麝香保心丸對小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成的影響及相關(guān)機(jī)制探討

戴婷 何文明 麥一峰

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種慢性進(jìn)行性疾病，以血管內(nèi)膜形成粥樣斑塊為特征，主要累及大中型動脈，造成血管腔狹窄、血管壁彈性減弱[1-2]，從而引起相應(yīng)器官繼發(fā)性改變，重則導(dǎo)致腦卒中、心肌梗死等。在我國，AS 的患病率不斷上升，對社會和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展造成了嚴(yán)重負(fù)擔(dān)[3]。麝香保心丸是一種中藥制劑，含有七種常見的中藥物質(zhì)，包括麝香、人參提取物、牛黃、肉桂、蟾酥、蘇合香和冰片[4]，在冠心病中廣泛使用，并具有一定療效[5-7]，但目前對其抗AS 作用機(jī)制的研究并不深入。本研究使用載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）基因敲除小鼠以建立AS 動物模型，探討麝香保心丸對小鼠AS 斑塊形成的影響，并從脂質(zhì)代謝、炎癥級聯(lián)反應(yīng)、斑塊穩(wěn)定性等方面探索相關(guān)機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF 級6 周齡健康雄性C57BL/6小鼠10 只，重量（20.0±2.0）g；6 周齡健康雄性ApoE-/-小鼠20 只，重量（25.0±1.8）g，均購于北京維通利華公司，由寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物房飼養(yǎng)，批準(zhǔn)編號：2018-01。

1.2 藥物、試劑和儀器 高脂飼料購自北京博泰宏達(dá)生物有限公司（批號：2017072304，規(guī)格2 kg）。麝香保心丸由上海和黃藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。白介素（interleukin，IL）-1βELISA 試劑盒購自美國R&D Systems 公司，單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）ELISA 試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；TRIzol 試劑購自美國Ambion 公司；HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；FS essential DNA green Marker 購自美國羅氏公司；引物均購自深圳華大基因股份有限公司；抗α-平滑肌肌動蛋白（alphasmooth muscle actin，α-SMA）抗體（ab5694）、抗CD68 抗體（ab125212）和抗CD31（ab28364）抗體均購自美國abcam 公司；免疫組化試劑盒、油紅O染色液均購自北京索萊寶科技有限公司。全自動生化分析儀為深圳庫貝爾生物科技有限公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)、PCR 儀為德國Eppendorf 公司產(chǎn)品；熒光定量PCR 儀為美國Roche 公司產(chǎn)品（LightCycler 480Ⅱ）；冰凍切片機(jī)和酶標(biāo)儀均為美國Thermo公司產(chǎn)品；普通光學(xué)顯微鏡為日本Olympus 產(chǎn)品；倒置相差顯微鏡為Nikon 儀器（上海）有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 動物分組 10 只C57BL/6 小鼠作為對照組，普通飼料喂養(yǎng)。20 只ApoE-/-小鼠高脂飼料喂養(yǎng)8周建立AS 模型后，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組：APOE-/-模型組10 只，采用0.9%氯化鈉溶液灌胃，1 mL/d；麝香保心丸組10 只，將麝香保心丸30 mg/kg溶于1 mL 0.9%氯化鈉溶液灌胃，1 mL/d，劑量按照小鼠與人體表面積換算成等效劑量。每組灌胃1 次/d，持續(xù)8 周后無小鼠死亡，處死各組小鼠，取血液及病理標(biāo)本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 血清脂質(zhì)水平及IL-1β、MCP-1 水平檢測各組小鼠眼球靜脈取血約1 mL，室溫靜置30 min，3 000 r/min 離心10 min 后取上清液，采用全自動生化分析儀檢測血清中總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoproteincholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（low density Lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平。按照ELISA 試劑盒說明書的步驟，使用ELISA 法檢測各組小鼠血清中炎癥因子IL-1β 和促炎細(xì)胞因子MCP-1 水平。

1.3.3 主動脈大體油紅O 染色 小鼠腹腔注射10%水合氯醛0.2 mL 麻醉，麻醉后立刻暴露心臟，經(jīng)左心室快速注射0.9%氯化鈉溶液以清除殘余血液，取小鼠心臟主動脈開口處至腹主動脈腎動脈分支處的主動脈組織，分離周圍結(jié)締組織后縱向剖開血管，油紅O 染料染15 min，用70%酒精分化3 min，蒸餾水沖洗后平鋪拍照，采用Image J 軟件分析圖像。

1.3.4 主動脈根部冰凍切片油紅O 染色 取用分離后的小鼠心臟及主動脈，剪取小鼠心臟主動脈開口處的組織，4%多聚甲醛4 ℃過夜后再分別放入20%及30%蔗糖溶液梯度脫水處理各24 h，OCT 包埋后放入液氮速凍，-80 ℃保存。冰凍切片機(jī)以8 μm厚度進(jìn)行連續(xù)切片，從顯微鏡下能觀察到主動脈瓣膜形狀開始進(jìn)行標(biāo)記，各組小鼠選取相同標(biāo)記號的切片進(jìn)行油紅O 染色。切片室溫回溫，蒸餾水浸泡1 min，60%異丙醇浸潤2 min，油紅O 染液孵育15 min，60%異丙醇調(diào)色5 s，流水沖洗5 min，蘇木素復(fù)染1 min，鹽酸酒精分化3 s，流水沖洗反藍(lán)，中性樹脂封片。切片拍照后采用Image J 軟件分析圖片中AS 斑塊的面積。

1.3.5 小鼠主動脈及肝臟組織中細(xì)胞因子、脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA 的相對表達(dá)量檢測 檢測小鼠主動脈組織中IL-8、IL-1β、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、MCP-1、基質(zhì)金屬蛋白酶1（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）、微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）、自噬相關(guān)基因p62（Sequestosome 1，p62）和Beclin1 mRNA 的相對表達(dá)量，肝臟組織中膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（sterol-regulatory element binding proteins，SREBP）-2、低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDLR）、ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1）和ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G1（ATPbinding cassette transporter G1，ABCG1）mRNA 的相對表達(dá)量。分別研磨小鼠主動脈組織和肝臟組織，用TRIzol 試劑提取總RNA，測定RNA 濃度和純度后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后在熒光定量PCR 儀中進(jìn)行反應(yīng)。PCR 反應(yīng)引物序列見表1。反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，PCR 循環(huán)95 ℃10 s，56 ℃20 s，72 ℃30 s，72 ℃延伸1 min，共45 個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT法對結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3.6 主動脈斑塊中α- 平滑肌肌動蛋白（alphasmooth muscle actin，α-SMA）、CD68 和CD31 蛋白的表達(dá)檢測 選取相對應(yīng)編號的各組小鼠主動脈根部冰凍切片，選用平滑肌細(xì)胞抗體α-SMA，巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68 和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31，按照免疫組化試劑盒步驟分別檢測相應(yīng)蛋白的表達(dá)量。在400 倍顯微鏡下觀察，免疫組化陽性染色為棕黃色或棕褐色，每例隨機(jī)觀察3 個(gè)以上視野，陽性率=平均光密度/陽性著色面積×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

表1 PCR 反應(yīng)引物序列

表2 各組小鼠血清脂質(zhì)水平比較（mmol/L）

2.1 各組小鼠血清脂質(zhì)水平比較 見表2。

由表2 可見，與對照組小鼠比較，ApoE-/-模型組小鼠血清TC、TG、HDL-C 和LDL-C 水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；與ApoE-/-模型組比較，麝香保心丸組小鼠血清TC、TG 和LDL-C均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），HDL-C水平雖有降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 各組小鼠血清IL-1β 和MCP-1 水平比較見表3。

表3 各組小鼠血清IL-1β 和MCP-1 水平比較（pg/mL）

圖3 各組小鼠主動脈組織中炎癥因子和細(xì)胞因子mRNA 的相對表達(dá)量比較（注：與對照組比較，△△P＜0.01；與ApoE-/-模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。IL 為白介素，TNF 為腫瘤壞死因子，MCP 為單核細(xì)胞趨化蛋白，MMP 為基質(zhì)金屬蛋白酶）

由表3 可見，與對照組小鼠比較，ApoE-/-模型組小鼠血清IL-1β 和MCP-1 水平增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；與ApoE-/-模型組比較，麝香保心丸組小鼠血清IL-1β 和MCP-1 水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.3 各組小鼠主動脈大體AS 斑塊油紅O 染色結(jié)果 見圖1（插頁）。

由圖1 可見，對照組小鼠主動脈壁光滑平整，無AS 斑塊產(chǎn)生；ApoE-/-模型組小鼠主動脈壁可見大量被油紅O 染紅的AS 斑塊，占整條主動脈的比例約為26.3%±2.0%，斑塊大小不一，多位于動脈分叉處；麝香保心丸組小鼠主動脈壁可見AS 斑塊，占整條主動脈的比例約為17.0%±1.3%，較ApoE-/-模型組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 各組小鼠主動脈根部切片AS 斑塊油紅O 染色結(jié)果 見圖2（插頁）。

由圖2 可見，對照組小鼠主動脈根部切片中組織的形態(tài)正常，內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完整，中膜平滑肌排列整齊，管腔內(nèi)無贅生物；ApoE-/-模型組小鼠主動脈根部切片中可明顯觀察到中膜的平滑肌層被炎性細(xì)胞浸潤、破壞，管腔內(nèi)存在被油紅O 染成紅色的AS 斑塊組織，斑塊面積為（419 841±26 590）μm2，內(nèi)含大量膽固醇結(jié)晶和壞死核心；麝香保心丸組小鼠主動脈根部也存在斑塊組織，斑塊面積為（533 710±24 309）μm2，較ApoE-/-模型組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 各組小鼠主動脈組織中炎癥因子和細(xì)胞因子mRNA 的相對表達(dá)量比較 見圖3。

由圖3 可見，與對照組小鼠比較，ApoE-/-模型組小鼠主動脈組織中IL-8、IL-1β、TNF-α、MCP-1、MMP-1 mRNA 的相對表達(dá)量均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；與ApoE-/-模型組比較，麝香保心丸組小鼠主動脈組織中IL-8、IL-1β、TNF-α、MCP-1 和MMP-1 mRNA 的相對表達(dá)量均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.6 各組小鼠肝臟組織中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA 的相對表達(dá)量比較 見圖4。

由圖4 可見，與對照組小鼠比較，ApoE-/-模型組 小 鼠 肝 臟 組 織 中SREBP-2、LDLR、ABCA1 和ABCG1 mRNA 的相對表達(dá)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；而與ApoE-/-模型組比較，麝香保心丸組小鼠肝臟組織中SREBP-2、LDLR 和ABCA1 mRNA 的相對表達(dá)量上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.7 各組小鼠主動脈組織中平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞含量比較 見圖5（插頁）。

由圖5 可見，與對照組小鼠比較，ApoE-/-模型組小鼠主動脈組織中平滑肌細(xì)胞含量降低，巨噬細(xì)胞含量增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），內(nèi)皮細(xì)胞含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與ApoE-/-模型組小鼠比較，麝香保心丸組小鼠主動脈組織中巨噬細(xì)胞含量減少（P＜0.05），而平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞含量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.8 各組小鼠主動脈組織中自噬相關(guān)基因mRNA的相對表達(dá)量比較 見圖6。

由圖6 可見，與對照組小鼠比較，ApoE-/-模型組小鼠主動脈組織中自噬相關(guān)基因LC3-Ⅱ和Beclin1 mRNA 相對表達(dá)量下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），p62 mRNA 的相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與ApoE-/-模型組比較，麝香保心丸組小鼠主動脈組織中p62 mRNA 相對表達(dá)量下降，Beclin1 和LC3-ⅡmRNA 相對表達(dá)量上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

圖4 各組小鼠肝臟組織中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA 的相對表達(dá)量比較（與ApoE-/-模型組比較，*P＜0.05；SREBP 為膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白，LDLR 為低密度脂蛋白受體，ABCA1 為ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1，ABCG1 為ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G1）

圖6 各組小鼠主動脈組織中自噬相關(guān)基因mRNA 的相對表達(dá)量比較（與對照組比較，△P＜0.05；與ApoE-/-模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。LC3-Ⅱ?yàn)槲⒐芟嚓P(guān)蛋白1 輕鏈3）

3 討論

異常的慢性炎癥反應(yīng)是加速斑塊發(fā)生發(fā)展和增加斑塊不穩(wěn)定性的主要因素[8]。在AS 斑塊形成的過程中，各種刺激誘使內(nèi)皮細(xì)胞活化，增加炎性細(xì)胞因子和促炎因子的釋放，如IL-8、MCP-1 等，促進(jìn)了血液單核細(xì)胞的募集和黏附[9]。單核細(xì)胞滲入內(nèi)皮下并被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞，產(chǎn)生MMPs 和大量炎癥因子，加劇了局部炎癥反應(yīng)[10]，從而促進(jìn)了AS 斑塊的形成。MMP-1 屬于MMP 家族，能有效降解細(xì)胞外基質(zhì)[9]，因此巨噬細(xì)胞分泌的MMP-1 增加會破壞細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解的平衡，加劇AS 斑塊的不穩(wěn)定，促進(jìn)斑塊的破裂。我們之前的研究已證明通過抑制炎癥可有效抑制AS 的進(jìn)程[11]，本實(shí)驗(yàn)在用麝香保心丸治療后，主動脈組織中炎癥因子IL-8、IL-1β、TNF-α 和細(xì)胞因子MCP-1、MMP-1 的基因表達(dá)顯著下調(diào)，血液中IL-1β 和MCP-1 水平也顯著降低。因此，麝香保心丸可以通過抑制炎癥反應(yīng)來減緩AS斑塊的發(fā)展，并且也起到了穩(wěn)定AS 斑塊的作用。

此外，AS 斑塊的穩(wěn)定性與斑塊的形態(tài)相關(guān)，晚期AS 斑塊中壞死核心區(qū)域的不斷擴(kuò)大會誘發(fā)斑塊破裂，引起急性心腦血管事件[8]。本研究顯示，麝香保心丸顯著減輕了整條主動脈和主動脈根部的AS斑塊病變負(fù)擔(dān)，小鼠AS 斑塊中的炎性巨噬細(xì)胞含量降低，壞死核心區(qū)域面積也有所下降，這都有助于增強(qiáng)AS 斑塊的穩(wěn)定性，對疾病的結(jié)果具有積極影響。

除了異常的炎癥反應(yīng)外，血脂異常，特別是血清LDL-C 水平升高，也是引起AS 發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素之一[12]。肝臟是參與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的重要器官，在維持血液和細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)水平中發(fā)揮著重要的作用[13]。麝香保心丸在脂質(zhì)代謝中的調(diào)節(jié)作用也越來越受到人們的關(guān)注，在其所含的多種化學(xué)成分中，有兩種膽汁酸，即熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸，可抑制膽固醇的產(chǎn)生，治療高甘油三酯血癥[14]。與之前的結(jié)果相似[15-16]，在給予麝香保心丸治療8 周后，AS 小鼠的血脂代謝紊亂也有了明顯的改善，血清TC、TG 和LDL-C 水平明顯降低。肝臟中與膽固醇代謝密切相關(guān)的基因，如SREBP-2、LDLR 和ABCA1 mRNA 相對表達(dá)量顯著上調(diào)。SREBP-2 負(fù)責(zé)調(diào)控包括LDLR在內(nèi)的膽固醇合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，LDLR的表達(dá)上調(diào)使之與LDL 的結(jié)合增加，加快清除血液中的LDL，延緩AS 斑塊的發(fā)展[17]。ABCA1 則介導(dǎo)膽固醇流出至無脂的載脂蛋白A1，從而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)外流。因此，麝香保心丸可能通過加快膽固醇清除以及促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)來減少AS 斑塊內(nèi)泡沫細(xì)胞的堆積，降低血液循環(huán)中過量的脂蛋白對內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷而發(fā)揮抗AS 的作用。

研究表明，麝香保心丸可以清除活性氧，通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞線粒體依賴性凋亡而抑制AS 的發(fā)展[17]。自噬是一種保守的進(jìn)化過程，其通過溶酶體途徑降解并循環(huán)利用細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，從而積極響應(yīng)細(xì)胞的應(yīng)激狀態(tài)以維持穩(wěn)態(tài)[18]。自噬缺陷或自噬能力受損會使細(xì)胞清除能力下降，引起應(yīng)激、氧化、炎癥反應(yīng)等，因此與AS 的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[19-20]。許多文獻(xiàn)報(bào)道也證明自噬在AS 的發(fā)展中參與了脂質(zhì)代謝和膽固醇穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，AS 小鼠在麝香保心丸治療后，主動脈組織中自噬相關(guān)基因P62 的表達(dá)量下調(diào)，而Beclin1 和LC3-Ⅱ的表達(dá)量上調(diào)，說明麝香保心丸還可能通過激活自噬來抑制AS 斑塊的發(fā)展。

綜上所述，麝香保心丸能抑制AS 斑塊的發(fā)展，具有抗AS 的效果，其作用機(jī)制可能與抑制炎癥反應(yīng)，增加斑塊穩(wěn)定性，促進(jìn)膽固醇清除和逆轉(zhuǎn)運(yùn)，以及激活自噬有關(guān)。