)試驗 按圖1所示進(jìn)行供試品干擾預(yù)試驗操作，實驗結(jié)果：當(dāng)濃度為最小有效稀釋濃度(MVC=10 mg/ml)的1.25倍，即12.5 mg/ml時對TAL A、TAL B均無干擾作用，故可將HSPC 12.5 mg/ml濃度進(jìn)行正式干擾試驗。見表2。

表2 氫化大豆卵磷脂干擾預(yù)試驗結(jié)果

2.3 細(xì)菌內(nèi)毒素回收率驗證試驗 細(xì)菌內(nèi)毒素回收率驗證試驗結(jié)果表明：TAL A、TAL B的Et在0.5～2 λ范圍內(nèi)，即0.03～0.12 EU/ml范圍內(nèi)，說明三氯甲烷溶解以及水振蕩萃取的操作方法對內(nèi)毒素含量無影響。見表3。

表3 細(xì)菌內(nèi)毒素回收驗證結(jié)果

2.4 供試品干擾確證試驗 根據(jù)干擾預(yù)試驗結(jié)果，將3批供試品，采用1.25倍MVC濃度(12.5 mg/ml)進(jìn)行干擾確證試驗，結(jié)果表明：3批供試品在12.5 mg/ml濃度時，Et均在0.5～2 λ間，對鱟試劑無干擾作用。見表4。

表4 氫化大豆卵磷脂干擾確證試驗結(jié)果

2.5 三批供試品檢查 三批HSPC(供試品編號①至③)，按2020年版《中國藥典》通則1143，以及 USP42-<85>細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，以檢查限值為0.006 EU/mg進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，結(jié)果均為陰性，符合規(guī)定。見表5。

表5 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

3 討論

3.1 三氯甲烷-水振蕩萃取法可用于氫化大豆卵磷脂細(xì)菌內(nèi)毒素檢查 根據(jù)以上試驗研究，通過特定比例的三氯甲烷-水振蕩萃取法，可建立符合《中國藥典》2020年版通則1143以及 USP42-<85>的藥用輔料氫化大豆卵磷脂細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，檢查限值定為每1毫克氫化大豆卵磷脂中含內(nèi)毒素的量應(yīng)<0.006 EU，此方法可控制藥用輔料氫化大豆卵磷脂中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量。

3.2 三氯甲烷和水互飽和溶液的制備與使用關(guān)鍵 氫化大豆卵磷脂在第一步溶解與萃取時需要采用水飽和三氯甲烷溶液，及三氯甲烷飽和水溶液，其余步驟均用BET水稀釋。飽和溶液制備時，BET水和三氯甲烷需充分混合，確保形成各自的飽和溶液，使萃取過程不會發(fā)生氫化大豆卵磷脂的析出而致溶液渾濁，從而保證研究方法的可行性。

用水飽和三氯甲烷溶液溶解HSPC時，先溶解為200 mg/ml的溶液，然后用三氯甲烷飽和水溶液萃取其中含有的細(xì)菌內(nèi)內(nèi)毒素，三氯甲烷水溶液和水飽和三氯甲烷溶液的體積比≥4∶1，方可使內(nèi)毒素萃取完全；小于此體積比，無法通過細(xì)菌內(nèi)毒素回收率驗證試驗，易導(dǎo)致實驗結(jié)果假陰性，從而造成誤判，無法控制藥用輔料氫化大豆卵磷脂的質(zhì)量安全。

3.3 藥用輔料氫化大豆卵磷脂細(xì)菌內(nèi)毒素檢查標(biāo)準(zhǔn)制定 沿用中國藥典的表述習(xí)慣，藥用輔料氫化大豆卵磷脂細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法可定為：取本品，可用0.06 EU/ml及以上靈敏度鱟試劑，依法檢查(《中國藥典》2020年版通則1143)，每1毫克氫化大豆卵磷脂中含內(nèi)毒素的量應(yīng)<0.006 EU。此方法同樣符合美國藥典USP42-<85>細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的要求。

三氯甲烷-水振蕩萃取法建立的藥用輔料氫化大豆卵磷脂細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法，為其安全性檢查標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了有力的研究資料；為其他常規(guī)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法不能滿足的藥品原料及藥用輔料方法學(xué)[16]，擴(kuò)展了思路。

3.4 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法為檢測化學(xué)藥品及輔料中熱原物質(zhì)的主要技術(shù) 熱原物質(zhì)檢測技術(shù)是保證藥品安全性的關(guān)鍵技術(shù)，目前中國藥典收錄的主要檢測方法為家兔熱原檢查法及細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，并規(guī)定：對于化學(xué)藥品注射液，首選細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項[17]。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法包括凝膠法和光度法共6種檢查方法[18]，當(dāng)結(jié)果有爭議時，以凝膠限度試驗結(jié)果為準(zhǔn)[15]。故在此研究中，我們采用具有仲裁意義的凝膠限度試驗建立藥用輔料氫化大豆卵磷脂細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法，以更好地控制輔料質(zhì)量，為確保藥物制劑質(zhì)量安全做好充分的技術(shù)支持。

3.5 重組C因子法的后續(xù)研究 C因子是鱟試劑中對細(xì)菌內(nèi)毒素敏感的蛋白，能夠選擇性識別內(nèi)毒素并激活蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)[19]。重組C因子法作為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的補(bǔ)充方法，已首次被2020年版中國藥典收錄[18]，近年來受到廣泛關(guān)注與研究[20-22]。通過生物技術(shù)重組獲得的鱟試劑中的C因子，可代替海洋生物鱟作為鱟試劑原料唯一來源，具有很好的發(fā)展前景。本科研團(tuán)隊將繼續(xù)進(jìn)行重組C因子法對藥用輔料氫化大豆卵磷脂中細(xì)菌內(nèi)毒素的探索研究，以期采用新技術(shù)、多手段、高質(zhì)量控制藥品安全。