MAP3K14下調(diào)miR-17-5p對胰腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

曹洪慶 劉廣民

胰腺癌是一種高度惡性的消化道腫瘤，胰腺癌的5年生存率為7%～8%，近年來胰腺癌發(fā)病率和死亡率逐年上升[1]。因此，對于胰腺癌進(jìn)行早期診斷，采取積極有效的干預(yù)措施阻止胰腺癌的進(jìn)展是提高患者生存率的關(guān)鍵所在。長鏈非編碼RNA(longnon-codingRNA,lncRNA)是長度>200個核苷酸的非編碼RNA，沒有編碼蛋白的功能。研究發(fā)現(xiàn),lncRNA在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及血管生成中發(fā)揮著重要功能[1]。越來越多的研究表明,lncRNA參與腫瘤細(xì)胞的形成和發(fā)展。例如,在肺腺癌、前列腺癌、白血病、結(jié)腸癌和肝癌組織中均發(fā)現(xiàn)lncRNA差異表達(dá)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA MALAT1通過靶向調(diào)控miR-204表達(dá)誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞G2/M細(xì)胞周期停滯、促進(jìn)細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力[3]。LncRNA-PVT1通過調(diào)節(jié)miR-448促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖和遷移[4]。LncRNA BCAR4在胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)升高,LncRNA BCAR4的高表達(dá)可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖，抑制凋亡[5]。有研究報道lncRNA MAP3K14在胰腺癌組織中下調(diào)表達(dá)，其可能與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[6]，另外MAP3K14對胰腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響及具體機(jī)制尚不清楚。目前研究已證實絲裂原活化蛋白激酶家族MAPK參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其中已證明MAP3K10可通過上調(diào)gli-1和gli-2的表達(dá)促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖[7]，MAP3K14可抑制乳腺癌細(xì)胞生長和侵襲[8]。因此，本研究就MAP3K14對胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響以及是否通過調(diào)節(jié)miR-17-5p來影響胰腺癌細(xì)胞的增殖凋亡進(jìn)行研究,以期為今后胰腺癌的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國 Gibco，胎牛血清購于Gibco，Trizol試劑盒購于TakaRA,lncRNA 提取試劑、熒光定量RT-PCR 試劑盒購于Qiagen,試劑 LipofectamineTM 2000、OTI-MEM均購自Invitrogen。miR-MAP3K14引物合成自上海生工生物公司，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于美國Promega，pcDNA3.1、pcDNA3.1-MAP3K14、pcDNA3.1-MAP3K14+miR-NC、pcDNA3.1-MAP3K14+miR-17-5p購自武漢淼靈生物科技有限公司，CCK-8試劑購自美國 Amresco 公司。

1.2 標(biāo)本收集 55例胰腺癌組織及25例癌旁組織標(biāo)本，來源于醫(yī)院手術(shù)治療的患者，在手術(shù)前均未采用放療和化療，術(shù)后病理診斷是胰腺癌的腫瘤組織和癌旁正常組織的液氮凍存標(biāo)本。標(biāo)本的采集均經(jīng)過患者同意，簽屬知情同意書，并經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng):采用含有胎牛血清為10%的RPMI1640培養(yǎng)液對Panc-1細(xì)胞和MIApaca-2細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。使其在溫度為37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。定期觀察，根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)更換培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底80%左右時，加入胰蛋白酶消化傳代。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及實驗分組:收集對數(shù)生長期的人胰腺癌Panc-1、MIApaca-2細(xì)胞，并以適當(dāng)密度接種到6孔板上。于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合度約為70%，根據(jù)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑使用說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，實驗分組：Con組(未進(jìn)行任何處理的細(xì)胞)、pcDNA3.1組(空載體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞)、pcDNA3.1-MAP3K14組(MAP3K14過表達(dá)載體pcDNA3.1-MAP3K14轉(zhuǎn)染至細(xì)胞)、pcDNA3.1-MAP3K14+miR-NC組(pcDNA3.1-MAP3K14與miR-NC共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞)、pcDNA3.1-MAP3K14+miR-17-5p組(pcDNA3.1-MAP3K14與miR-17-5p mimics共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞)，轉(zhuǎn)染6 h 更換為含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。為驗證 MAP3K14對miR-17-5p的靶向調(diào)控作用，實驗分組：pcDNA3.1組、pcDNA3.1-MAP3K14組、si-NC組(si-NC轉(zhuǎn)染至細(xì)胞)、si-MAP3K14組(MAP3K14小干擾RNA轉(zhuǎn)染至細(xì)胞)。嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作。

1.3.3 Real-time PCR 法檢測RNA的表達(dá):根據(jù)Trizol試劑(Invitrogen)盒說明書方法抽提各試驗組總RNA，并測定其濃度。取2 ng 總RNA加入逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen)轉(zhuǎn)錄成cDNA，加80 μl DEPC稀釋后，放-20℃保存。用SYBR Green I PCR 檢測試劑盒對5 μl cDNA 溶液進(jìn)行熒光定量PCR，MAP3K14引物序列：上游為5’-ATTTGCTCCTGCTCCTCCAGA-3’，下游為5’-CCAGCCTCCTCCCAGTCTTTC-3’；內(nèi)參GAPDH引物序列：上游為5’-GTGCTGAGTATGTCGTGGAG-3’，下游為5’-GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3’；PCR反應(yīng)條件：95℃ 2 min；95℃ 10 s,60℃ 30 s，70℃ 30 s，共40個循環(huán)；解鏈曲線分析：95℃ 1 min，55℃ 30 s；然后緩慢升溫至 95℃，升溫速率為0.2℃/s。采用2-ΔΔCt法分析目的lncRNA的相對表達(dá)水平，上述具體操作依試劑盒說明書進(jìn)行。后續(xù)實驗中，miR-17-5p的表達(dá)亦采用RT-PCR檢測，其中引物分別為miR-17-5p-F：5′-TGTCAAAGTGCTTACAGTG-3′; miR-17-5p-R：5′-CCATAATGCTACAAGTGCC-3′;U6作為內(nèi)參,U6-F:5’-GCTTCG GCAGCACATATACTAAAAT-3′; U6-R：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.3.4 CCK-8檢測細(xì)胞增殖:取上述對數(shù)生長期的各組Panc-1、MIApaca-2細(xì)胞，以每孔 2×105個密度種植于96孔細(xì)胞板上。培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，在培養(yǎng)時間截止前2 h加入10 μl CKK-8溶液，放在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，采用酶標(biāo)儀檢測各孔在490 nm波長處的吸光度值。

1.3.5 平板克隆實驗檢測細(xì)胞克隆數(shù):各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后用胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2周，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定15 min，然后去固定液，加適量Giemsa染色10～30 min，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。顯微鏡下計數(shù)。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡:轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞用于實驗，消化收集1×104個細(xì)胞，加入100 μl PBS和100 μl DNA Prep LPR，孵育10 min后再加1 ml DNA Prep Stain，孵育10 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期:收集1×105個細(xì)胞，PBS 洗滌后加入5 μl Annexin緩沖液、5 μl 7AAD、5 μl AnnexinV-PE，避光孵育10 min 后上流式細(xì)胞儀分析。

1.3.7 雙熒光素酶報告基因檢測實驗:采用starBase(http://starbase.sysu.edu.cn/)靶基因預(yù)測庫檢測到MAP3K14與miR-17-5p存在結(jié)合位點。猜測miR-17-5p可能是MAP3K14的一個靶基因。為驗證這一猜想，我們構(gòu)建了野生型WT-MAP3K14和突變型MUT-MAP3K14的熒光素酶報告載體。參照1.3.3中的方法以LipofectamineTM2000將miR-NC、miR-17-5p分別與WT-MAP3K14和MUT-MAP3K14共轉(zhuǎn)染，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48 h。收集各組細(xì)胞，參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒操作步驟進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 MAP3K14在胰腺癌組織中相對低表達(dá) 與人正常胰腺組織比較，胰腺癌組織中MAP3K14的表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 MAP3K14在胰腺癌組織和正常胰腺組織中的表達(dá)

2.2 MAP3K14抑制Panc-1、MIAPaCa-2細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡 pcDNA3.1-MAP3K14組Panc-1、MIApaca-2細(xì)胞中MAP3K14的表達(dá)水平明顯高于pcDNA3.1組(P<0.05)，成功構(gòu)建了MAP3K14過表達(dá)的panc-1、MIApaca-2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，2組細(xì)胞的吸光度值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而轉(zhuǎn)染48 h和72 h后，pcDNA3.1-MAP3K14組的吸光度值較pcDNA3.1組明顯下降(P<0.05)；與pcDNA3.1組比較，MAP3K14過表達(dá)后Panc-1、MIAPaCa-2細(xì)胞的凋亡數(shù)明顯增加(P<0.05)，與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-MAP3K14組Panc-1、MIApaca-2細(xì)胞平板克隆數(shù)顯著降低(P<0.05)。MAP3K14過表達(dá)可抑制Panc-1、MIAPaCa-2細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。見圖1，表2～4。

圖1 過表達(dá)MAP3K14對細(xì)胞Panc-1、MIAPaCa-2凋亡的影響

表2 過表達(dá)MAP3K14對細(xì)胞Panc-1增殖、凋亡的影響

表3 過表達(dá)MAP3K14對細(xì)胞MIAPaCa-2增殖、凋亡的影響

表4 過表達(dá)MAP3K14對細(xì)胞Panc-1、MIAPaCa-2平板克隆數(shù)的影響

2.3 MAP4K14吸附miR-17-5p，并負(fù)向調(diào)控其表達(dá) starBase軟件檢測結(jié)果，MAP4K14與miR-17-5p之間存在互補(bǔ)結(jié)合位點。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測結(jié)果，同miR-NC與WT-MAP3K14共轉(zhuǎn)染比較，miR-17-5P與WT-MAP3K14共轉(zhuǎn)染后，Panc-1細(xì)胞的熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)；而miR-NC、miR-17-5p分別與MUT-MAP3K14共轉(zhuǎn)染后，Panc-1細(xì)胞的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),可見MAP3K14對miR-17-5p具有靶向作用。與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-MAP3K14組中miR-17-5p表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；相反，si-MAP3K14組中miR-17-5p表達(dá)水平明顯高于si-NC組(P<0.05)。MAP3K14可負(fù)向調(diào)控miR-17-5p表達(dá)。見圖2，表5、6。

表5 雙熒光素酶報告實驗

圖2 MAP3K14的3’UTR中含有miR-17-5p的互補(bǔ)核苷酸序列

2.4 過表達(dá)miR-17-5p能逆轉(zhuǎn)MAP3K14對胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響 24 h作用時間下，pcDNA3.1組、pcDNA3.1-MAP3K14組、pcDNA3.1-MAP3K14+miR-NC組和pcDNA3.1-MAP3K14+miR-17-5p組細(xì)胞的增殖能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；48 h和72 h作用時間下，pcDNA3.1-MAP3K14組細(xì)胞的增殖能力較pcDNA3.1組明顯減弱(P<0.05)，pcDNA3.1-MAP3K14組與pcDNA3.1-MAP3K14+miR-NC組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但pcDNA3.1-MAP3K14+miR-17-5p組較pcDNA3.1-MAP3K14+miR-NC組明顯升高(P<0.05)。同時，pcDNA3.1-MAP3K14組細(xì)胞的凋亡率能力明顯高于pcDNA3.1組(P<0.05)，pcDNA3.1-MAP3K14+miR-17-5p組明顯低于pcDNA3.1-MAP3K14+miR-NC組(P<0.05)，而pcDNA3.1-MAP3K14組與pcDNA3.1-MAP3K14+miR-NC組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。miR-17-5p過表達(dá)可顯著逆轉(zhuǎn)MAP3K14對胰腺癌panc-1細(xì)胞增殖的抑制作用、逆轉(zhuǎn)對細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。見表7。

表6 MAP3K14對miR-17-5p表達(dá)的影響

表7 過表達(dá)miR-17-5p能逆轉(zhuǎn)MAP3K14對胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響

3 討論

胰腺癌的惡性程度非常高，它具有起病隱匿、手術(shù)切除率小、預(yù)后不良、病死率高、生存率低等特點。目前根本的治療原則依然是以外科治療為主，放化療為輔。手術(shù)是唯一可能根治的方法，但因胰腺癌的早期診斷困難，易早期發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，故手術(shù)切除率低、預(yù)后不良、術(shù)后生存率低。放化療是腫瘤綜合治療中的重要環(huán)節(jié)，但胰腺癌對化療藥的反應(yīng)程度不明顯，對放療不敏感，故對于延長晚期胰腺癌患者的生存時間作用有限。

長鏈非編碼RNA(longnon-codingRNA,lncRNA)其本身不編碼蛋白，但研究發(fā)現(xiàn)它們在多種層面實現(xiàn)對基因的調(diào)控，將類似功能歸納為轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和表觀遺傳學(xué)調(diào)控3個主要層面[9]。LncRNA的表達(dá)或功能異常與人類眾多疾病的發(fā)生密切相關(guān),如癌癥、阿爾茲海默癥、糖尿病等，具體表現(xiàn)為LncRNA在序列、空間結(jié)構(gòu)、表達(dá)水平及與結(jié)合蛋白相互作用上的異常等。研究發(fā)現(xiàn)LncRNA與人類多個腫瘤的發(fā)病聯(lián)系密切，可以在多個水平參與基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)成，調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后聯(lián)系密切[10]，其有望成為潛在的診斷標(biāo)志物和治療的靶點。有研究證明，長鏈非編碼RNA MAP3K14在胰腺癌組織中下調(diào)表達(dá),MAP3K14屬于絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)超級家族，能介導(dǎo)刺激信號從細(xì)胞膜傳遞到細(xì)胞核或其他胞內(nèi)靶點，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、細(xì)胞周期和凋亡等[11]；本研究通過RT-PCR法檢測到胰腺癌組織中MAP3K14的表達(dá)較正常胰腺組織顯著下調(diào)，通過過表達(dá)胰腺癌細(xì)胞中MAP3K14，發(fā)現(xiàn)MAP3K14能抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，證實MAP3K14是抑癌基因，但MAP3K14對胰腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的具體機(jī)制尚不清楚。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),lncRNA可以通過穩(wěn)定某些抑癌基因的mRNA以及蛋白來促進(jìn)癌細(xì)胞的生長發(fā)育及轉(zhuǎn)移[12]，且在生物中,lncRNA 和miRNA往往是共同作用的,它們之間可以協(xié)同調(diào)節(jié),也存在相互調(diào)節(jié)[13]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-17-5p為癌基因在胰腺癌細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移[14]。miRNA是內(nèi)源性非編碼短鏈 RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)血管生成及細(xì)胞周期、凋亡、侵襲和遷移等腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)一步影響腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲[15]，所以我們猜測MAP3K14可能是通過調(diào)控miR-17-5p的表達(dá)來影響胰腺細(xì)胞的增殖、凋亡。我們采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C發(fā)現(xiàn)miR-17-5p的3’UTR上存在MAP3K14的互補(bǔ)結(jié)合序列。通過過表達(dá)胰腺癌Panc-1細(xì)胞中的MAP3K14，發(fā)現(xiàn) miR-17-5p的表達(dá)量相對下降，沉默MAP3K14的表達(dá)，miR-17-5p的表達(dá)量相對上升，證實MAP3K14可負(fù)向調(diào)控miR-17-5p的表達(dá)，再進(jìn)一步研究，通過過表達(dá)胰腺癌Panc-1細(xì)胞中miR-17-5p，發(fā)現(xiàn)miR-17-5p可以逆轉(zhuǎn)MAP3K14對胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響。表明MAP3K14通過下調(diào)miR-17-5p的表達(dá)來抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

胰腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個很復(fù)雜的過程，是多因素共同參與、多基因協(xié)同作用、綜合發(fā)展的結(jié)果[16]，因此找到有效的診斷新方法是提高胰腺癌治療效果的關(guān)鍵所在。通過深入研究MAP3K14在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，有可能從另一方面揭示胰腺癌的發(fā)病機(jī)制，為胰腺癌診斷提供新的生物標(biāo)志物，為胰腺癌的治療提供新靶點，以期抑制癌癥的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，提高臨床療效。