補(bǔ)腎益精方對(duì)外周血BMSCs在干性ARMD小鼠中視網(wǎng)膜分化及CNTF表達(dá)的影響

許 凱，唐由之，梁麗娜，張 晶，侯 樂(lè)，梁 潔，陳 強(qiáng)，馬群英

0引言

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)是發(fā)達(dá)國(guó)家50歲以上人群不可逆性盲的首位病因，在我國(guó)的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢(shì)。根據(jù)有無(wú)視網(wǎng)膜下脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)分為干性ARMD和濕性ARMD。隨著對(duì)CNV研究的深入，通過(guò)藥物治療、激光光凝、光動(dòng)力療法(photodynamic therapy,PDT)及手術(shù)等方法，濕性ARMD的治療已取得較好的臨床效果。干性 ARMD由于脂質(zhì)過(guò)氧化物和氧自由基等在視網(wǎng)膜內(nèi)蓄積，導(dǎo)致視網(wǎng)膜色素上皮 (retinal pigment epithelium，RPE) 細(xì)胞凋亡及感光細(xì)胞損傷，目前尚無(wú)確切的藥物療法[1]。近年來(lái)，干細(xì)胞研究的快速發(fā)展為干性ARMD的治療帶來(lái)了潛在的希望。補(bǔ)腎益精方是唐由之研究員治療干性ARMD的經(jīng)驗(yàn)方，前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示該方對(duì)干性ARMD小鼠視網(wǎng)膜有一定的保護(hù)作用，并可以動(dòng)員自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)向外周血遷移及向視網(wǎng)膜組織歸巢[2-3]?；谇捌谘芯拷Y(jié)果，本實(shí)驗(yàn)觀察補(bǔ)腎益精方是否可以促進(jìn)外周血干細(xì)胞向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化以及視網(wǎng)膜組織中睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)的表達(dá)，以進(jìn)一步明確其作用機(jī)制。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組動(dòng)物選用SPF級(jí)健康無(wú)眼疾C57BL/6小鼠36只，約6～8周齡，雄性[北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK(京)2016-0006]。適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后，按隨機(jī)數(shù)字表法選擇其中的24只予40mg/kg碘酸鈉(NaIO3)尾靜脈注射造模，并評(píng)定造模情況[3-4]，本研究納入動(dòng)物均造模成功。

造模后第1d，尾靜脈注射3×106個(gè)綠色熒光蛋白標(biāo)記的C57BL/6小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(green fluorescent protein labeled bone marrow-derived mesenchymal stem cells，GFP-BMSCs)，然后隨機(jī)分為蒸餾水組及補(bǔ)腎益精方組，每組12只。干細(xì)胞注射后第1d，補(bǔ)腎益精方組予補(bǔ)腎益精方藥液灌胃(8.8g/kg)，每天1次。蒸餾水組每天予等量的蒸餾水灌胃。另選12只健康C57BL/6小鼠常規(guī)飼養(yǎng)作為正常組。治療14d時(shí)進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)評(píng)價(jià)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序與福利均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑及儀器補(bǔ)腎益精方由何首烏、枸杞、黃芪、黃精等組成，煎劑由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院藥學(xué)部制備而成，濃度為880g/L。綠色熒光蛋白標(biāo)記的C57BL/6小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(GFP-BMSCs)購(gòu)自Cyagen公司，NaIO3(SIGMA-ALDRICH公司)，Triton-100(北京優(yōu)尼康生物科技有限公司)，牛血清白蛋白(BSA)(北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所)，Anti-RPE65(ab78036)、Anti-Rhodopsin(ab5417)、Anti-GFAP(ab7260)、Anti-CNTF(ab46172)、Alexa Fluor? 647標(biāo)記的驢抗小鼠 IgG H&L (ab150107)購(gòu)自Abcam公司，羅丹明標(biāo)記山羊抗兔IgG H&L(ZF-0316)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，TaqDNA聚合酶(Amplied Biosystems公司)，Trizol Reagent RNA提取試劑盒(Ambion公司)，M-MLV Reverse Transcriptase cDNA第一鏈合成試劑盒(Invitrogen公司)，氯仿、異丙醇(北京化工廠)，loading buffer、DNA marker(北京優(yōu)尼康生物科技有限公司)，CM1850冰凍切片機(jī)、DM2500顯微鏡(德國(guó)Leica公司)，激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)，熒光定量PCR儀(Amplied Biosystem公司)。

1.2方法

1.2.1免疫熒光染色頸椎脫臼法處死小鼠，立即摘除右眼眼球，制作冰凍切片。一抗孵育(Anti-RPE65，1∶500；Anti-Rhodopsin，1∶50；Anti-GFAP，1∶500；Anti-CNTF，1∶500), 4℃過(guò)夜；PBST洗滌3次，二抗孵育(Alexa Fluor? 647標(biāo)記的驢抗小鼠 IgG H&L，1∶500；羅丹明標(biāo)記山羊抗兔IgG H&L，1∶100)，避光室溫孵育2h；PBST洗滌3次，DAPI復(fù)染；PBS洗滌，抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。計(jì)數(shù)每個(gè)視野中RPE65+、Rhodopsin+、GFAP+細(xì)胞(即紅色熒光)、GFP+細(xì)胞(即綠色熒光)以及RPE65、Rhodopsin、GFAP細(xì)胞與GFP雙染細(xì)胞(即黃色熒光)數(shù)量，計(jì)算比值[BMSCs分化率(%)=雙染陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/同視野GFP+細(xì)胞數(shù)×100%)]，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)頸椎脫臼法處死小鼠，立即摘除左眼眼球，分離出新鮮視網(wǎng)膜，按Trizol Reagent RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取視網(wǎng)膜樣本中總RNA。應(yīng)用M-MLV Reverse Transcriptase cDNA第一鏈合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度。以β-actin為內(nèi)參，引物基因序列如下：CNTF：F5’-GCTTTCGCAGAGCAATCAC-3’，R5’-AGAGGCCACCATCTCCAAT-3’；β-actin：F5’-ATATCGCTGCGCTGGTCGTC-3’，R5’-AGGATGGCGTGAGGGAGAGC-3’。擴(kuò)增條件為：95℃ 5min，(95℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 15s)×45個(gè)循環(huán)，分析溶解曲線。采用2-ΔΔct方法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析，ΔΔct=(實(shí)驗(yàn)組目的基因平均ct值-實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因平均ct值)-(對(duì)照組目的基因平均ct值-對(duì)照組內(nèi)參基因平均ct值)。統(tǒng)計(jì)各組視網(wǎng)膜組織中CNTF mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1補(bǔ)腎益精方對(duì)GFP-BMSCs在視網(wǎng)膜分化的影響RPE細(xì)胞特異性抗體RPE65免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，正常組RPE細(xì)胞排列規(guī)整，呈強(qiáng)陽(yáng)性(紅色熒光)染色；蒸餾水組和補(bǔ)腎益精方組RPE65陽(yáng)性染色減少減弱，細(xì)胞排列不規(guī)整，可見(jiàn)散在RPE65及GFP雙染陽(yáng)性細(xì)胞，兩組雙染細(xì)胞陽(yáng)性率分別為(12.63±2.69)%、(14.32±5.57)%。雖然補(bǔ)腎益精方組的雙染色陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)較蒸餾水組多，但陽(yáng)性率兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.857)，見(jiàn)圖1、2。感光細(xì)胞特異性抗體Rhodopsin免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，正常組Rhodopsin主要在感光細(xì)胞外節(jié)段表達(dá)，呈強(qiáng)陽(yáng)性(紅色熒光)染色；蒸餾水組和補(bǔ)腎益精方組外節(jié)段結(jié)構(gòu)紊亂，呈碎片化弱陽(yáng)性染色，均可見(jiàn)GFP陽(yáng)性細(xì)胞，但在外節(jié)段區(qū)未發(fā)現(xiàn)雙染細(xì)胞(圖3)。膠質(zhì)細(xì)胞特異性抗體GFAP免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，正常組GFAP在星形膠質(zhì)細(xì)胞、Müller細(xì)胞靠近視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells,RGCs)部位有少量表達(dá)(紅色熒光)；蒸餾水組和補(bǔ)腎益精方組GFAP陽(yáng)性表達(dá)均較正常組增強(qiáng)，可見(jiàn)GFAP、GFP雙染陽(yáng)性細(xì)胞。蒸餾水組在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層可見(jiàn)較強(qiáng)GFAP陽(yáng)性染色。補(bǔ)腎益精方組GFAP在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層呈垂直視網(wǎng)膜分布的線條狀陽(yáng)性染色，內(nèi)核層呈細(xì)點(diǎn)狀染色。補(bǔ)腎益精方組雙染細(xì)胞陽(yáng)性率為(30.50±8.10)%，明顯高于蒸餾水組(15.65±3.89)%，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖2、4。

圖1 免疫熒光觀察各組視網(wǎng)膜RPE65表達(dá)情況(×400)。

圖2 兩組BMSCs分化率比較 bP<0.01 vs 蒸餾水組。

2.2補(bǔ)腎益精方對(duì)視網(wǎng)膜CNTF表達(dá)的影響

2.2.1免疫熒光檢測(cè)視網(wǎng)膜中CNTF蛋白表達(dá)情況結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常組CNTF在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層表達(dá)，呈強(qiáng)陽(yáng)性(紅色熒光)染色。蒸餾水組視網(wǎng)膜中表達(dá)較弱，僅在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層有少量陽(yáng)性細(xì)胞。補(bǔ)腎益精方組CNTF陽(yáng)性表達(dá)雖然較正常組弱，但強(qiáng)于蒸餾水組，在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層均可見(jiàn)大量陽(yáng)性細(xì)胞，外核層有少量陽(yáng)性細(xì)胞(圖5)。

2.2.2實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)視網(wǎng)膜中CNTF mRNA表達(dá)情況三組CNTF mRNA表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。蒸餾水組和補(bǔ)腎益精方組視網(wǎng)膜中CNTF mRNA的表達(dá)與正常組相比均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.047、0.038)。補(bǔ)腎益精方組較蒸餾水組顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.044)，見(jiàn)表1。

圖3 免疫熒光觀察各組視網(wǎng)膜Rhodopsin表達(dá)情況(×400)。

表1 給藥14d時(shí)各組視網(wǎng)膜CNTF mRNA表達(dá)情況

3討論

本研究選擇的動(dòng)物模型是NaIO3誘導(dǎo)的干性ARMD模型，是目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)且應(yīng)用較多的造模方法。研究顯示[5]，C57BL/6小鼠在注射NaIO36h后，RPE細(xì)胞出現(xiàn)壞死；24h后，感光細(xì)胞外節(jié)斷裂，并出現(xiàn)感光細(xì)胞凋亡；3d時(shí)，感光細(xì)胞凋亡達(dá)到高峰；7d時(shí)，感光細(xì)胞完全凋亡。此模型選擇性地引起RPE層損傷，繼而導(dǎo)致感光細(xì)胞等組織發(fā)生病理改變的特性與干性ARMD的發(fā)病特點(diǎn)相似。因此，選用該模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

對(duì)于干性ARMD的治療，雖然膳食補(bǔ)充劑療法在一定程度上減緩了疾病的進(jìn)展，但還未發(fā)現(xiàn)其他療效確切的治療藥物。近年來(lái)，細(xì)胞替代治療方法的出現(xiàn)，尤其是干細(xì)胞研究的快速發(fā)展使干性ARMD的治療成為可能，并被認(rèn)為是目前最有應(yīng)用前景和臨床轉(zhuǎn)化潛能的治療策略之一[6]。盡管既往研究取得了一些成果，但仍存在不少問(wèn)題，比如移植后視網(wǎng)膜功能改善維持時(shí)間短，移植細(xì)胞不能很好地整合于宿主細(xì)胞及分化成視網(wǎng)膜細(xì)胞等，如何解決這些問(wèn)題是干細(xì)胞更好應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，精是人體生命活動(dòng)的根本物質(zhì)?！澳I者主蟄，封藏之本，精之處也”，腎精充足，則能發(fā)揮化生的作用，這與干細(xì)胞的理論有相似之處。因此，通過(guò)補(bǔ)腎益精方，有可能通過(guò)增強(qiáng)自身BMSCs的修復(fù)能力，發(fā)揮保護(hù)視網(wǎng)膜變性損傷的作用。

補(bǔ)腎益精方是唐由之研究員治療干性ARMD的經(jīng)驗(yàn)方，該方以制首烏滋補(bǔ)肝腎、填精益髓；枸杞滋養(yǎng)肝腎，益精明目；黃芪補(bǔ)氣健脾；黃精補(bǔ)氣養(yǎng)陰，健脾益腎，諸藥合用，使精血暢達(dá)，上注于目，臨床上用于治療視網(wǎng)膜變性疾病。前期我們研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎益精方可以延緩先天性視網(wǎng)膜變性模型英國(guó)皇家外科學(xué)院(Royal College of Surgeons，RCS)大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡[7]，促進(jìn)外周血干細(xì)胞在視網(wǎng)膜的聚集及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌[8]，另外，補(bǔ)腎益精方對(duì)NaIO3誘導(dǎo)的干性ARMD小鼠也有保護(hù)作用，并可以促進(jìn)外周血BMSCs在視網(wǎng)膜歸巢[2-3]。歸巢后的BMSCs是否能分化為具有功能的視網(wǎng)膜細(xì)胞需要進(jìn)一步探討。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，制首烏可保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，并促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化[9-10]；枸杞可促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)元分化，增加海馬神經(jīng)元干細(xì)胞的分化速率，促進(jìn)海馬神經(jīng)元再生，保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)[11-14]；黃芪可促使BMSCs的增殖、動(dòng)員及向神經(jīng)細(xì)胞分化[15-18]；黃精可促進(jìn)BMSCs的增殖以及動(dòng)員因子粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)的表達(dá)[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示補(bǔ)腎益精方不能促進(jìn)BMSCs分化為RPE細(xì)胞和感光細(xì)胞，但是對(duì)分化為膠質(zhì)細(xì)胞具有較為明顯的促進(jìn)作用。在生理狀態(tài)下，膠質(zhì)細(xì)胞起支持、指引神經(jīng)元遷移、參與血-腦屏障的誘導(dǎo)及形成的作用，同時(shí)在維持細(xì)胞周圍微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)方面通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子和神經(jīng)遞質(zhì)，參與激素和神經(jīng)遞質(zhì)的代謝，并在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫調(diào)節(jié)等方面具有重要作用，其功能的完整性是正常視功能所必須的[20-22]。在視網(wǎng)膜損傷早期，膠質(zhì)細(xì)胞為保護(hù)組織免受進(jìn)一步損傷，會(huì)出現(xiàn)反應(yīng)性的膠質(zhì)增多，GFAP表達(dá)增加，釋放神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(neurotrophic factors, NTFs)和抗氧化劑，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[23-24]。其他研究也發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是體內(nèi)還是體外培養(yǎng)，MSCs在一定條件下都能分化成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，表現(xiàn)出修復(fù)神經(jīng)的功能，呈現(xiàn)向損傷處遷移的特性[25-26]。

圖4 免疫熒光觀察各組視網(wǎng)膜GFAP表達(dá)情況(×400)。

目前認(rèn)為MSCs修復(fù)視網(wǎng)膜變性損傷的機(jī)制一方面在趨化因子介導(dǎo)下，遷移至損傷部位，并跨胚層分化為視網(wǎng)膜細(xì)胞，直接替代壞死或凋亡的細(xì)胞[27-31]；另一方面通過(guò)旁分泌作用產(chǎn)生CNTF、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (basic fibroblast growth factor，bFGF)等NTFs以及抗凋亡相關(guān)因子等，使其在受損視網(wǎng)膜的微環(huán)境中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)視網(wǎng)膜修復(fù)[32-35]。CNTF作為視網(wǎng)膜保護(hù)中被研究最多的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子之一，主要由膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)所支配的組織產(chǎn)生，對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)元具有明顯的保護(hù)作用[36-38]，研究表明，CNTF能增加外核層厚度，減少感光細(xì)胞凋亡，提高感光細(xì)胞的存活能力，延緩疾病發(fā)展[39-43]。并且可以顯著增強(qiáng)信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)的磷酸化，調(diào)節(jié)感光細(xì)胞對(duì)光子的傳導(dǎo)性，保護(hù)視網(wǎng)膜細(xì)胞[44]。因此，本實(shí)驗(yàn)觀察了補(bǔ)腎益精方對(duì)CNTF在視網(wǎng)膜表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎益精方組CNTF mRNA和蛋白的表達(dá)量較蒸餾水組均增加，提示補(bǔ)腎益精方可以促進(jìn)CNTF的表達(dá)。另有研究發(fā)現(xiàn)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，膠質(zhì)細(xì)胞在受損傷早期可以分泌CNTF。當(dāng)中樞神經(jīng)受損時(shí)，CNTF從膠質(zhì)細(xì)胞中釋放，并在損傷區(qū)域周圍聚集[20,45]。在本實(shí)驗(yàn)中，由于CNTF mRNA和蛋白表達(dá)量趨勢(shì)與膠質(zhì)細(xì)胞特征性標(biāo)志物GFAP相一致，因此我們認(rèn)為補(bǔ)腎益精方一方面促進(jìn)視網(wǎng)膜本身CNTF表達(dá)增加，另外也可能通過(guò)促進(jìn)分化的膠質(zhì)細(xì)胞釋放CNTF，保護(hù)受損視網(wǎng)膜。

圖5 免疫熒光觀察各組視網(wǎng)膜CNTF表達(dá)情況(×400)。

綜上所述，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎益精方能夠促進(jìn)BMSCs在干性ARMD小鼠模型視網(wǎng)膜分化為膠質(zhì)細(xì)胞，并促進(jìn)視網(wǎng)膜CNTF的表達(dá)，這可能是補(bǔ)腎益精方保護(hù)視網(wǎng)膜變性損傷的作用機(jī)制。