硫酸-香草醛法測定地黃總環(huán)烯醚萜苷含量

孫 鵬，馬軍政，，段晨晨，，付娜娜，，黃 勇，李先恩

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，鄭州 450002）

地黃（Rehmannia glutinosa）為玄參科植物，著名的四大懷藥之一，具有清熱養(yǎng)血、養(yǎng)陰生津等功效［1］。地黃種質(zhì)資源豐富，在中國華中、華北、西北、東北等地均有分布，在主產(chǎn)區(qū)有大量的栽培品種。目前科研工作者圍繞地黃遺傳多樣性和分子標(biāo)記開發(fā)［2-6］、表觀性狀［7-9］、連作抗性［10，11］對(duì)地黃種質(zhì)資源評(píng)價(jià)和分析進(jìn)行了大量的工作，對(duì)不同品種中地黃指標(biāo)性成分梓醇和毛蕊花糖苷的含量差異［3，12-14］也進(jìn)行了研究。劉炯等［15］建立了HPLC 同時(shí)測定地黃中地黃苷A、D 含量的方法，發(fā)現(xiàn)不同品種和產(chǎn)地地黃中地黃苷含量差別較大；謝彩俠等［16］建立了HPLC 測定懷地黃中桃葉珊瑚苷含量的方法，發(fā)現(xiàn)不同品種、不同產(chǎn)地懷地黃中桃葉珊瑚苷含量不同，但目前不同種質(zhì)中總環(huán)烯醚萜苷含量的研究鮮見報(bào)道。

環(huán)烯醚萜苷類是地黃中的重要活性成分，除梓醇外還發(fā)現(xiàn)50 余種環(huán)烯醚萜類成分，具有廣泛的生物活性，是地黃發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)［17］。環(huán)烯醚萜苷含量的高低，一定程度上反映出藥材質(zhì)量的好壞。研究表明地黃葉片中也含有大量的環(huán)烯醚萜苷［18，19］，地黃葉片中環(huán)烯醚萜苷的研究與開發(fā)利用值得關(guān)注。目前關(guān)于地黃中總環(huán)烯醚萜苷含量測定方法有二硝基苯肼法［20］和紫外吸收分光光度法［21］?？紤]到紫外分光光度法沒有特異反應(yīng)、誤差來源較多，而二硝基苯肼法在試驗(yàn)穩(wěn)定性上有待改進(jìn)，本試驗(yàn)建立了一種地黃中總環(huán)烯醚萜苷含量的檢測方法，并對(duì)7 份地黃種質(zhì)的根、葉中總環(huán)烯醚萜苷的含量進(jìn)行了測定，以便為地黃種質(zhì)資源的優(yōu)選和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

梓醇對(duì)照品，青海央宗藥業(yè)有限公司；香草醛，生工生物工程（上海）有限公司；硫酸、無水乙醇，北京化工廠。

所用樣品來源為栽培地黃85-5、北京1 號(hào)和5份野生地黃種質(zhì)SX、TS、BWS、NY、YMY，種植于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所試驗(yàn)地，由李先恩研究員鑒定為玄參科地黃屬植物地黃。

1.2 儀器

UV-752N 紫外-可見分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司；萬分之一天平，梅特勒-托利多集團(tuán)；超聲波清洗機(jī)TP300，天鵬電子新技術(shù)背景有限公司；SIGMA 3K-15 離心機(jī)，德國SIGMA 公司。

1.3 方法

1.3.1 對(duì)照品、供試品溶液的配置 精密稱取梓醇對(duì)照品10 mg 于10 mL 容量瓶中，加70%乙醇至刻度，混勻，即為1 mg/mL 的對(duì)照品溶液Ⅰ。取1 mL 對(duì)照品溶液Ⅰ于10 mL 容量瓶中，加70%乙醇至刻度，即混勻?yàn)閷?duì)照品溶液Ⅱ。稱取在液氮中磨碎的地黃組織粉末0.5 g 于10 mL 離心管中，加入70%乙醇5 mL，密封，超聲1 h，10 000 r/min 離心10 min，取上清液過濾，準(zhǔn)確吸取1 mL 濾液于10 mL 容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，混勻作為供試品溶液。

1.3.2 顯色方法 在Martínez-bonfil 等［22］方法的基礎(chǔ)上，對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化：每90 mL 反應(yīng)液中包括82 mL 去離子水、8 mL 濃硫酸、27 mg 香草醛，制備顯色反應(yīng)液。分別精密量取對(duì)照品溶液Ⅱ、1 mL 于10 mL 具塞試管中，分別加入9 mL 硫酸-香草醛溶液，混勻，80 ℃水浴反應(yīng)4.5 h，取出冷卻至室溫，以空白試劑為參比，在510 nm 處測定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 測定吸收波長的選擇

按照試驗(yàn)方法“1.3.2”在400～700 nm 對(duì)供試品溶液和對(duì)照品溶液進(jìn)行掃描。結(jié)果表明，供試品溶液和對(duì)照品溶液在510 nm 處都有最大吸收且波形相似，無雜峰干擾，因此，將510 nm 作為測定吸收波長。

2.2 顯色溫度和時(shí)間的選擇

按照試驗(yàn)方法于20、40、60、80 ℃水浴下進(jìn)行顯色反應(yīng)，分別反應(yīng)0.5～5.0 h（間隔為0.5 h）后取出冷卻至室溫，測定吸光度。結(jié)果表明，在60 ℃以下梓醇水解-顯色反應(yīng)較慢，在80 ℃顯色4.5～5.0 h 對(duì)吸光度影響極小，因此，確定反應(yīng)溫度為80 ℃、顯色反應(yīng)時(shí)間4.5 h。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密吸取對(duì)照品溶液Ⅰ0.1、0.7、1.3、1.9、2.5 mL 于10 mL 容量瓶中，分別加70%乙醇定容至刻度，各取1 mL 按照試驗(yàn)方法“1.3.2”測定吸光度，分別為0.008、0.079、0.153、0.224、0.293。以對(duì)照品梓醇含量（ρ，mg/mL），表明梓醇含量在0.01～0.25 mg/mL 線性關(guān)系良好，回歸方程為A=1.191 7ρ-0.003 5，R2=0.999 9。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液Ⅱ，按照試驗(yàn)方法“1.3.2”顯色后，每隔0.5 h 測吸光度，其吸光度分別為0.115、0.115、0.115、0.115、0.116、0.115，平均值為0.115 1，RSD 為0.35%（n=6），說明顯色后顯色液在1.0～3.5 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取地黃組織粉末6 份，按試驗(yàn)方法制成供試品溶液并進(jìn)行顯色，測定結(jié)果平均含量為1.00%，RSD 為7.0%，說明該法重復(fù)性良好。

2.6 回收率與精密度試驗(yàn)

精密稱取已知含量的地黃組織粉末6 份，每份0.05 g，分別精密加入梓醇對(duì)照品0.5 mg，按照試驗(yàn)方法“1.3.2”測得樣品回收率分別為101.31%、102.00%、101.03%、101.32%、97.48%、100.75%，平均回收率為100.65%，RSD 為1.61%（n=6），說明該法測定結(jié)果可靠。

取地黃總環(huán)烯醚萜苷提取液1 mL，按照試驗(yàn)方法“1.3.2”顯色后1 h 內(nèi)連續(xù)測定6 次吸光度，其吸光度分 別為0.115、0.115、0.115、0.115、0.115、0.115，RSD 為0（n=6），說明儀器精密度良好。

2.7 樣品分析

按照試驗(yàn)方法對(duì)7 份地黃種質(zhì)的根、葉片中總環(huán)烯醚萜苷含量進(jìn)行測定，檢測結(jié)果見圖1。由圖1可知，雖然地黃的藥用部位為根部，但不同種質(zhì)地黃葉片中總環(huán)烯醚萜苷含量普遍高于根中的含量，其中野生種質(zhì)又普遍高于栽培品種，尤其是SX 種質(zhì)葉片中的總環(huán)烯醚萜苷含量顯著高于其他種質(zhì)。

圖1 不同種質(zhì)地黃中根與葉的總環(huán)烯醚萜苷含量

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了硫酸-香草醛分光光度法測定地黃中總環(huán)烯醚萜苷含量，該方法重復(fù)性好，精密度、準(zhǔn)確度高，為地黃的種質(zhì)資源評(píng)價(jià)提供了方法學(xué)基礎(chǔ)。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同種質(zhì)的葉片中總環(huán)烯醚萜苷含量普遍高于根中的含量，野生地黃葉片中的總環(huán)烯醚萜苷含量更為突出，可開發(fā)利用。