氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測定白酒中乙酸乙酯含量的不確定度評定

左惠君，都 蕓，左惠蕓，邱怡筠，張露月

（1.煙臺(tái)市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，山東煙臺(tái) 264000；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫 214122）

測量不確定度可以合理地表征被測量值的分散性[1]。通過測量不確定度可以了解到被測量值在什么范圍內(nèi)，同時(shí)還可以定量說明一個(gè)實(shí)驗(yàn)室的檢驗(yàn)?zāi)芰λ絒2-3]。RB/T 214—2017《檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定能力評價(jià)檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)通用要求》[4]中明確規(guī)定檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)應(yīng)根據(jù)需要建立評定測量不確定度的程序，在出現(xiàn)臨界值、內(nèi)部質(zhì)量控制或客戶要求時(shí)，應(yīng)報(bào)告檢驗(yàn)項(xiàng)目的測量不確定度[5]。由此可見，測量不確定度的評定對于檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)保證所出具數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性是十分重要的[6]。

酯類物質(zhì)是形成白酒香氣的主要成分，可在不同程度上增加酒的香氣并決定香氣的品質(zhì)。白酒中的酯類物質(zhì)一部分是酵母菌、細(xì)菌、霉菌的胞內(nèi)代謝產(chǎn)物，一部分來源于發(fā)酵后期酸和醇在釀酒微生物的作用下的酯化反應(yīng)，是形成酒體不同香氣和不同濃郁程度的主要因素[7-9]。乙酸乙酯是構(gòu)成清香型白酒主體復(fù)合香氣的主要物質(zhì)。它的含量對判定清香型白酒的品質(zhì)和質(zhì)量等級(jí)有很重要的意義，也是實(shí)驗(yàn)室中最常檢測的理化項(xiàng)目之一[10-12]。本文參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 10345—2007《白酒分析方法》[13]，采用氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測定清香型白酒中乙酸乙酯含量。并按照J(rèn)JF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[14]對測量結(jié)果進(jìn)行不確定度分析，通過數(shù)學(xué)模型的建立系統(tǒng)分析了各不確定度來源，并對各個(gè)分量進(jìn)行評估和合成，為清香型白酒的質(zhì)量控制和檢驗(yàn)檢測結(jié)果評定提供一定的參考和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

樣品：市售白酒樣品。

儀器設(shè)備：Agilent 7890B 型氣相色譜儀配FID檢測器，美國安捷倫科技有限公司；AR224CN 型萬分之一精密分析天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；10～100 μL 可調(diào)量程移液器，Eppendorf 艾本德中國有限公司。100 mL、10 mL A 級(jí)容量瓶、1 mL A 級(jí)單標(biāo)吸量管，天津市天科玻璃儀器制造有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

a.乙酸乙酯儲(chǔ)備液[2 %（v/v）]配制：用天平準(zhǔn)確稱量2 mL 乙酸乙酯（色譜純）于100 mL 量瓶中（準(zhǔn)確至0.000 1 g），用60%乙醇溶液定容至刻度，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為c儲(chǔ)。

b.內(nèi)標(biāo)乙酸正戊酯溶液[2 %（v/v）]：吸取乙酸正戊酯（色譜純）2 mL，用60 %乙醇溶液定容至100 mL，濃度為c內(nèi)0。

c.混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：吸取乙酸乙酯儲(chǔ)備液1.00 mL移入100 mL 容量瓶中，加入內(nèi)標(biāo)溶液1.00 mL，用60%乙醇溶液稀釋至刻度。

1.3 測定步驟

氣相參數(shù)調(diào)至最佳，穩(wěn)定后混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣6 次，以乙酸乙酯與乙酸正戊酯（內(nèi)標(biāo)）峰面積比的平均值做校正因子f。

吸取樣品10.0 mL 于10 mL 容量瓶中，加入內(nèi)標(biāo)溶液100 μL，混勻后，在與f 值測定相同的條件下進(jìn)樣，測定，做6 個(gè)平行。其中，第1 個(gè)平行樣品進(jìn)樣6次，計(jì)算樣品峰面積比測量重復(fù)性，以前2次測定平均值為1 號(hào)樣品測得值，后5 個(gè)樣品只平行測定2 次，測定平均值為樣品測得值。檢測流程圖見圖1。

圖1 檢測流程圖

2 測量模型及測量不確定度分析

根據(jù)內(nèi)標(biāo)法原理，標(biāo)準(zhǔn)溶液校正因子：

樣品中乙酸乙酯的計(jì)算公式：

I為內(nèi)標(biāo)在樣品中的濃度：

式中：c標(biāo)——混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中乙酸乙酯的濃度，g/L；

c內(nèi)——混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中內(nèi)標(biāo)乙酸正戊酯的濃度，g/L；

A標(biāo)——混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中乙酸乙酯的峰面積；

A內(nèi)——混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中內(nèi)標(biāo)乙酸正戊酯的峰面積；

c儲(chǔ)——配制的乙酸乙酯儲(chǔ)備液的濃度，g/L；

c內(nèi)0——配制的內(nèi)標(biāo)乙酸正戊酯溶液的濃度，g/L；

v標(biāo)——配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)乙酸乙酯吸取體積，mL；

v內(nèi)——配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)內(nèi)標(biāo)乙酸正戊酯吸取體積，mL；

v定——混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的定容體積，mL；

A樣——酒樣中乙酸乙酯的峰面積；

A內(nèi)-樣—酒樣中內(nèi)標(biāo)乙酸正戊酯的峰面積；

v樣——吸取酒樣的體積，mL；

v內(nèi)-樣——酒樣中加入內(nèi)標(biāo)乙酸正戊酯溶液的體積，mL。

將公式（1）（2）（4）代入公式（3）得：

可得測量模型，X=F（c儲(chǔ)，v標(biāo)，v內(nèi)，v內(nèi)-樣，v樣，

由此可知，樣品中乙酸乙酯測量結(jié)果不確定度主要來源于乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液濃度、配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)吸取乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液體積及內(nèi)標(biāo)乙酸正戊酯溶液的體積、吸取樣品體積及加入內(nèi)標(biāo)溶液體積、校正因子測定時(shí)乙酸乙酯和內(nèi)標(biāo)峰面積比以及樣品中乙酸乙酯和內(nèi)標(biāo)峰面積比這7 部分。與內(nèi)標(biāo)乙酸正戊酯儲(chǔ)備液濃度、混合標(biāo)準(zhǔn)溶液定容體積及樣品加內(nèi)標(biāo)后體積之和都無關(guān)，這也是內(nèi)標(biāo)法的特點(diǎn)之一，這3 個(gè)因素可不予評定。根據(jù)測量模型，各不確定度分量分析因果圖見圖2。

3 不確定度評定

3.1 測量重復(fù)性

按照標(biāo)準(zhǔn)要求對一酒樣中的乙酸乙酯進(jìn)行6次測定，測定結(jié)果見表1。

表1 酒樣中的乙酸乙酯測定結(jié)果

測量重復(fù)性不確定度：

3.2 乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液引入的不確定度

乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液不確定度主要是由標(biāo)準(zhǔn)品的純度、標(biāo)準(zhǔn)品的稱量質(zhì)量、定容體積引入。

3.2.1 乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品純度P的不確定度

乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品證書表明，質(zhì)量分?jǐn)?shù)P=99.7%，U=0.2%，K=2。

純度P的相對不確定度為：

圖2 不確定度分量分析因果圖

3.2.2 乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品稱量質(zhì)量m的不確定度

乙酸乙酯儲(chǔ)備液配制時(shí)，用萬分之一天平進(jìn)行了兩次稱量，稱量得2 mL 乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量m 為1.8657 g。查天平檢定證書可知，天平的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2 mg，天平的重復(fù)性為極差，用極差系數(shù)C（6次）=2.53求標(biāo)準(zhǔn)偏差[14]。

稱量引起的相對不確定度為：

3.2.3 乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品定容體積引入的不確定度

乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品的定容使用的是A 級(jí)100 mL容量瓶，按照檢定規(guī)程其最大允差為±0.10 mL[15]，按照均勻分布，其不確定度為：=0.0577 mL。

定容過程中，溫度波動(dòng)也會(huì)對定容體積造成影響。根據(jù)《新編酒精密度濃度和溫度常用數(shù)據(jù)表》[16]中表Ⅱ“酒精溶液密度與溫度和體積濃度關(guān)系表”，60%vol酒精在20 ℃左右的密度見表2。

表2 60%vol酒精在不同溫度下的密度

根據(jù)表2 計(jì)算得60%vol 酒精溶液體積膨脹系數(shù):8.8×10-4/℃，明顯大于玻璃的膨脹系數(shù)。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度變化為20 ℃±2 ℃，溫度波動(dòng)按均勻分布k=，故溫度變化引起的不確定度為：

合成100 mL容量瓶引起的相對不確定度：

綜上，合成乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液引入的相對不確定度為：

3.3 配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，吸取乙酸乙酯儲(chǔ)備液1.00 mL及加入內(nèi)標(biāo)溶液1.00 mL引入的不確定度

實(shí)驗(yàn)室使用A 級(jí)1 mL 單標(biāo)吸量管，最大允差為±0.007 mL[15]，按照均勻分布，其引入的相對不確定度為ur(V標(biāo))=ur(V內(nèi))==0.00404。

3.4 酒樣測定時(shí)取樣量和加入內(nèi)標(biāo)溶液引入的不確定度

酒樣取樣采用A 級(jí)10 mL 單標(biāo)吸量管直接取樣，其最大允差為±0.020 mL[15]，因此按照均勻分布，酒樣取樣量引入的相對不確定度為：

向酒樣中加入100 μL 內(nèi)標(biāo)溶液是使用100 μL移液器，根據(jù)JJG 646—2006[17]可知，其量取100 μL時(shí)容量允許誤差為2%，可直接按均勻分布得出相對不確定度，加入內(nèi)標(biāo)溶液引入的相對不確定度為：

3.5 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中乙酸乙酯和內(nèi)標(biāo)峰面積比重復(fù)性引入的不確定度

氣相色譜儀器的重復(fù)性會(huì)對每次測量結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，因此校正因子測定時(shí)由此引入的不確定度應(yīng)考慮在內(nèi)[18-19]。本次測定使用的內(nèi)標(biāo)法，可以消除進(jìn)樣體積、操作條件波動(dòng)等很多因素的影響[20-21]，因此單純采用氣相色譜儀檢定報(bào)告中的重復(fù)性數(shù)據(jù)并不能真實(shí)表達(dá)這一不確定度分量。所以，在此次研究中，將峰面積比作為一個(gè)整體，通過平行測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果來計(jì)算不確定度。配制好加入內(nèi)標(biāo)溶液的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后，待色譜儀基線穩(wěn)定，用自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，平行測定6 次，記錄乙酸乙酯和內(nèi)標(biāo)峰的峰面積，用其比值計(jì)算出校正因子，結(jié)果見表3。

表3 校正因子測定時(shí)乙酸乙酯和內(nèi)標(biāo)峰面積比

表4 樣品中乙酸乙酯和內(nèi)標(biāo)峰面積比

3.6 樣品測定時(shí)乙酸乙酯和內(nèi)標(biāo)峰面積比重復(fù)性引入的不確定度

吸取樣品加入內(nèi)標(biāo)溶液混勻后，在與校正因子f 值測定相同的條件下用自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，測定。第1 個(gè)樣品平行進(jìn)樣6 次，計(jì)算其重復(fù)性，以前2 次測定平均值為1 號(hào)樣品測得值。結(jié)果見表4。

實(shí)驗(yàn)過程中，一個(gè)樣品一般平行測定兩次，以前2 次平均值7.6466 計(jì)算，2 次測量重復(fù)性相對不確定度為0.00091。

3.7 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

由評定過程可知，各不確定度輸入量之間相互獨(dú)立，因此，合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

u(X)=ur(X)×X=0.0131×2.42=0.032 g/L。

3.8 擴(kuò)展不確定度及不確定度報(bào)告

取包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度U=k×u(X)=2×0.032=0.064≈0.07 g/L

白酒中乙酸乙酯含量的結(jié)果：X=（2.42±0.07）g/L；k=2，各類相對不確定度主要分量及貢獻(xiàn)見圖3。

圖3 各不確定度分量值圖

4 結(jié)果與討論

采用氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測定清香型白酒中乙酸乙酯含量，并對測量結(jié)果進(jìn)行不確定度分析，得出該測定方法的擴(kuò)展不確定度為0.064 g/L。通過內(nèi)標(biāo)法測量模型推算可知，樣品中乙酸乙酯的含量測定與內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液濃度無關(guān)，與混合標(biāo)準(zhǔn)溶液定容體積無關(guān)，與樣品加內(nèi)標(biāo)后體積之和無關(guān)。

從圖3 可看出，由體積所引起的不確定度是影響乙酸乙酯含量測量不確定度的主要因素，其他不確定度分量大致相當(dāng)。用100 μL 移液器向酒樣中加入內(nèi)標(biāo)溶液時(shí)引入的相對不確定度為0.0115，是最大的影響因素。近年來，移液器由于方便快捷而在實(shí)驗(yàn)室普遍使用，這也提醒我們對移液器的規(guī)范使用和定期檢定維護(hù)是十分重要的。根據(jù)內(nèi)標(biāo)法的特點(diǎn)，以峰面積比為整體進(jìn)行評定可以看出氣相色譜儀的重復(fù)性對測定結(jié)果的影響還是比較小的，這也是內(nèi)標(biāo)法定量相較于外標(biāo)法定量的優(yōu)勢之一?？傊?，在嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作的基礎(chǔ)上，選用精度高的計(jì)量器具是降低不確定度很好的途徑。