具核梭桿菌致病性及防治＊

胡婷婷,傅思武,金 悅，張 祎，馬桂燕

（西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

隨著人們對(duì)微生物群落在人類疾病中的認(rèn)識(shí)不斷加深，對(duì)F.nucleatum 的研究已有一個(gè)世紀(jì)之久，從先后毒力因子的研究，F(xiàn)usoPortal（http://fusoportal.org）梭桿菌屬基因組、蛋白質(zhì)分析儲(chǔ)存庫(kù)的逐漸建立[1]，人們對(duì)這類梭桿菌的研究正在形成一套系統(tǒng)的模式。F.nucleatum 作為腸道菌群，其致病性尤其在CRC 致癌方面發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用，同時(shí)消化系統(tǒng)疾病仍然是未來(lái)鉆研的方向。鑒于其具體的致病及相關(guān)化療耐藥機(jī)制還在研究中，同時(shí)缺乏對(duì)其明確的防治手段，本文就最近主要在其致癌方面研究作一介紹，為后續(xù)工作提供參考。

1 F.nucleatum 與消化系統(tǒng)疾病

1.1 口腔

F.nucleatum 是口腔生物膜重要組成部分，借助其自身表面不同黏附素以及特殊的生物學(xué)形態(tài)，可以與多種口腔代表菌共聚合，以及與多種口腔宿主細(xì)胞發(fā)生作用，在口腔中常導(dǎo)致早期炎癥的發(fā)生?？谇击[狀細(xì)胞癌（OSCC）可以出現(xiàn)在口腔任何部位，其發(fā)病率以及致死率居各類口腔癌首位，Al-hebshi等[2]通過(guò)檢測(cè)OSCC 組織切片和口腔上皮組織中各細(xì)菌基因富集程度，發(fā)現(xiàn)各細(xì)菌之間在種、屬上均具有顯著差異，其中F.nucleatum 多形亞種、銅綠假單胞菌和彎曲桿菌相關(guān)性最強(qiáng)，在對(duì)照組中發(fā)現(xiàn)，ATP 結(jié)合蛋白、8-oxoG 三磷酸酶等在基因代謝途徑中過(guò)表達(dá)。F.nucleatum 感染OSCC 細(xì)胞Tca8113 引起DNA 雙鏈斷裂損傷（DSB），當(dāng)細(xì)胞修復(fù)不足時(shí)，則通過(guò)激活Ku70/p53 通路致舌鱗癌細(xì)胞增殖，促使OSCC 發(fā)生[3]。人牙齦成纖維細(xì)胞(HGFs)是牙齦結(jié)締組織中最豐富的固有細(xì)胞，研究[4]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn).nucleatum通過(guò)刺激一種AKT/MAPK 和NF-κB 信號(hào)通路，致HGFs 細(xì)胞凋亡、細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）和促炎細(xì)胞因子顯著增加，并提出了其初步致病機(jī)制。F.nucleatum能夠通過(guò)調(diào)控MIR4435-2HG/miR-296-5p/Akt2/SNAI1 信號(hào)通路，在正常和癌變的口腔上皮細(xì)胞中觸發(fā)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），可能推動(dòng)了OSCC 進(jìn)展[5]。

血管反應(yīng)是牙周疾病重要免疫過(guò)程，F(xiàn).nucleatum 直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，會(huì)刺激CD31、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等的改變，從而抑制了內(nèi)皮細(xì)胞的增殖 和 成 管 能 力[6]。El-Awady 等[7]使 用SEM 評(píng) 估 了F.nucleatum、格氏鏈球菌和牙齦卟啉單胞菌體外成膜能力，三者之間協(xié)同作用促進(jìn)了對(duì)人單核細(xì)胞來(lái)源的樹突狀細(xì)胞（MoDCs）的侵襲性，破壞DC 成熟，在牙周炎患者血液中約99%的F.nucleatum 是由PanDCs 攜帶，其對(duì)DC 參與牙髓根尖周疾病等的免疫應(yīng)答可能產(chǎn)生影響。最近提出了梭菌CEACAM 結(jié)合蛋白(CbpF)的概念，其具體功能還未得到定義，但鑒定了F.nucleatum 能借助黏附素TAA 靶向人類CEACAM1，參與對(duì)牙齦組織的定植和侵襲，其中以具核和文森氏亞型表現(xiàn)突出[8]。

1.2 食管

食管中的正常菌群以鏈球菌屬為主，質(zhì)子泵抑制劑(PPI)、膳食營(yíng)養(yǎng)、胃內(nèi)容物環(huán)境等因素可能會(huì)使食管微生物結(jié)構(gòu)改變。其中食管癌（esophagus cancer，EC）是最為常見的惡性腫瘤之一，我國(guó)90%的食管癌為鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）。Yamamura等[9]用qPCR 法對(duì)325 例EC 組織中F.nucleatum定量檢測(cè)，有74 例組織F.nucleatumDNA 檢測(cè)陽(yáng)性，其與腫瘤分期顯著相關(guān)，而與年齡、性別、腫瘤位置等不相關(guān)，尤其在晚期ESCC 中F.nucleatum 感染更顯著[31]，在進(jìn)一步分析中CCL20 是上調(diào)最多的炎癥趨化因子，該因子由F.nucleatum 激活產(chǎn)生并增加了腫瘤侵襲力。Liu 等[10]在284 份EC 組織中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn).nucleatum 感染陽(yáng)性組比陰性對(duì)照組含有較高水平的ULK1 和ATG7 表達(dá)，兩者都參與細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)。

1.3 化膿性肝膿腫

F.nucleatum 引起的肝膿腫較為少見，但這種感染是潛在的，并可迅速進(jìn)展。口腔衛(wèi)生狀況可能是其感染的主要原因，而與免疫力、年齡等因素相關(guān)性較小[11]。Hooshmand[12]等研究表明，F(xiàn).nucleatum 慢性炎癥過(guò)程中，會(huì)導(dǎo)致亞急性感染患者出現(xiàn)類似放線菌樣病變，表現(xiàn)為肝組織廣泛壞死和纖維化，外科膿腫引流和抗生素治療是其主要治療方法。

1.4 IBD

IBD 主要包括克羅恩病(Crohn's disease，CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)，有關(guān)F.nucleatum 誘導(dǎo)IBD 發(fā)生的機(jī)制還不清楚。有研究[13-15]證實(shí)，F(xiàn).nucleatum 同樣在CD 和UC 中富集，通過(guò)靶向CARD3 分子的上調(diào)，介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ERS 通路激活，促進(jìn)腸黏膜屏障的破壞導(dǎo)致CD 發(fā)生[13]。CARD3 作為重要節(jié)點(diǎn)，其通過(guò)NOD2 激活體內(nèi)外IL-17F/NFκB 途徑，促進(jìn)IL-1β、IL-6、IL-17F 和TNF-α 等炎性細(xì)胞因子表達(dá)，促使UC 發(fā)展[14]。另有研究[15]發(fā)現(xiàn)F.nucleatum 誘導(dǎo)M1 巨噬細(xì)胞極化，通過(guò)AKT2途徑分泌大量炎性因子TNF-α、IFN-γ 等，損害腸道粘膜上皮屏障，增加腸道滲透性和細(xì)菌易位，導(dǎo)致炎癥增加和疾病的進(jìn)展。

1.5 CRC

CRC 是第三大最常見的癌癥，在CRC 患者唾液、結(jié)直腸組織和糞便中F.nucleatum 均有較高水平表達(dá)，CRC 檢出率在10%～90%之間[21]。CRC 與F.nucleatum 的關(guān)系是近年來(lái)討論的焦點(diǎn)，流行病學(xué)調(diào)查中，不同國(guó)家和地區(qū)之間的研究多數(shù)是CRC 與正常大腸組織中F.nucleatum 豐度的比較，其關(guān)聯(lián)性研究的檢測(cè)方法和結(jié)果存在差異，同時(shí)也提出了是否與種族、抗生素的使用等有關(guān)[16]。而直至目前，其參與CRC 癌變的機(jī)制仍未完全闡明?；贕holizadeh等[17]與Goradel 等人[18]提出的F.nucleatum 毒力因子(Fap2、FadA、LPS)、免疫調(diào)節(jié)因素、miRNAs 和細(xì)菌代謝四種機(jī)制，在此做一概括和擴(kuò)展。F.nucleatum 自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Fap2 結(jié)合存在于NK 細(xì)胞和T 細(xì)胞上的抑制性受體TIGIT，進(jìn)而抑制NK 細(xì)胞和T 細(xì)胞活性，腫瘤借此發(fā)生免疫逃逸現(xiàn)象[19]，對(duì)此，提出該觀點(diǎn)的Gur C 在其另一項(xiàng)研究中表明，可以考慮用CEACAM1 和TIGIT 抑制劑，特異性靶向治療由F.nucleatum 定植的腫瘤[20]。Fap2 的另一個(gè)受體是位于結(jié)腸細(xì)胞表面的Gal-GalNAc，它是F.nucleatum 富集、CRC 定位的標(biāo)志物，其有望成為新的治療靶點(diǎn)[17]。

黏附素FadA 參與E-cadherin/β-catenin 途徑，一方面激活I(lǐng)L-6/8/18 等促炎因子，另一方面刺激癌基因如Myc 等表達(dá)。Rubinstein 等[21]提出FadA 可通過(guò)E-cadherin 誘導(dǎo)Wnt/β-catenin 通路繼而上調(diào)Annexin A1 的表達(dá)，Annexin A1 在CRC 細(xì) 胞中特異存在，是預(yù)后不良的預(yù)測(cè)因子，Annexin A1 表達(dá)上調(diào)的患者預(yù)后更差，該模型通過(guò)驅(qū)動(dòng)體細(xì)胞基因突變和F.nucleatum 感染的“雙hit”擴(kuò)展了其致癌模型。miRNAs 能參與腫瘤細(xì)胞遷移、增殖、侵襲和分化，F(xiàn).nucleatum 參與miRNAs 調(diào)控時(shí)，在CRC 組織中，與癌癥信號(hào)相關(guān)的基因TP53、JUN、PRKACB等表達(dá)失調(diào)，而miR-4474/4717 通過(guò)CREBBP 靶基因轉(zhuǎn)錄后，可調(diào)控CRC 的進(jìn)展，該分析表明，CREBBP 是F.nucleatum 誘導(dǎo)CRC 異常表達(dá)的主要基因[22]。F.nucleatum 感染腸黏膜產(chǎn)生ROS 等炎癥因子，致使CpG 島的高甲基化（CIMP）、腫瘤高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI-H）和hMLH1 甲基化等CRC 的遺傳和表觀遺傳異常[23-25]，在MSI-H 的CRC 中富含CD4+/CD8+T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞等具有抗腫瘤的淋巴細(xì)胞，即MSI-H 的患者預(yù)后免疫評(píng)分也越高；而另一方面，F(xiàn).nucleatum 入侵CRC 致DNA 損傷（如8-oxoG），或產(chǎn)生的IL-6、PGE2 可能誘導(dǎo)了MSH3 從CRC 細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致MSI-L、EMAST，與非MSI-H 和非MSI-L、EMAST 的CRC 相比，MSIL、EMAST 的無(wú)復(fù)發(fā)生存率（recurrence-free survival，RFS）更短[23]。

CRC 轉(zhuǎn)移是大多數(shù)患者死亡的主要原因，研究[26]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn).nucleatum 通過(guò)上調(diào)CARD3 和激活自噬途徑，刺激CRC 細(xì)胞中自噬小體形成、自噬相關(guān)蛋白表達(dá)等促進(jìn)了CRC 轉(zhuǎn)移，F(xiàn).nucleatum 豐度與CARD3 表達(dá)呈正相關(guān)。CARD3 在F.nucleatum 誘導(dǎo)的IBD 炎癥發(fā)生、CRC 自噬調(diào)節(jié)中存在關(guān)聯(lián)，但具體機(jī)制還不明確。

2 其他相關(guān)疾病

目前主要與消化系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展的研究明顯日趨增加逐漸深入，其中又以對(duì)CRC 的致癌性為焦點(diǎn)。既往與F.nucleatum 相關(guān)的其他系統(tǒng)疾病研究相對(duì)較少，但仍然存在潛在感染致病風(fēng)險(xiǎn)。在8.8%的胰腺癌組織中存在F.nucleatum，與胃癌也有一定關(guān)聯(lián)[17]。在以后研究中，F(xiàn).nucleatum 成為全身致病的共同因素會(huì)達(dá)成共識(shí)，尤以其致癌性應(yīng)深入探究。

3 防治措施

3.1 免疫治療

從口腔到胃腸道，大多數(shù)口腔微生物由口腔沿消化道異位定植是頻繁連續(xù)的過(guò)程，腸道微生物組的組成可顯著影響免疫治療和化療的反應(yīng)。針對(duì)F.nucleatum 引起的各類感染性疾病，應(yīng)更多靶向其毒力因子或致病信號(hào)通路節(jié)點(diǎn)研發(fā)藥物。F.nucleatum代謝產(chǎn)生的H2S 不僅帶來(lái)口腔異味，還會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力，降低機(jī)體對(duì)抗生素的敏感性，Wang等人[27]從雞蛋黃中提取出lgY 針對(duì)口腔異味進(jìn)行了療效評(píng)估，選擇適宜濃度的lgY 對(duì)F.nucleatum 引起的口臭和牙周炎有治療作用。烷基過(guò)氧化氫還原酶亞單位C（AhpC）可保護(hù)專性厭氧菌免受過(guò)氧化氫類物質(zhì)的侵害，Guo 等人[32]發(fā)現(xiàn)F.nucleatum 感染陽(yáng)性CRC 患者血清中的抗體能特異性識(shí)別重組蛋白Fn-AhpC，通過(guò)預(yù)防性免疫小鼠，77.3%的小鼠IgG水平升高；且AhpC 比F.nucleatum 的外膜孔道FomA 蛋白具有更強(qiáng)免疫反應(yīng)，AhpC 序列與宿主和共生菌的同源性也較低或適中，如此或?qū)hpC 作為對(duì)抗腸道內(nèi)F.nucleatum 感染提供了一種具有可行性的備選疫苗。Liu[33]等報(bào)道了以自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為主的F.nucleatum 的外膜囊泡（OMV）蛋白質(zhì)組學(xué)特征，利用OMVs 暴露的抗原表位對(duì)F.nucleatum 的疫苗設(shè)計(jì)生產(chǎn)和有效預(yù)防CRC 帶來(lái)巨大潛力。

3.2 化療

目前CRC 的治療包括手術(shù)、化療和放療?；熌退幨悄[瘤頑固性復(fù)發(fā)的原因之一。F.nucleatum 通過(guò)TLR4/MyD88 依賴機(jī)制，調(diào)控miR-18a×/4802 在F.nucleatum 培養(yǎng)的細(xì)胞中選擇性缺失，分別誘導(dǎo)自噬原件ULK1、ATG7 激活，導(dǎo)致CRC 細(xì)胞自噬，促使CRC 細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶(5-FU) 的耐藥，增加了CRC 患者的耐藥性[28]，此外，這一機(jī)制還通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB、P65 等因子，顯著上調(diào)CRC 細(xì)胞HCT116 和HT29 中凋亡抑制蛋白BIRC3 的表達(dá)，BIRC3 抑制了caspase-3 對(duì)CRC 的凋亡作用，促進(jìn)晚期CRC 對(duì)5-FU 的耐藥，同時(shí)也檢測(cè)到低水平的RFS 與F.nucleatum 和BIRC3 的 高 表 達(dá) 有 關(guān)[29]。Anoctamin-1(ANO1)為一種氯離子通道蛋白，在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，F(xiàn).nucleatum 通過(guò)與F.nucleatum共培養(yǎng)的HCT116 和HT29 促進(jìn)了CRC 細(xì)胞中ANO1 的表達(dá)，而ANO1 的過(guò)表達(dá)阻止了奧沙利鉑、5-FU 誘導(dǎo)的凋亡效應(yīng)[30]。局部晚期的ESCC 宜先適用新輔助化放化療（NAC），其次手術(shù)治療，F(xiàn).nucleatum 的高表達(dá)與ESCC 的RFS 相關(guān)，影響到NAC 療效時(shí)，抗生素早期干預(yù)有助于改善治療[31]。

3.3 噬菌體

在如今多耐藥菌增加的情況下，噬菌體抗菌療法已正在成為一種具有前途的治療手段。之前報(bào)道過(guò)噬菌體FnpΦ2 的分離鑒定，以及F.nucleatum 亞型中的溫和性噬菌體ΦFunu1 和ΦFunu2 的基因組特征的研究，最近從F.nucleatum 中分離出一種新型噬菌體FNU1，通過(guò)對(duì)其形態(tài)學(xué)、基因組學(xué)、功能特征研究發(fā)現(xiàn)對(duì)F.nucleatum 生物膜有裂解破壞作用[34]，這些噬菌體有望成為探究CRC 以及牙周炎等致病線索以及未來(lái)的補(bǔ)充代替治療。此外，已有相關(guān)研究[35]機(jī)構(gòu)利用合成生物學(xué)技術(shù)，對(duì)已識(shí)別的噬菌體進(jìn)行優(yōu)化并最終達(dá)到根除CRC 中F.nucleatum 的目的。

3.4 其他

脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylases，PHDs)抑制劑——二甲基乙二?；拾彼幔―MOG）可降低多種炎癥性疾病死亡率，研究[36]發(fā)現(xiàn)，DMOG 可抑制由F.nucleatum 誘導(dǎo)HGFs 產(chǎn)生的炎癥因子的表達(dá)，可能為控制牙周病的發(fā)生和發(fā)展提供新的治療策略。

4 小結(jié)

綜上所述，現(xiàn)階段對(duì)F.nucleatum 的研究主要集中在以口腔疾病和CRC 為中心的消化系統(tǒng)疾病，在此探討了分子機(jī)制方面的致病效應(yīng)，后續(xù)還需投入更多對(duì)其他相關(guān)疾病機(jī)制的深究，尤其是對(duì)CRC 的致癌模型仍待進(jìn)一步修正完善，對(duì)F.nucleatum 各亞型致病力還需鑒別。結(jié)合目前看，防治手段還沒(méi)有成熟，針對(duì)腫瘤患者逐年攀升、化療耐藥等因素，都警醒人們新藥研發(fā)迫在眉睫。未來(lái)在加快其機(jī)制研究的同時(shí)還需積極探索診斷、防治、預(yù)后等措施。