西格列汀通過(guò)阻斷核因子-κB信號(hào)通路抑制脂多糖誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細(xì)胞炎癥反應(yīng)

劉相 康文燕 商玲玲 葛少華

山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院牙周科山東省口腔組織再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室山東省口腔生物材料與組織再生工程實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南250012

牙周炎是一種由微生物、宿主免疫反應(yīng)、環(huán)境和遺傳危險(xiǎn)因素等多因素共同作用引起的慢性炎癥性破壞性疾病[1]，造成宿主牙周附著喪失、牙槽骨吸收，最終導(dǎo)致牙齒松動(dòng)脫落[2]。目前的研究表明，菌斑生物膜是牙周炎的始動(dòng)因素，但生物膜與宿主炎癥免疫反應(yīng)之間的相互作用是牙周組織破壞的主要原因[3]，牙周致病菌攻擊宿主并激活免疫系統(tǒng)，誘發(fā)宿主慢性炎癥反應(yīng)，進(jìn)而損傷牙周組織[4]。牙齦卟啉單胞菌是一種重要的牙周致病菌，作為經(jīng)典的紅色復(fù)合體成員與慢性牙周炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是牙齦卟啉單胞菌細(xì)胞壁的主要構(gòu)成成分，是一種重要的微生物毒力因子，可以引起宿主免疫反應(yīng)，促使牙周組織破壞[6]。

牙齦炎癥反應(yīng)是牙周炎的最初表現(xiàn)[7]，人牙齦成纖維細(xì)胞（human gingival fibroblast，HGF）是牙齦結(jié)締組織中最豐富的細(xì)胞，可直接與細(xì)菌和細(xì)菌產(chǎn)物相互作用，在牙周炎進(jìn)展中起重要作用[8]。盡管HGF 不屬于天然的炎性細(xì)胞范疇，但它們可以提供信號(hào)來(lái)吸引和調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)并清除必要部位的感染，還可以確保在初始炎癥解決后繼續(xù)清除浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞，成纖維細(xì)胞功能失調(diào)可能會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的時(shí)間延長(zhǎng)，因此，HGF 在保護(hù)牙周組織免受外源性刺激方面發(fā)揮極其重要的作用[9-12]。LPS 刺激可誘導(dǎo)HGF 免疫反應(yīng)并激活與炎癥基因的調(diào)節(jié)密切相關(guān)的核因子（nu‐clear factor，NF）-κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在牙周結(jié)締組織中誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素（interleu‐kin，IL）-1、IL-6、IL-8 等的產(chǎn)生[8,13]。此外，在牙周炎反應(yīng)過(guò)程中還觀察到超氧化物歧化酶2（su‐peroxide dismutase 2，SOD2）和趨化因子配體2（C-C motif ligand 2，CCL2）的上調(diào)[14-15]，從而形成牙周組織破壞的微環(huán)境。

西格列汀是一種新型的降糖藥物，于2006 年獲得美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)而上市，可單獨(dú)使用或與其他藥物聯(lián)合使用來(lái)治療2 型糖尿病[16]。西格列汀除了具有顯著的降糖作用，還具有抗炎[17]、抗腫瘤[18]、腎臟保護(hù)[19]、心血管保護(hù)[20]和促組織再生[21]等多種生物活性和藥理作用。西格列汀的抗炎作用已有相關(guān)報(bào)道，可顯著降低2型糖尿病患者的促炎細(xì)胞因子如C 反應(yīng)蛋白和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α，同時(shí)增加抗炎細(xì)胞因子IL-10 的表達(dá)[17]。此外，西格列汀也可通過(guò)抑制NF-κB的活性，在RINm細(xì)胞系中發(fā)揮抗炎作用[22]。然而，西格列汀對(duì)HGF 的免疫炎癥反應(yīng)未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本研究的主要目的是初步探討西格列汀對(duì)LPS 誘導(dǎo)的HGF 炎癥反應(yīng)的影響，并進(jìn)一步闡明其潛在的分子學(xué)作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用西格列汀防治牙周炎提供基礎(chǔ)性理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑與材料

改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Ea‐gle medium，DMEM）、磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）（Hyclone 公司，美國(guó)）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，BioInd 公司，以色列）；青-鏈霉素混合液（100 U·mL-1青霉素，100 mg·mL-1鏈霉素），Ⅰ型膠原酶、分散酶Ⅱ、西格列汀（Sigma Aldrich 公司，美國(guó)）；0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）溶液、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒、含吐溫的三羥甲基氨基甲烷緩沖液（tris-buffered saline Tween，TBST）緩沖液、放射免疫沉淀測(cè)定（radio immu‐noprecipitation assay，RIPA）細(xì)胞裂解液、苯甲基磺 酰 氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）蛋白酶抑制劑（北京市索萊寶生物科技有限公司）；磷酸酶抑制劑（武漢市博士德生物工程有限公司）；TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantity real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒（Takara公司，日本）；IL-6、IL-8、CCL2 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)試劑盒（Biolegend 公司，美國(guó)）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cellcounting kit，CCK）-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒（Dojin‐do公司，日本）；牙齦卟啉單胞菌LPS（InvivoGen公司，美國(guó)）；NF-κB 抑制劑BAY11-7082（Abcam公司，英國(guó)）；兔抗人3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyc‐eraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、兔抗人波形絲蛋白抗體、兔抗人角蛋白17 抗體、熒光標(biāo)記山羊抗兔二抗、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗（Proteintech公司，美國(guó)）；兔抗人NFκB p65、p-p65、p-IκBα，鼠抗人IκBα 一抗（Cell Signaling Technology 公司，美國(guó)）；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）液、聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（Milli‐pore公司，美國(guó)）。

1.2 主要儀器

二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（Thermo 公司，美國(guó)），倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)（OLYMPUS公司，日本），羅氏480Ⅱ型qRT-PCR 儀（Roche 公司，瑞士），SPECTRO star Nano 酶標(biāo)儀（BMG Labtech公司，德國(guó)），Amersham Imager 600凝膠成像系統(tǒng)（GE Healthcare Life Sciences公司，美國(guó)）。

1.3 方法

1.3.1 分離與培養(yǎng)HGF 從2018 年12 月至2019 年4 月在山東大學(xué)口腔醫(yī)院頜面外科招募6 名需拔除埋伏阻生齒的健康志愿者（16～20 歲，3 名男性和3 名女性；平均年齡18 歲），收集其術(shù)中切除的少量牙齦組織。該項(xiàng)目根據(jù)2013 年修訂的1975 年赫爾辛基宣言的指導(dǎo)原則，將研究項(xiàng)目告知所有志愿者，并簽署知情同意書(shū)。本研究方案已獲得山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（協(xié)議編號(hào)：GR201801）。

將分離出的牙齦組織直接浸入含有5%抗生素（100 U·mL-1青霉素、100 mg·mL-1鏈霉素）的預(yù)冷DMEM 培養(yǎng)液中，迅速轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將牙齦組織轉(zhuǎn)移到無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用含5%抗生素的PBS 沖洗4 次，去除上皮后將結(jié)締組織剪成約1～3 mm2的碎片，將剪碎的牙齦組織轉(zhuǎn)移到含3 mg·mL-1Ⅰ型膠原酶和4 mg·mL-1分散酶Ⅱ的無(wú)菌EP 管內(nèi)，將EP 管置于37 ℃水浴鍋中消化組織2 h，每隔10 min 進(jìn)行搖晃，促使其消化完全。消化完成后，加入含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液中和消化液，1 000 r·min-1離心5 min后，棄上清，利用含20%FBS 的DMEM 重懸細(xì)胞，將單細(xì)胞接種到T25 培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育，當(dāng)HGF 達(dá)到80%～90%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-EDTA 傳代，傳代的HGF 以1∶3 的稀釋比在不含抗生素的10%FBS DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。選取第3～5代的HGF用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 HGF的鑒定 將培養(yǎng)的第3代HGF以每孔4×104個(gè)的密度均勻接種于24 孔板內(nèi)，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱里孵育24 h 使細(xì)胞完全貼壁。用4%多聚甲醛液固定細(xì)胞30 min 后預(yù)冷PBS 沖洗3 遍，0.1%Triton X-100室溫下破膜15 min，加入含1%BSA的PBS 液體封閉30 min。棄去封閉液，分別孵育稀釋的波形絲蛋白一抗（1∶300）和角蛋白17 一抗（1∶300）4 ℃孵育過(guò)夜。棄染液，滴入含熒光的二抗（1∶500）孵育1 h，利用DAPI染核5 min，在暗室中的熒光顯微鏡下觀察，拍照。

1.3.3 CCK8 檢測(cè)細(xì)胞活性 將HGF 以每孔5 000個(gè)的密度接種于96 孔板中，將培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜。將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為含0、0.1、0.25、0.5、5、10、100、200、500 和1 000 μmol·L-1西格列汀的新鮮培養(yǎng)基，與HGF 作用24、48 h 后，進(jìn)行CCK-8 檢測(cè)。同時(shí)檢測(cè) 西 格 列 ?。?.1、0.25、0.5 μmol·L-1） 與LPS（5 μg·mL-1）[23]共同作用24 h、48 h 對(duì)HGF 活性的影響。各組培養(yǎng)結(jié)束后，棄去原有培養(yǎng)基，PBS沖洗2次，每孔加入含10%CCK8的100μL DMEM培養(yǎng)基。將培養(yǎng)板置于37 ℃恒溫孵育箱內(nèi)孵育2.5 h，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 將HGF 以每孔2.5×105個(gè)的密度接種于6 孔板中，實(shí)驗(yàn)分為5 組檢測(cè)不同濃度西格列汀對(duì)炎癥因子的影響，即空白對(duì)照組、LPS組、LPS+0.1μmol·L-1西格列?。↙PS+0.1）組、LPS+0.25μmol·L-1西格列汀（LPS+0.25）組、LPS+0.5μmol·L-1西格列汀（LPS+0.5）組，同時(shí)分別于12 和24 h 后收集培養(yǎng)上清液用于后續(xù)檢測(cè)。為了進(jìn)一步證實(shí)西格列汀通過(guò)NF-κB 通路抑制炎癥因子 的 表 達(dá)，加 入5 μmol·L-1NF-κB 通 路 抑 制 劑BAY11-7082驗(yàn)證通路，分為4 組：1）對(duì)照組：常規(guī)培養(yǎng)，不做處理；2）LPS 組：加入5 μg·mL-1LPS；3）LPS+西格列汀組：加入0.5μmol·L-1西格列汀和5μg·mL-1LPS；4）LPS+NF-κB抑制劑BAY11-7082 組：加入5 μmol·L-1BAY11-7082 和5 μg·mL-1LPS，加藥培養(yǎng)24 h。使用TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，Nanodrop 超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 含量后，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)以1 000 ng 總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用qRT-PCR 試劑盒和羅氏480Ⅱ型qRT-PCR 儀檢測(cè)IL-6、IL-8、SOD2 和CCL2 的mRNA 水平。以GAPDH 為管家基因，通過(guò)計(jì)算ΔCt（目的基因Ct-管家基因平均Ct），目標(biāo)基因的表達(dá)水平表示為2-(ΔCt)。引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件為95 ℃持續(xù)30 s 激活熱啟動(dòng)酶，然后將cDNA 擴(kuò)增45 個(gè)循環(huán)，包括在95 ℃變性5 s 和60 ℃延伸30 s。

表1 qRT-PCR引物序列Tab 1 Primer sequences for qRT-PCR

1.3.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 1.3.4 所述的培養(yǎng)上清液用于檢測(cè)IL-6、IL-8 和CCL2 的蛋白濃度。將收集的培養(yǎng)上清液于4 ℃、12 000 r·min-1高速離心機(jī)內(nèi)離心5 min 去除細(xì)菌和死細(xì)胞沉淀后收集上清液，根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm 波長(zhǎng)的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6、IL-8和CCL2的蛋白含量。

1.3.6 蛋白提取及蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn) 將HGF以每孔2.5×105個(gè)的密度接種于6 孔板中，于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育過(guò)夜，待細(xì)胞貼壁后根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究利用NF-κB 信號(hào)通路抑制劑BAY11-7082 作為陽(yáng)性對(duì)照，研究0.5μmol·L-1西格列汀對(duì)LPS 誘導(dǎo)的HGF 中NF-κB 信號(hào)通路變化的影響。本實(shí)驗(yàn)分為4 組。1）對(duì)照組：常規(guī)培養(yǎng)，不做處理；2）LPS 組：加入5 μg·mL-1LPS；3）LPS+西格列汀組：加入0.5 μmol·L-1西格列汀和5 μg·mL-1LPS；4）LPS+NF-κB 抑制劑BAY11-7082 組：加入5 μmol·L-1BAY11-7082 和5 μg·mL-1LPS。37 ℃條件下LPS 誘導(dǎo)2 h，待各組處理結(jié)束后棄掉原培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，向各孔內(nèi)加入含有1%蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液，將培養(yǎng)板置于冰上裂解30 min。使用細(xì)胞刮刀收集蛋白于離心管內(nèi)，超聲裂解后于4 ℃、12 000 r·min-1離心5 min，收集上清液并轉(zhuǎn)移到新的離心管。使用BCA 蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定各組蛋白濃度，向每組加入蛋白上樣緩沖液后，于100 ℃條件下煮沸5 min 進(jìn)行蛋白變性。經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。室溫下將膜用5%脫脂奶粉封閉1 h，然后與以下一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜：NF-κB p65，p-p65，IκBα，p-IκBα（1∶1 000）；GAPDH （1∶10 000）。次日，用TBST 洗滌3 次，辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的抗兔和抗小鼠二抗（1∶10 000）在室溫下孵育1 h，TBST洗滌3次。ECL發(fā)光液顯影，并使用超靈敏成像儀進(jìn)行掃描。使用Image J 1.44 軟件來(lái)定量蛋白質(zhì)表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad Prism 6 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有計(jì)量資料統(tǒng)計(jì)結(jié)果以Mean±SD 表示，用單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HGF的分離和培養(yǎng)

原代培養(yǎng)的HGF生長(zhǎng)7 d后，倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng)，呈旋渦狀、放射狀排列（圖1A），細(xì)胞傳代到第4 代后，貼壁良好，生長(zhǎng)旺盛，形態(tài)均一，細(xì)胞呈星形或長(zhǎng)梭形，胞核呈圓形或卵圓形（圖1B、C）。

2.2 HGF的鑒定

細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)的結(jié)果顯示：在體外培養(yǎng)的HGF 中，細(xì)胞波形絲蛋白染色呈陽(yáng)性（圖2 中上），綠色熒光均勻分布在細(xì)胞漿內(nèi)，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光；細(xì)胞角蛋白17 染色呈陰性（圖2 中下），僅見(jiàn)細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，說(shuō)明細(xì)胞來(lái)源于中胚層組織，無(wú)上皮組織來(lái)源細(xì)胞混雜。

2.3 西格列汀和LPS對(duì)HGF活性的影響

CCK8 結(jié)果表明，低濃度的西格列?。?.1、0.25 和0.5 μmol·L-1） 作 用 于HGF 24、48 h，對(duì)HGF 的增殖沒(méi)有明顯影響（P＞0.05，圖3A、B）。與對(duì)照組相比，高濃度西格列?。?～1 000μmol·L-1）顯著地抑制細(xì)胞增殖（P＜0.001，圖3A、B）。結(jié)果表明：5 μg·mL-1LPS 單獨(dú)作用或與0.1、0.25 和0.5μmol·L-1西格列汀共同作用于HGF 24、48 h，對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響（P＞0.05，圖4A、B）?；诒静糠謱?shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究選取對(duì)HGF 無(wú)明顯毒性作用的低濃度西格列汀（0.1、0.25和0.5μmol·L-1）與5μg·mL-1LPS進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 分離和培養(yǎng)HGFFig 1 Isolation and culture of HGFs

圖2 HGF的鑒定 熒光顯微鏡 ×400Fig 2 Identification of HGFs fluorescence microscope ×400

圖3 不同濃度西格列汀對(duì)HGF活性的影響Fig 3 Effects of sitagliptin at different concentrations on HGFs viability

圖4 不同濃度西格列汀和5μg·mL-1 LPS共同作用對(duì)HGF活性的影響Fig 4 Effects of sitagliptin at different concentrations and 5μg·mL-1 LPS on the viability of HGFs

2.4 西格列汀對(duì)LPS 誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響

為了研究西格列汀對(duì)LPS 誘導(dǎo)的HGF 炎癥反應(yīng)的影響，本研究通過(guò)qRT-PCR 檢測(cè)了西格列汀與LPS 共同作用12 h、24 h 后細(xì)胞內(nèi)CCL2、IL-6、IL-8和SOD2的基因表達(dá)水平。結(jié)果表明，相比于對(duì)照組，LPS顯著上調(diào)了HGF中CCL2、IL-6、IL-8、SOD2 的基因表達(dá)水平（P＜0.000 1，圖5），且24 h 較12 h 上調(diào)更為明顯。西格列汀劑量依賴性地抑制LPS 上調(diào)的CCL2（P＜0.001，圖5A）、IL-6（P＜0.01，圖5B）、IL-8（P＜0.01，圖5C）和SOD2（P＜0.05，圖5D）的表達(dá)。西格列汀對(duì)CCL2、IL-6與IL-8的基因表達(dá)水平的影響在12 h和24 h呈現(xiàn)一致變化，而西格列汀抑制SOD2 的作用效果在24 h 較12 h 更為明顯，0.1 μmol·L-1西格列汀作用于HGF 12 h 對(duì)SOD2 的基因表達(dá)水平無(wú)明顯影響（P＞0.05，圖5D）。

圖5 西格列汀對(duì)LPS誘導(dǎo)的HGF炎癥細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的影響Fig 5 Effects of sitagliptin on the mRNA expression levels of LPS-induced HGFs inflammatory cytokines

2.5 西格列汀對(duì)LPS 誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子蛋白表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組相比，HGF 經(jīng)LPS 刺激12 h 和24 h，培養(yǎng)上清液中的CCL2、IL-6、IL-8 蛋白表達(dá)量呈不同程度升高，且24 h 較12 h 升高更為明顯。西格列汀與LPS 共同作用于HGFs 12 h 和24 h 后，與單獨(dú)使用LPS 組相比，0.1、0.25 和0.5 μmol·L-1的西格列汀均顯著性地降低了炎性細(xì)胞因子CCL2的蛋白表達(dá)水平（P＜0.001，圖6A）；對(duì)于IL-6，西格列汀與LPS 共同作用于HGF 12 h，0.1、0.25 和0.5 μmol·L-1的西格列汀可明顯降低其表達(dá)（P＜0.000 1），而在作用24 h 時(shí)，低濃度的西格列?。?.1μmol·L-1）對(duì)LPS 誘導(dǎo)的IL-6 蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯的抑制作用（P＞0.05），而高濃度的西格列?。?.25 μmol·L-1和0.5 μmol·L-1）則顯著性地抑制了LPS 誘導(dǎo)的IL-6 分泌（P＜0.05，圖6B）；對(duì)于IL-8的表達(dá)，西格列汀與LPS 共同作用于HGF 12 h 與24 h，0.25、0.5μmol·L-1西格列汀均可顯著性地降低LPS 誘導(dǎo)的IL-8 表達(dá)（P＜0.01），而0.1μmol·L-1的西格列汀作用24 h 可以顯著降低LPS 誘導(dǎo)的IL-8 表達(dá)（P＜0.01），作用12 h 則對(duì)IL-8 蛋白的分泌無(wú)明顯影響（P＞0.05，圖6C）。

圖6 西格列汀對(duì)LPS誘導(dǎo)的HGF炎癥細(xì)胞因子蛋白表達(dá)水平的影響Fig 6 Effects of sitagliptin on the protein expression levels of LPS-induced HGFs inflammatory cytokines

2.6 西格列汀對(duì)LPS 誘導(dǎo)的HGF 中NF-κB 信號(hào)通路的影響

蛋白免疫印跡檢測(cè)結(jié)果表明，LPS 刺激HGF 2 h可通過(guò)促進(jìn)IκBα降解（P＜0.000 1）以及增加pp65 和p-IκBα 蛋白表達(dá)水平（P＜0.000 1），來(lái)激活NF-κB 信號(hào)通路，而在0.5 μmol·L-1西格列汀和5μmol·L-1BAY11-7082處理組，LPS的作用則明顯減弱（圖7）。qRT-PCR 分析結(jié)果表明，同正常對(duì)照組比較，LPS 組的CCL2、IL-6、IL-8、SOD2 的基因表達(dá)含量明顯增加（P＜0.000 1，圖8），而同LPS 組相比，0.5 μmol·L-1西格列汀抑制LPS 上調(diào)的CCL2（P＜0.001，圖8A）、IL-6（P＜0.001，圖8B）、IL-8（P＜0.001，圖8C）和SOD2（P＜0.000 1，圖8D）的表達(dá)，5 μmol·L-1BAY11-7082 組CCL2、IL-6、IL-8 和SOD2 含量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1，圖8）。

3 討論

牙周炎是一種炎性免疫破壞性疾病，主要表現(xiàn)為起初的牙齦組織慢性炎癥，隨后伴發(fā)牙周袋形成、牙槽骨骨破壞及牙齒松動(dòng)脫落，慢性牙周炎已經(jīng)成為成年人牙齒缺失的主要原因[7]。牙齦卟啉單胞菌、伴放線聚集桿菌等牙周致病菌能通過(guò)產(chǎn)生多種致病物質(zhì)及代謝產(chǎn)物如LPS、丁酸、牙齦素等作用于牙周支持組織并誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生過(guò)多的促炎細(xì)胞因子和趨化因子如IL-1、IL-6、TNF-α 等，形成炎癥微環(huán)境，最終破壞牙周組織[9,11,24-25]。先前的研究[26]證實(shí)，控制過(guò)量炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生是治療牙周病的有效方法之一。

西格列汀作為一種新型的降糖藥物，已被廣泛應(yīng)用于臨床，除了具有顯著的降糖作用外，還具有抗炎、抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多向作用，具有廣泛的應(yīng)用前景[18,27-28]。以往研究[29-30]表明，西格列汀通過(guò)介導(dǎo)抗炎和抗纖維化作用，在治療心血管疾病中發(fā)揮重要作用。在2型糖尿病的臨床試驗(yàn)[27]中，西格列汀已被證實(shí)能明顯降低單核細(xì)胞中Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）-4、TLR2、趨化因子受體-2 等的表達(dá)，進(jìn)而抑制炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6 的表達(dá)。牙周炎是一種炎癥性疾病，牙周炎發(fā)生時(shí)炎癥細(xì)胞因子如IL-6、IL-8、TNF-α 等表達(dá)量顯著增加，炎癥因子的濃度與牙周炎的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[31]。關(guān)于西格列汀對(duì)牙周炎的影響在以往研究中報(bào)道極少，有學(xué)者[32]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，每天10 mg·kg-1的西格列汀管飼可降低牙周炎大鼠IL-1β、基質(zhì)金屬蛋白酶-9 和一氧化氮合酶-2 的基因表達(dá)水平，但在該模型中未觀察到對(duì)牙槽骨和膠原組織的顯著保護(hù)作用，可能是因?yàn)樵谒脛┝恐校@種基因表達(dá)的改變并不能促進(jìn)膠原的增加或減少牙槽骨的吸收，說(shuō)明西格列汀可能對(duì)牙周炎具有一定的抑制作用。本研究旨在通過(guò)明確西格列汀對(duì)LPS 誘導(dǎo)的HGF 炎癥反應(yīng)的影響來(lái)初步探討西格列汀對(duì)牙周炎的治療是否會(huì)有作用。

圖7 西格列汀和BAY11-7082對(duì)LPS誘導(dǎo)的NF-κB通路活化的影響Fig 7 Effects of sitagliptin and BAY11-7082 on LPS-induced activation of NF-κB pathway

圖8 西格列汀和BAY11-7082對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)的影響Fig 8 Effects of sitagliptin and BAY11-7082 on LPS-induced inflammatory cytokines

本課題目前的研究發(fā)現(xiàn)，LPS能顯著促進(jìn)HGF中炎性細(xì)胞因子CCL2、IL-6、IL-8、SOD2的基因表達(dá)，而西格列?。?.1、0.25、0.5 μmol·L-1）能顯著抑制LPS 誘導(dǎo)的這些炎性細(xì)胞因子的上調(diào)。此外，在LPS 誘導(dǎo)的HGF 中，西格列汀處理可明顯抑制LPS 誘導(dǎo)的IL-6 和IL-8 蛋白的分泌。據(jù)報(bào)道[9]，炎性細(xì)胞因子的升高與牙周炎的骨吸收有關(guān)。IL-6 在破骨細(xì)胞生成和牙周疾病的發(fā)病機(jī)制中起促進(jìn)作用[33]。IL-6和IL-8在所有牙周炎患者的牙齦組織中表達(dá)增高[34]。本實(shí)驗(yàn)以5 μg·mL-1牙齦卟啉單胞菌的LPS 為刺激源，以HGF 為實(shí)驗(yàn)對(duì)象成功建立炎癥模型，結(jié)果表明：西格列汀能不同程度地下調(diào)IL-6、IL-8 的基因表達(dá)及蛋白分泌水平，這些結(jié)果表明西格列汀在牙周炎的發(fā)病過(guò)程中，可能通過(guò)抑制LPS 導(dǎo)致的炎癥微環(huán)境來(lái)發(fā)揮其抗炎作用。

除促炎細(xì)胞因子，已經(jīng)證實(shí)SOD2的上調(diào)與牙周炎的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，SOD2 是一種重要的抗氧化酶，可導(dǎo)致分子氧或過(guò)氧化氫的產(chǎn)生[15]，而氧化應(yīng)激相關(guān)的炎癥介質(zhì)與牙周炎密切相關(guān)[35]。本研究表明，LPS可上調(diào)HGF中SOD2的表達(dá)，而西格列汀可抑制其上調(diào)。該結(jié)果表明西格列汀可通過(guò)抑制LPS誘導(dǎo)的SOD2過(guò)表達(dá)，從而維持活性氧穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而發(fā)揮其保護(hù)牙周組織的作用。CCL2也被稱為單核細(xì)胞趨化蛋白-1，作為一種促炎趨化因子，可吸引單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞到牙周炎的炎癥部位發(fā)揮相應(yīng)的作用，從而加速牙周炎的發(fā)展進(jìn)程[14,36]。本 研 究中，LPS 誘導(dǎo)HGF 中CCL2 的表達(dá)升高，而西格列汀從基因和蛋白水平抑制了CCL2的升高，提示西格列汀可以減輕牙周炎癥。

轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程本身受許多因素影響，蛋白質(zhì)和mRNA 表達(dá)之間的差異很可能是基因表達(dá)的生物學(xué)結(jié)果。蛋白質(zhì)調(diào)控是多層次、多時(shí)間和多類型的，僅RNA 不能決定蛋白質(zhì)表達(dá)，諸如轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、蛋白質(zhì)半衰期、合成速度之類的其他因素也影響蛋白質(zhì)表達(dá)水平[37-39]。這可能是低濃度的西格列?。?.1 μmol·L-1）對(duì)HGF 中IL-6 和IL-8 的mRNA和蛋白的表達(dá)作用不一致的原因。

NF-κB 通路是參與激活促炎細(xì)胞因子表達(dá)的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子，長(zhǎng)期以來(lái)一直被認(rèn)為是典型的促炎信號(hào)通路[40]。在正常情況下，NF-κB以其非活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，p50/p65 與其抑制物IκB結(jié)合成三聚體，使其不能核易位。一旦受到NFκB 激活劑（如LPS）的刺激，細(xì)胞信號(hào)就會(huì)啟動(dòng)并導(dǎo)致IκB 蛋白的磷酸化和降解。隨后，NF-κB p65 從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，以調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子[41]。先前的研究[41-43]表明，NF-κB 在HGF 中表達(dá)，且慢性牙周炎患者的牙齦組織中NF-κB（p50/p65）激活率遠(yuǎn)高于正常組織，該信號(hào)通路的激活在牙周疾病的發(fā)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。本實(shí)驗(yàn)證明了西格列汀能夠下調(diào)NF-κB p65 和IκBα的磷酸化水平以及IκBα 的降解，進(jìn)而阻斷LPS 誘導(dǎo)NF-κB 信號(hào)通路激活，抑制炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-8、CCL2 和SOD2 的表達(dá)，這與先前的研究[44]結(jié)果一致。同時(shí)，本研究將NF-κB 通路抑制劑BAY11-7082作為陽(yáng)性對(duì)照，并探究其對(duì)HGF 中炎癥因子CCL2、IL-6、IL-8、SOD2 mRNA和NF-κB通路的影響，結(jié)果表明：BAY11-7082 對(duì)CCL2、IL-6、IL-8、SOD2 mRNA 的表達(dá)以及LPS 誘導(dǎo)的NF-κB 活化有抑制作用，說(shuō)明阻斷NF-κB 通路可有效抑制LPS 引起的HGF 炎癥反應(yīng)，這同西格列汀的效果相同，據(jù)此本研究推測(cè)，西格列汀對(duì)HGF 的抗炎作用很可能是通過(guò)阻斷NF-κB 活化，進(jìn)而抑制炎癥因子的釋放，其可能的作用機(jī)制見(jiàn)圖9。

圖9 西格列汀在LPS誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路中的作用機(jī)制Fig 9 Putative mechanism for the role of sitagliptin in LPS-in‐duced NF-κB signaling pathway

本研究從體外實(shí)驗(yàn)證明了西格列汀通過(guò)阻斷NF-κB 信號(hào)通路激活來(lái)抑制LPS 誘導(dǎo)的HGF 中炎癥反應(yīng)，在未來(lái)的研究中，將進(jìn)一步增加體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及臨床研究來(lái)驗(yàn)證西格列汀在抗炎方面的作用，為未來(lái)研發(fā)西格列汀應(yīng)用于牙周炎治療提供理論依據(jù)。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。