誘導(dǎo)煙草抗灰霉病的茉莉酸甲酯有效濃度篩選

李林倩，余朝陽，陳 業(yè)，張秀榆，孔 瓊，袁盛勇，薛春麗，陶宏征

（紅河學(xué)院/云南省高校滇南特色生物資源研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南蒙自 661199）

煙草灰霉病是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的真菌性病害，主要危害苗期和大田期的煙葉。當(dāng)濕度較大時(shí)，葉片和幼莖密生有灰色霉層，嚴(yán)重時(shí)發(fā)病率可達(dá)100%。[1-2]該病目前仍以化學(xué)防治為主，但由于灰葡萄孢變異大、易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)使化學(xué)防效較低，且化學(xué)藥劑的大量使用不僅造成環(huán)境污染，還降低煙草品質(zhì)。[3]因此開展煙草灰霉病的綠色防控尤為重要。而植物誘導(dǎo)抗性因其抗病的系統(tǒng)性、持久性和廣譜性等優(yōu)點(diǎn)，已成為防治植物病害的新思路。

茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）作為一種植物激素信號(hào)分子廣泛存在于植物體中，外源利用能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生化學(xué)防御，激發(fā)相關(guān)基因表達(dá)。[4]大量研究發(fā)現(xiàn)MeJA與植物抗病性有相關(guān)性，且參與了植物局部或系統(tǒng)抗性[5]，施用外源MeJA能誘導(dǎo)植物對(duì)病原真菌、細(xì)菌、線蟲產(chǎn)生抗病性，如誘導(dǎo)紫花苜?？垢。‵usarium oxysporum）[6]、誘導(dǎo)辣椒抗青枯?。≧alstonia solanacearum）[7]、也能提高番茄果實(shí)對(duì)鏈格孢霉（Alternaria solani）等病原菌的侵染。[8]因此，本研究以MeJA為外源誘導(dǎo)物，篩選出對(duì)煙草灰霉病具有較好抗性的最佳濃度、持效期和接種時(shí)間，以期為茉莉酸甲酯指導(dǎo)煙草灰霉病防治提供理論數(shù)據(jù)。

1.材料與方法

1.1 材料

煙草BY-2品種和灰葡萄孢菌種均保存于紅河學(xué)院生命學(xué)院305室。灰霉菌培養(yǎng)采用PSA固體培養(yǎng)基進(jìn)行暗培養(yǎng)，溫度為24±1℃，7d后取菌落邊緣的菌絲塊用于菌絲生長試驗(yàn)，同時(shí)收集孢子進(jìn)行孢子懸浮液制備。煙草先用漂浮育苗后移栽，直至煙苗長為7葉1心期時(shí)接種使用。茉莉酸甲酯（北京索萊寶科技有限公司）先用少量無水乙醇溶解，再用無菌水配成所需濃度，濃度梯度為0.01mM、0.05 mM、0.1 mM、0.5 mM、1 mM。

1.2 方法

1.2.1 MeJA對(duì)灰葡萄孢的影響

分別測定了不同濃度茉莉酸甲酯對(duì)灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)和菌絲生長的影響。（1）將上述5個(gè)濃度梯度的MeJA孢子懸浮液置于24±1℃暗培養(yǎng)，每隔12h觀察孢子的萌發(fā)情況，連續(xù)觀察3次，統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率，以滅菌水為對(duì)照。（2）PSA固體培養(yǎng)基制成含MeJA分別為上述5個(gè)濃度梯度的平板，對(duì)照為不含MeJA的PSA平板。平板中央接入直徑為6mm菌絲塊，于24±1℃暗培養(yǎng)，5d后測量菌落直徑，計(jì)算抑菌率，每個(gè)處理3次重復(fù)。抑菌率（%）=（對(duì)照菌落生長量-處理菌落生長量）/對(duì)照菌落生長量×100 %。結(jié)果采用SPSS17.0進(jìn)行顯著性分析。

1.2.2 MeJA誘導(dǎo)煙草抗灰霉病的最佳濃度篩選

于不同濃度MeJA溶液中加入0.05%（V/V）Tween-80，再用噴霧器將不同濃度MeJA溶液噴施于煙草葉片上（葉片正反面均勻噴霧，藥液不流淌為宜），對(duì)照僅用無菌水和0.05%（V/V）Tween-80噴霧處理。12 h后用濃度為1×106個(gè)/mL灰葡萄孢孢子懸浮液噴施于上述處理的煙草葉片（葉片正反面均勻噴霧，孢子液不流淌為宜），接種后避光保濕24h，并置于溫度25±2℃和濕度為85%人工氣候箱中培養(yǎng)，于第10d調(diào)查灰霉病發(fā)病情況，根據(jù)表1進(jìn)行分級(jí)[9]，計(jì)算病情指數(shù)和誘抗效果，每個(gè)處理調(diào)查5個(gè)葉片，3次重復(fù)。

表1 灰霉病病斑的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

公式為：病情指數(shù)＝（∑病級(jí)葉數(shù)×該病級(jí)值／調(diào)查總?cè)~片數(shù)×最高級(jí)數(shù)值）×100

誘抗效果＝（對(duì)照病情指數(shù)－處理病情指數(shù)）／對(duì)照病情指數(shù)×100%

1.2.3 MeJA處理后誘導(dǎo)期及抗灰霉病持久性的測定

根據(jù)1.2.3結(jié)果，于MeJA溶液最佳濃度處理后每天噴上濃度為1×106個(gè)/mL灰葡萄孢孢子懸浮液于煙草葉片，葉片正反面均勻噴霧，液體不流淌為宜，接種后避光保濕24h，并置于溫度25±2℃和濕度為85%人工氣候箱中培養(yǎng)，接種8d后調(diào)查發(fā)病情況，進(jìn)行病情指數(shù)和誘抗效果計(jì)算，確定最佳誘導(dǎo)期及持久性。每個(gè)處理調(diào)查5個(gè)葉片，3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 茉莉酸甲酯對(duì)灰葡萄孢生長的影響

由圖1可以看出，灰葡萄孢孢子在5個(gè)MeJA濃度下均能萌發(fā)和生長，各處理差異不顯著（p＜0.05）。在處理后的12-36 h間，灰葡萄孢孢子隨著時(shí)間延長，其孢子萌發(fā)率隨之增高，且于36h達(dá)到最大值；且在同一MeJA濃度處理下，不同時(shí)間下的孢子萌發(fā)率差異不顯著。同時(shí)灰葡萄孢菌絲塊在含有不同濃度MeJA生長5d后，各處理間菌落抑制率不顯著（見圖1中的抑制率）。因此表明，MeJA對(duì)灰葡萄孢生長無影響。

圖1 不同濃度MeJA對(duì)灰葡萄孢孢子萌發(fā)和菌絲生長的影響

2.2 不同濃度MeJA對(duì)煙草抗灰霉病誘抗效果

通過活體接種試驗(yàn)，沒有噴施MeJA煙草植株葉片發(fā)病率最高達(dá)100 %。病斑初期呈水漬狀，接著迅速擴(kuò)展，最后形成黃褐色且邊緣不規(guī)則的輪紋。不同濃度MeJA處理后，均能不同程度地降低煙草灰霉病的病情指數(shù)，且在濃度為0.01-0.50mM處理后能有效誘導(dǎo)煙草對(duì)灰葡萄孢菌產(chǎn)生抗性。但不同濃度MeJA產(chǎn)生的誘抗效果不同，其中0.1mM MeJA處理后的誘抗效果最好，高達(dá)52.29%，病情指數(shù)顯著低于對(duì)照和其它濃度下的處理（見表2）。但是當(dāng)MeJA為1mM時(shí)，煙草灰霉病的病情指數(shù)與對(duì)照相等，沒有表現(xiàn)出誘抗效果，表明MeJA誘導(dǎo)煙草抗灰霉病的濃度并不是越高越好。

表2 不同濃度茉莉酸甲酯處理對(duì)煙草灰霉病的影響

2.3 MeJA誘導(dǎo)煙草抗灰霉病的最佳間隔期和持久期

在最佳MeJA濃度（0.1mM）處理下，連續(xù)8d觀測了煙草灰霉病的病情指數(shù)，并進(jìn)行誘抗效果統(tǒng)計(jì)。根據(jù)圖2結(jié)果，發(fā)現(xiàn)處理時(shí)間不同，其發(fā)病情況和誘導(dǎo)抗病效果也不一樣；在處理后1-4d間，灰霉病的病情指數(shù)逐漸降低且誘抗效果增加，其中第4d誘抗效果最好，病斑最小，病情指數(shù)最低；而處理后5-8d，灰霉病的病情指數(shù)又急速增加，且于第8d無誘抗效果。因此用0.1mM MeJA誘導(dǎo)煙草抗灰霉病的最佳間隔期為4d；而但處理間隔8d時(shí)，幾乎無誘抗效果，這說明MeJA誘導(dǎo)煙草抗灰霉病的持久期可達(dá)7d左右。

圖2 不同誘導(dǎo)時(shí)間下的煙草灰霉病病情指數(shù)和誘抗效果

3 小結(jié)與討論

茉莉酸甲酯（MeJA）作為一種抗逆信號(hào)物質(zhì)，能提高植物抗病害的能力。[10]但其誘導(dǎo)抗性高低與寄主植物品種、病害種類和茉莉酸甲酯濃度相關(guān)。當(dāng)采用不同濃度MeJA噴霧辣椒幼苗后，0.1 mM 能明顯誘導(dǎo)粵紅1號(hào)幼苗抗青枯病（Ralstonia solanacearum），0.05mM對(duì)辛香8號(hào)的誘導(dǎo)效果最好[7]。而在紫花苜蓿根腐?。‵usarium oxysporum）的防治試驗(yàn)中，其根腐病病情指數(shù)的高低與外源MeJA濃度、紫花苜蓿品種和誘導(dǎo)時(shí)間相關(guān)，其中MeJA 濃度是主要因素，但MeJA濃度為0.1mg/mL時(shí)抑制效果最佳。[6]當(dāng)用1g/mL MeJA噴霧4葉期的煙草幼苗后，該處理能提高幼苗抗炭疽?。–olletotrichum destructivum）的能力。[5]

本文通過茉莉酸甲酯5個(gè)不同濃度對(duì)煙草灰霉病誘抗檢測發(fā)現(xiàn)，當(dāng)噴施外源不同濃度茉莉酸甲酯均能不同程度減低煙草灰霉病的發(fā)生，而不是直接的抑菌作用；MeJA濃度為0.1 mM時(shí)，病斑最小，煙草灰霉病的病情指數(shù)最低，誘抗效果最高為（52.29±3.13）%；當(dāng)0.1 mM MeJA處理后第1d就表現(xiàn)出誘抗效果，且持續(xù)至第7d，這說明MeJA對(duì)誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生抗性有著較好持久性。尤其噴施后的第4d，煙草葉片的病斑最小，病情指數(shù)最低，同時(shí)表現(xiàn)出最大的誘抗效果為69.90%。因此，MeJA誘導(dǎo)煙草灰霉病的最佳間隔期是4d，持久期可達(dá)7d左右，且植物誘導(dǎo)抗性的產(chǎn)生需要一定時(shí)間，在煙草灰霉病的大田防治中，需要在病害發(fā)生之前噴施MeJA才能起到較好的防治作用。