流式細(xì)胞術(shù)在眼部疾病細(xì)胞因子和細(xì)胞學(xué)檢查中的應(yīng)用進(jìn)展

劉銘 綜述 陶勇 審校

1北京智德醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司 101399；2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院眼科 100020

流式細(xì)胞術(shù)是一種能夠?qū)蝹€細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、定量分析和分選的檢測技術(shù)，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好和通量高等優(yōu)點，是目前先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)之一，廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)等領(lǐng)域的醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷，特別是免疫學(xué)的淋巴細(xì)胞亞群分析。淋巴細(xì)胞亞群分析是臨床開展最多的檢測項目，也是檢測機體免疫功能的重要指標(biāo)，對疾病的診斷、發(fā)病機制研究、疾病的治療和預(yù)后具有重要意義[1-3]。隨著流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展以及眼科基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究和臨床精準(zhǔn)診療要求的不斷提高，流式細(xì)胞術(shù)越來越多地用于眼部疾病的研究與輔助靶向治療，該技術(shù)可以定量檢測眼內(nèi)液中細(xì)胞因子水平、細(xì)胞亞群的占比，對研究眼部疾病的發(fā)病機制和分類診療具有重要意義。本文就流式細(xì)胞術(shù)在眼部疾病眼內(nèi)液中細(xì)胞因子和細(xì)胞學(xué)檢查的應(yīng)用進(jìn)展綜述。

1 流式細(xì)胞術(shù)在眼部疾病細(xì)胞因子檢測中的應(yīng)用

細(xì)胞因子是一類由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激而合成并分泌的具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)，其通過結(jié)合相應(yīng)受體來調(diào)節(jié)細(xì)胞增生、分化，調(diào)控免疫應(yīng)答。細(xì)胞因子水平是判斷機體免疫功能的一個重要指標(biāo)，在眼部疾病的診療中具有重要價值。

1.1 流式細(xì)胞術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附試驗法的比較

目前用于細(xì)胞因子檢測的方法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法、基于流式細(xì)胞術(shù)的流式微球微陣列法(cytometric beads array，CBA)和流式多重微陣列法(cytometry multiplex arrays，CMA)[4-5]。CBA法適用于20個以內(nèi)細(xì)胞因子、小批量樣本的同時檢測。CMA法適用于20個以上細(xì)胞因子、大批量樣本的同時檢測，最高可同時檢測100個細(xì)胞因子。與傳統(tǒng)的ELISA法相比，CBA法和CMA法具有以下優(yōu)點：(1)操作簡單 CBA法和CMA法采用微球集成式檢測，只需一組標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可計算出每種待測細(xì)胞因子的濃度，大大簡化操作，節(jié)約成本；(2)所需樣本量少 ELISA每項檢測樣本用量50～200 μl，CBA法和CMA法所需樣本量少于50 μl；(3)通量高 ELISA法1個反應(yīng)只能檢測1個細(xì)胞因子，CBA法和CMA法1個反應(yīng)可同時檢測多個細(xì)胞因子；(4)靈敏度和可重復(fù)性高 CBA法和CMA法靈敏度可達(dá)pg/ml級別，無酶-底物背景干擾，檢測結(jié)果穩(wěn)定且可重復(fù)性高；(5)組合多樣化 CBA法和CMA法可自由組合所檢測的不同種類細(xì)胞因子，從而滿足臨床和科研細(xì)胞因子檢測多樣化的需求。

1.2 不同眼病眼內(nèi)液細(xì)胞因子的流式細(xì)胞術(shù)檢測

1.2.1新生血管性眼病 Miao等[6]采用CBA法對脈絡(luò)膜新生血管患者房水中的炎性細(xì)胞因子進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)特發(fā)性脈絡(luò)膜新生血管患者房水中細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6和IL-8濃度與黃斑水腫體積顯著相關(guān)，細(xì)胞因子IL-1β、IL-10、IL-12p和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α濃度與黃斑厚度/黃斑體積均無明顯相關(guān)性；玻璃體腔內(nèi)注射抗血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)藥物治療前后炎性因子水平無顯著變化，為脈絡(luò)膜新生血管疾病聯(lián)合抗炎治療提供了理論依據(jù)。Maier等[7]首次將CBA法應(yīng)用于玻璃體液中血管生成因子的檢測，發(fā)現(xiàn)與非糖尿病患者相比，糖尿病患者的玻璃體中IL-8、VEGF和血管生長素水平顯著升高，而血清中無明顯變化，檢測結(jié)果與ELISA法一致，且CBA法具有所需樣本用量小、檢測參數(shù)多、檢測速度快、成本低等優(yōu)點。Koss等[8]采用CBA法檢測35例視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞患者和28例非視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞患者玻璃體液樣本中炎性細(xì)胞因子IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)和VEGF-A的含量，發(fā)現(xiàn)單純抑制VEGF-A可能不足以減輕視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞患者治療中的炎癥反應(yīng)。

1.2.2眼內(nèi)淋巴瘤 Fisson等[9]采用CBA法分別檢測原發(fā)性眼內(nèi)淋巴瘤(primary intraocular lymphoma，PIOL)、眼腦淋巴瘤(oculocerebral lymphoma，OCL)、無出血性視網(wǎng)膜脫離(retinal detachment，RD)和葡萄膜炎患者玻璃體液和房水中的細(xì)胞因子，發(fā)現(xiàn)所有樣本中均未檢測到IL-2、IL-4和TNF-α。RD患者玻璃體液中檢測到IL-6含量較高，PIOL和OCL患者樣本中IL-10/IL-6比值略高于葡萄膜炎患者，認(rèn)為IL-10/IL-6和IL-10/干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)比值的組合檢測對鑒別診療葡萄膜炎和PIOL/OCL具有重要意義，可用于PIOL的篩查。Pochat-Cotilloux等[10]采用CMA法對玻璃體視網(wǎng)膜淋巴瘤患者和葡萄膜炎患者房水和玻璃體液中IL-6、IL-10濃度進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)2個組患者玻璃體液、房水中IL-10和IL-10/IL-6比值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，并認(rèn)為IL-10和IL-10/IL-6比值對玻璃體視網(wǎng)膜淋巴瘤早期診斷和預(yù)后監(jiān)測有重要作用。

1.2.3視網(wǎng)膜病變 Yoshida等[11]采用CBA法測定了增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)患者玻璃體切割術(shù)前以及術(shù)后7個月人工晶狀體植入術(shù)時玻璃體液中MCP-1、IL-6和IL-8的濃度，發(fā)現(xiàn)人工晶狀體植入術(shù)時樣品中MCP-1和IL-6濃度明顯高于玻璃體切割術(shù)前采集的樣品，表明即使玻璃體切割術(shù)后病情得到緩解，仍存在可引起糖尿病黃斑水腫的長期炎癥。Yoshida等[12]還采用CBA法研究了玻璃體切割術(shù)后病情未緩解的PDR患者玻璃體液中MCP-1、IL-6、IL-8和VEGF的濃度，推測MCP-1、IL-6和IL-8濃度升高的原因可能是術(shù)后纖維增生，VEGF可能是PDR患者玻璃體切割術(shù)失敗后新生血管形成的原因[11-12]。

1.2.4其他眼部疾病 董寧等[13]采用CMA法對行超聲乳化白內(nèi)障摘出術(shù)的2型糖尿病患者房水中27種細(xì)胞因子進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)房水中細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IP-10、MCP-1和VEGF質(zhì)量濃度與白內(nèi)障術(shù)后黃斑水腫的發(fā)生密切相關(guān)。張勇等[14]采用CMA法檢測原發(fā)性開角型青光眼(primary open angle glaucoma，POAG)患者和年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者房水發(fā)現(xiàn)，MCP-1、可溶性血管細(xì)胞黏附分子-1和可溶性神經(jīng)細(xì)胞黏附分子在POAG患者房水中表達(dá)水平高，提示POAG是一種神經(jīng)退行性疾病，且在發(fā)病過程中有神經(jīng)炎癥發(fā)生。Ooi等[15]分別采用CBA法和ELISA法對急性全葡萄膜炎患者和白內(nèi)障患者房水進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)IFN-γ與IL-10在葡萄膜炎患者中具有相關(guān)性，TNF-α與IL-4/IFN-γ在白內(nèi)障患者房水中具有相關(guān)性。任寧等[16]采用流式細(xì)胞術(shù)檢測糖尿病干眼患者和正常人結(jié)膜上皮細(xì)胞中趨化因子受體(chemokine receptor，CCR)4、CCR5、CCR6和淚液中輔助性T細(xì)胞(T helper cell，Th)-17的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CCR5、CCR6和Th-17細(xì)胞可能參與了糖尿病并發(fā)干眼的發(fā)生，并在發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用。姚娟等[17]采用CMA法對春季角結(jié)膜炎患者、季節(jié)性變應(yīng)性結(jié)膜炎患者、常年性變應(yīng)性結(jié)膜炎患者及健康志愿者各20例40眼淚液進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)IL-4、IL-5和IL-13參與多種類型變應(yīng)性結(jié)膜炎的發(fā)病，且在不同類型變應(yīng)性結(jié)膜炎患者眼表中的表達(dá)存在差異。

2 流式細(xì)胞術(shù)在眼部疾病細(xì)胞學(xué)檢查中的應(yīng)用

細(xì)胞學(xué)檢查方法主要包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查、免疫組織化學(xué)檢測和流式細(xì)胞分析。細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查是指通過對患者病變部位脫落、刮取或穿刺抽取的細(xì)胞進(jìn)行涂片、固定、染色等處理，在顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，從而做出定性診斷。細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查是腫瘤診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查無法辨別腫瘤細(xì)胞來源及腫瘤具體類型，需要依賴免疫組織化學(xué)檢測或流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步分析。免疫組織化學(xué)檢測和流式細(xì)胞分析是細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查的重要輔助手段。

2.1 流式細(xì)胞術(shù)與免疫組織化學(xué)檢測的比較

免疫組織化學(xué)檢測操作繁瑣，且對操作人員取材和切片制備水平要求較高，如果取材或切片制備不準(zhǔn)，容易導(dǎo)致假陰性或假陽性結(jié)果，且檢測通量低。流式細(xì)胞術(shù)可同時對1個樣本的多個參數(shù)進(jìn)行定性、定量檢測分析，既可揭示樣本中各細(xì)胞亞群的分布特征，也可進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)抗原的特征分析，只需將樣本制備成單細(xì)胞懸液，與特異性熒光標(biāo)記的抗體進(jìn)行結(jié)合，無需制備切片、依賴人工進(jìn)行顯微鏡觀察，操作簡單并能減少人為差錯，具有通量高、靈敏度高、重復(fù)性強的特點。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)在不同眼病的眼內(nèi)液細(xì)胞學(xué)檢查中的應(yīng)用

2.2.1眼內(nèi)淋巴瘤 眼內(nèi)淋巴瘤是一種罕見的致命性眼部惡性淋巴瘤，其臨床癥狀與葡萄膜炎相似，容易造成臨床誤診。Davis等[18]采用流式細(xì)胞術(shù)分析葡萄膜炎和眼內(nèi)淋巴瘤患者玻璃體液中反應(yīng)性T細(xì)胞浸潤情況，發(fā)現(xiàn)2個組患者玻璃體液中CD2、CD3、CD4、CD5和CD7等T淋巴細(xì)胞亞群水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，葡萄膜炎患者玻璃體液中T淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+比值最高，T細(xì)胞淋巴瘤患者的CD3+淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯多于葡萄膜炎患者。Missotten等[19]對流式細(xì)胞術(shù)診斷眼內(nèi)淋巴瘤的性能進(jìn)行評估，流式細(xì)胞術(shù)檢測的敏感性和特異性分別可達(dá)82.4%和100%。Maruyama等[20]利用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合細(xì)胞學(xué)、基因重排技術(shù)首次通過玻璃體液確診了1例原發(fā)性眼內(nèi)自然殺傷性T細(xì)胞淋巴瘤患者。Maruyama等[21]利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞亞群分析，發(fā)現(xiàn)與結(jié)節(jié)病性葡萄膜炎、病毒性感染、非結(jié)節(jié)病及其他不明原因引起的葡萄膜炎樣本相比，眼內(nèi)淋巴瘤患者玻璃體液中CD19+淋巴細(xì)胞含量最高。

2.2.2結(jié)節(jié)病性葡萄膜炎 結(jié)節(jié)病是一種多系統(tǒng)性慢性炎癥性疾病，以非干酪樣上皮樣肉芽腫為特征，異常激活T淋巴細(xì)胞是結(jié)節(jié)病的首要病因。流式細(xì)胞術(shù)常用于支氣管肺泡灌洗液和外周血中淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+比值分析，輔助臨床診斷結(jié)節(jié)病。Maruyama等[22]研究認(rèn)為玻璃體灌洗液在結(jié)節(jié)病診斷方面與支氣管肺泡灌洗液有同等價值。大量研究也證實眼內(nèi)液細(xì)胞亞群分析對結(jié)節(jié)病性葡萄膜炎的診療具有重要意義。Kojima等[23]采用流式細(xì)胞術(shù)對臨床診斷為眼結(jié)節(jié)病的實驗組和非眼結(jié)節(jié)病的對照組玻璃體液樣本進(jìn)行檢測分析，發(fā)現(xiàn)實驗組淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+比值明顯高于對照組，實驗組玻璃體液中CD4+/CD8+比值明顯高于外周血，玻璃體液中CD4+/CD8+比值診斷眼結(jié)節(jié)病的敏感性和特異性分別高達(dá)100%和96.3%，認(rèn)為玻璃體液淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+比值在眼結(jié)節(jié)病的診斷中具有重要價值。Sanz-Marco等[24]采用流式細(xì)胞術(shù)對3例葡萄膜炎患者和3名健康人房水中淋巴細(xì)胞CD4和CD8進(jìn)行檢測，認(rèn)為淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+比值檢測對臨床葡萄膜炎，尤其是結(jié)節(jié)病性葡萄膜炎的診斷有重要價值。Oleik等[25]利用流式細(xì)胞術(shù)確診了1例系統(tǒng)性檢查均為陰性的眼結(jié)節(jié)病患者，通過流式細(xì)胞術(shù)對房水中淋巴細(xì)胞CD4和CD8進(jìn)行計數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)CD4+/CD8+比值>9.5，符合眼結(jié)節(jié)病的診斷，說明房水中細(xì)胞分析對結(jié)節(jié)病的診斷具有重要意義。Dave等[26]利用流式細(xì)胞術(shù)比較分析了21例結(jié)節(jié)病性葡萄膜炎患者和40例非結(jié)節(jié)病性葡萄膜炎患者房水中淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+比值變化，發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)病性葡萄膜炎患者房水CD4+/CD8+比值明顯高于非結(jié)節(jié)病性葡萄膜炎患者，CD4+/CD8+比值>3.5時與結(jié)節(jié)病性葡萄膜炎具有相關(guān)性。

2.2.4感染性眼內(nèi)炎癥性疾病 不同微生物感染引起的眼內(nèi)炎癥眼內(nèi)液中浸潤的細(xì)胞類型和數(shù)量不同，故采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞亞群是輔助靶向治療感染性眼內(nèi)炎的一種有效手段。Maruyama等[21]研究發(fā)現(xiàn)單純皰疹病毒1型和水痘-帶狀皰疹病毒感染引起的急性視網(wǎng)膜壞死患者玻璃體液中含有較多的T淋巴細(xì)胞CD4和CD8。另外，該研究還發(fā)現(xiàn)細(xì)菌或真菌感染性眼內(nèi)炎中，大多數(shù)滲入玻璃體液的細(xì)胞是單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。

流式細(xì)胞術(shù)已廣泛應(yīng)用于各類眼部疾病的診療，但由于不同病因引起的眼部疾病可能存在細(xì)胞亞群重疊現(xiàn)象，比如葡萄膜炎和B細(xì)胞淋巴瘤患者眼內(nèi)液中均存在T淋巴細(xì)胞，造成分類診斷比較困難，需要結(jié)合人工細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)聯(lián)合診斷[17]。流式細(xì)胞術(shù)是目前一種先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)，具有快速、多參數(shù)、高通量和高準(zhǔn)確性等優(yōu)點，除了可以輔助臨床診療外，還可以通過標(biāo)記不同的熒光監(jiān)測、定量各類免疫細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子，研究免疫信號通路，進(jìn)一步了解免疫機制。隨著技術(shù)的優(yōu)化升級和眼科基礎(chǔ)研究的不斷深入，相信流式細(xì)胞術(shù)在眼部疾病的發(fā)病機制研究和分類診療方面將發(fā)揮日益重要的作用。

利益沖突劉銘為北京智德醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司職員，陶勇聲明不存在任何利益沖突