豬CD150 真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在Marc-145 細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)

張 蘭，梁 婉，周丹娜，楊克禮，郭 銳，李 鵬，田永祥

（1.長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 434025；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢 430064）

淋巴細(xì)胞刺激因子CD150 是一種細(xì)胞表面受體及共刺激因子，表達(dá)于巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞及上皮細(xì)胞表面［1］。研究表明，CD150 對(duì)于宿主激活和維持天然免疫具有十分重要的作用。CD150 可以通過(guò)RIG-I、Toll 樣受體，激活NF-κB、P38-MAPK、PI3K- Akt 等多條信號(hào)通路，從而促進(jìn)IRF-3 介導(dǎo)的IFNs、TNF-α 及 多 種 白 介 素 因 子 的 分 泌［2，3］。CD150 可以刺激CD4+、CD8+T 細(xì)胞的激活、分化［4］，還與巨噬細(xì)胞、DC 細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的遷移能力有著密切關(guān)系［1］。CD150 還能隨病原進(jìn)入吞噬體內(nèi)，促進(jìn)吞噬體成熟，激活細(xì)胞自噬。因此，CD150 在激活宿主抗病毒免疫反應(yīng)的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。然而，豬CD150 的功能尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)擬克隆豬CD150 基因全長(zhǎng)，并對(duì)其進(jìn)行真核表達(dá)，為CD150在宿主與PRRSV 互作機(jī)制研究提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 載體、細(xì)胞及抗體

真核表達(dá)載體pEGFP-N1 為本實(shí)驗(yàn)室保存。非洲綠猴腎傳代細(xì)胞系Marc-145 購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，在本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行凍存、復(fù)蘇及使用。CD150 一抗、HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑

DL 2000 Marker、DL 5000 Marker、限制性內(nèi)切酶、質(zhì)粒小提試劑盒、DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、核酸提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、PCR 高保真酶、DNA 連接酶、去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒、ECL 發(fā)光顯色液等，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；蛋白質(zhì)Marker、脫脂奶粉、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒，購(gòu)自上海碧云天公司；FBS、DMEM、Opti-MEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶，購(gòu)自Gbico公司；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Invitrogen 公司。

1.3 主要儀器

倒置熒光顯微鏡，奧林巴斯公司；PCR 擴(kuò)增儀、紫外凝膠成像系統(tǒng)，BioRad 公司；電泳儀，六一儀器廠；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，Thermo 公司；5810R 低溫離心機(jī)，Eppendorf公司。

1.4 方法

1.4.1 CD150 基因的克隆 基于GenBank 發(fā)表的豬源CD150 基因和pEGFP-N1 載體序列設(shè)計(jì)CD150 真核表達(dá)引物。引物序列為5'-CCGCTCGAGGCCAC CATGCATAAACTAGACAGTAGAGGCA-3'（酶切位點(diǎn)XhoI）和5'-CCAAGCTTGCTCTCCGGAAGAGTCA CG-3'（酶切位點(diǎn)Hind III），由擎科生物股份有限公司合成引物。

按照RNA 提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書提取豬的基因組，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，置-80 ℃冰箱保存，備用。以豬的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系（總體積為50 μL）：2×Phanta Max Master Mix 25 μL，上下游引物各2.5 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 18 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃3 min，95 ℃15 s，55 ℃15 s，72 ℃5 min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min，16 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并通過(guò)切膠回收大小正確的片段。

1.4.2 真核重組表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定 用限制性內(nèi)切酶對(duì)真核表達(dá)載體pEGFP-N1 和CD150 基因片段分別酶切并回收后，按照說(shuō)明書進(jìn)行DNA 片段連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，挑取大小、形態(tài)合適的單菌落搖菌并小量提取質(zhì)粒，送擎科生物股份有限公司測(cè)序。

1.4.3 真核重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Marc-145 細(xì)胞 按照說(shuō)明書提取去內(nèi)毒素的質(zhì)粒，待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將2 μg重組質(zhì)粒加入100 μL Opti-MEM 培養(yǎng)基；將4 μL 轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 加入Opti-MEM 培養(yǎng)基；室溫靜置5 min 后，將兩者混合，繼續(xù)室溫孵育20 min。取出鋪好Marc-145 細(xì)胞的6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，PBS 輕柔洗滌細(xì)胞2 次，將轉(zhuǎn)染試劑混合物加入細(xì)胞中，置CO2培養(yǎng)箱中37 ℃靜置培養(yǎng)4～6 h，換成含2%胎牛血清的DMEM維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12～24 h 后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4.4 Western-blot 鑒定 PBS 洗滌細(xì)胞3 次后，加入200 μL 細(xì)胞裂解液，充分吹打裂解后收集裂解液，12 000 r/min 離心20 min；取40 μL 上清液，加入10 μL 上樣緩沖液，充分混勻后煮沸10 min；冰上靜置20 min 后將樣品點(diǎn)入制備的SDS 蛋白凝膠中電泳分離目標(biāo)蛋白；采用半干轉(zhuǎn)的方式進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用TBST 清洗PVDF 膜3 次，5 min/次，然后將PVDF 膜放入用TBST 稀釋的5%脫脂奶粉中，4 ℃封閉過(guò)夜；封閉結(jié)束后將PVDF 膜再次清洗3次，然后將膜放入提前用1%脫脂奶粉以1∶5 000 比例稀釋的CD150 一抗中，室溫孵育2 h；TBST 清洗3次，10 min/次；加入1∶5 000 稀釋的HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 二抗；室溫孵育1.5 h；TBST 清洗3 次，10 min/次；ECL 試劑盒顯色1 min 后采集成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 CD150 基因的克隆

PCR 擴(kuò)增的CD150 基因片段經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在1 033 bp 處出現(xiàn)明亮條帶（圖1），與預(yù)期大小相符。

圖1 CD150 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.2 真核重組表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

利用雙酶切對(duì)挑取的單菌落質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，瓊脂糖凝膠電泳顯示出現(xiàn)了與預(yù)期大小的兩條條帶（圖2），表明CD150 已連接到pEGFP-N1 載體上。將鑒定正確的陽(yáng)性質(zhì)粒送測(cè)，并將測(cè)序結(jié)果與NCBI公布的豬基因組序列進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示克隆到的CD150 基因與目的片段比對(duì)結(jié)果為100%（圖3）。

圖2 pEGFP-N1-CD150 質(zhì)粒酶切產(chǎn)物電泳

圖3 pEGFP-N1-CD150 測(cè)序結(jié)果比對(duì)

2.3 真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Marc-145 細(xì)胞

利用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pEGFPN1-CD150 和空載體pEGFP-N1 分別轉(zhuǎn)染至Marc-145 細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)24 h 后，在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況。結(jié)果表明，pEGFP-N1-CD150 和pEGFP-N1 轉(zhuǎn)染后均可顯示強(qiáng)烈綠色熒光（圖4），提示pEGFP-N1-CD150 已成功表達(dá)。

2.4 Western-blot 鑒定CD150 和EGFP 融合表達(dá)情況

裂解收集轉(zhuǎn)染后24 h 的細(xì)胞總蛋白，利用Western-blot 檢測(cè)EGFP 蛋白和CD150 蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1 后，僅可見(jiàn)大小約為29 kDa 的蛋白條帶（圖5），與預(yù)期EGFP 蛋白大小相符；轉(zhuǎn)染1～3 μg 的pEGFP-N1-CD150 后，均可見(jiàn)大小約80 kDa 的蛋白條帶（圖6），蛋白大小與預(yù)期的EGFP-CD150 融合蛋白大小相符，隨轉(zhuǎn)染量的增加而表達(dá)量逐漸變多，表明pEGFP-N1-CD150 融合表達(dá)成功。

圖5 pEGFP-N1 Western-blot 結(jié)果

3 小結(jié)與討論

研究表明，CD150 對(duì)于激活和維持機(jī)體天然免疫具有十分重要的作用。一方面，CD150 通過(guò)胞質(zhì)區(qū)的免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序（Immunoreceptor ty?rosine-based switch motifs，ITSM）與受體蛋白形成二元復(fù)合體，通過(guò)受體蛋白與下游信號(hào)分子的結(jié)合，形成三元復(fù)合體來(lái)激活免疫應(yīng)答［5］。利用復(fù)合體中的受體蛋白，CD150 可激活RIG-I、Toll 樣受體，增強(qiáng)NF-κB、P38 MAPK、Akt、PI3K 等多條信號(hào)通路，從而促進(jìn)IRF-3 介導(dǎo)的IFNs、TNF-α 及多種白介素因子的分泌［5］。當(dāng)病原侵入機(jī)體時(shí)，巨噬細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞通過(guò)肌動(dòng)蛋白重排形成吞噬體囊泡將病原包裹內(nèi)吞，初級(jí)吞噬體囊泡成熟后與溶酶體融合形成吞噬溶酶體，及時(shí)殺滅及降解病原［6］。

CD150 基因已被報(bào)道在其他物種的天然免疫中具有十分重要的作用，本研究成功構(gòu)建了CD150 的真核表達(dá)載體，通過(guò)Western-blot、觀察轉(zhuǎn)染后的熒光鑒定了融合表達(dá)的效果。本研究試驗(yàn)結(jié)果主要是pEGFP-N1-CD150 真核表達(dá)載體的共構(gòu)建，研究結(jié)果為探索豬CD150 的功能提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。