環(huán)狀RNA在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)及意義〔1〕

陳美紅，張曉玲

(江西省婦幼保健院，江西 南昌 330006)

子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)是婦科常見病，常出現(xiàn)慢性盆腔痛、痛經(jīng)、不孕、異常陰道流血等臨床癥狀，嚴(yán)重影響廣大婦女的生活質(zhì)量[1]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，許多新的生物信息學(xué)方法應(yīng)用于臨床疾病的生物學(xué)診斷。最近研究發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA(circRNA)在許多疾病中發(fā)揮重要作用，故本文通過高通量測序技術(shù)研究circRNA在EMs中的表達(dá)情況及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月—2018年12月我院婦科住院的子宮內(nèi)膜異位癥患者4 例為觀察組，年齡20～45 歲；同期在我院婦科門診行常規(guī)婦科檢查患者4 例為對照組，年齡20～45 歲。兩組患者月經(jīng)周期規(guī)律；術(shù)前6 個月無甾體類激素治療史。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)腹腔鏡手術(shù)及術(shù)后病理檢查診斷為子宮內(nèi)膜異位癥；患者均知情同意并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：婦科惡性腫瘤及其他部位惡性腫瘤、心腦血管等重要器官疾病；妊娠期或哺乳期。

1.2 方法

用抗凝管采集患者靜脈外周血5～10 mL，混勻，離心10 min，分離出血漿成分，分裝至凍存管，放置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。提取血漿中的RNA，并測定其濃度及純度。用總RNA文庫預(yù)試劑盒(Illumina)實(shí)現(xiàn)了構(gòu)建測序文庫的RNA預(yù)處理，使用Agilent 2100生物分析儀進(jìn)行質(zhì)量控制和量化，然后在Illumina Hi-Seq2500測序系統(tǒng)進(jìn)行測序，通過分析，得到高質(zhì)量的circRNA表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用R語言軟件包(version 3.6)對circRNA的表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化及處理，找出兩組之間circRNA表達(dá)的差異，用熱圖表示出結(jié)果，fold change≥2和P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

通過高通量測序技術(shù)，共得到363 個circRNA在觀察組及對照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中有192 個高表達(dá)的circRNA和171 個低表達(dá)的circRNA。用熱圖表示差異性circRNA的相對表達(dá)量(見圖1)。通過比較，找到6個表達(dá)顯著的差異性circRNA的相對表達(dá)量，其中低表達(dá)的circRNA有：has-circRNA-001808，has-circRNA-402533，has-circRNA-405971。高表達(dá)的circRNA：has-circRNA-000881，has-circRNA-406655，has-circRNA-023016(見圖2)。

深色代表circRNA相對高表達(dá)，淺色代表circRNA相對低表達(dá)量圖1 兩組circRNA表達(dá)熱圖

圓點(diǎn)表示在觀察組的表達(dá)量；正方形表示在對照組的表達(dá)量，***代表P<0.001，**代表P<0.01，*代表P<0.05。control為對照組；treat為觀察組圖2 6個差異性circRNA在兩組的相對表達(dá)量

3 討 論

EMs是指子宮內(nèi)膜組織(腺體和間質(zhì))異位在子宮體以外的部位，主要包括盆腔臟器和壁腹膜，如卵巢、子宮骶韌帶、腸管等部位。EMs雖是良性疾病，但具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、治療效果欠佳等特性，全球約1.76 億婦女遭遇該疾病的折磨[2]。迄今為止，EMs的病因?qū)W及發(fā)病機(jī)制尚不明確，包括經(jīng)血逆流學(xué)說、遺傳因素[3]、免疫因素[4]、炎癥[5]、類腫瘤疾病[6]等。研究表明[7]，EMs具有惡性腫瘤相似的生物學(xué)行為，如細(xì)胞侵襲、遷移、局部擴(kuò)散、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等。circRNA是1976年發(fā)現(xiàn)的一類特殊的非編碼RNA，與傳統(tǒng)的線性RNA不同，circRNA的3＇和5＇端共價結(jié)合，形成共價閉合連續(xù)環(huán)，具有組織特異性及高度保守性[8]。由于其特殊的生物結(jié)構(gòu)，核酸外切酶無法將其降解，故circRNA比多數(shù)線性RNA具有更加穩(wěn)定性的生物學(xué)功能。circRNA序列高度保守，具有組織特異性和發(fā)育階段特異性。它能作為miRNA“海綿”功能，充當(dāng)miRNA的受體，抑制miRNA活性及致miRNA靶基因水平升高，參與腫瘤細(xì)胞的調(diào)控、增殖及侵襲[9]，如肺癌[10]、胃癌[11]、胰腺癌[12]等惡性腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)差異性circRNA的表達(dá)情況。有學(xué)者[13-14]采取EMs患者在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜組織樣本進(jìn)行circRNA微陣列分析及qRT-PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)5 個circRNA (circ-0004712，circ-0002198，circ-0003570，circ-0008951和circ-0017248)和8個mRNA(SCN3B，ENTPD1，IL16，BACH2，C3，CKS2，G0S2，PGRMC1) qRT-PCR的結(jié)果與微陣列結(jié)果相符，并構(gòu)建了circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，揭示癌癥相關(guān)的主要作用嘌呤代謝、甘油磷脂代謝、甲狀腺激素信號通路在EMs發(fā)病中的作用。Zhang等[15]通過微陣列檢測正常內(nèi)膜、EMs在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜的circRNA表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)2 237個差異性circRNA，8 個circRNA可能是參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。另外Wang等[16]也通過對EMs在位內(nèi)膜組織及異位內(nèi)膜組織相比較，發(fā)現(xiàn)146個上調(diào)circRNA及148個下調(diào)circRNA，可能參與EMs的發(fā)生發(fā)展。以上研究報道均通過對患者的組織標(biāo)本進(jìn)行測序，而均未對外周血的circRNA進(jìn)行高通量測序。本文通過對EMs患者靜脈外周血進(jìn)行高通量測序，發(fā)現(xiàn)有363 個差異性表達(dá)的circRNA，其中有192 個高表達(dá)的circRNA和171 個低表達(dá)的circRNA，并找到6個表達(dá)顯著的circRNA的表達(dá)量，其中has-circRNA-001808，has-circRNA-402533及has-circRNA-405971呈現(xiàn)低表達(dá)；has-circRNA-000881，has-circRNA-406655及has-circRNA_023016呈現(xiàn)高表達(dá)。通過研究比較發(fā)現(xiàn)血液中的circRNA與組織的circRNA的表達(dá)量有些相同，具體原因有待于進(jìn)一步研究。

目前有不少對于circRNA作為RNA家族成員的研究，雖然命名了很多種circRNA，但只有少數(shù)circRNA的生物學(xué)功能及機(jī)制得到確定，大部分仍然處在研究初期。與其他類型的內(nèi)源性RNA相比，circRNA具有高度保守、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、表達(dá)量高、穩(wěn)定性強(qiáng)、與miRNA結(jié)合位點(diǎn)多等優(yōu)點(diǎn)。隨著高通量測序技術(shù)的進(jìn)步，circRNA的檢測越來越方便。circRNA可以分泌到細(xì)胞外環(huán)境，在組織、血液、體液中能檢測出circRNA。關(guān)于circRNA在EMs的病因?qū)W及發(fā)病機(jī)制研究才剛起步，僅發(fā)現(xiàn)幾種與EMs相關(guān)的circRNA，circRNA可能作為EMs的診斷標(biāo)志物，我們下一步將通過qRT-PCR驗(yàn)證circRNA高通量測序結(jié)果，并進(jìn)行生物學(xué)功能及信號通路分析，為EMs的發(fā)病機(jī)制提供一定的幫助。