地龍口服液對(duì)大鼠的亞慢性毒性試驗(yàn)

房春林，黃 興，殷中瓊

（1.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，四川成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川成都 611130）

地龍（又名蚯蚓）為鉅蚓科動(dòng)物參環(huán)毛蚓PheretimaasPergilium（E．Perrier）、 通俗環(huán)毛蚓Pheretima vulgaris Chen、威廉環(huán)毛蚓Pheretima guillelmi（Michaelsen）或櫛盲環(huán)毛蚓Pheretima Pectinifera Michalsen的干燥體，氣腥，味咸，性寒，歸肝、脾、膀胱經(jīng)，具有清熱平肝、定驚、消炎止痛、通絡(luò)、平喘、利尿等作用。常用于治療高熱神昏、狂躁、肺熱咳喘、尿少水腫[1～3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明其具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥、解熱、平喘、抗血栓、抗病毒等生物活性[4～6]。臨床上可用于治療癲癇、慢性支氣管炎、支氣管哮喘、微循環(huán)障礙等[7～8]。本研究的目的是在研究地龍口服液急性毒性的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行亞慢性毒性試驗(yàn)研究，評(píng)價(jià)地龍口服液的安全性，為獸醫(yī)臨床用藥安全提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

4 周齡SD 大鼠80 只， 雌雄各半， 體重90 ～110 g。購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，合格證號(hào)：SCXK（川）2013-24。

1.2 藥品

地龍口服液（含量：含原生藥量為10 g/ml），由成都乾坤動(dòng)物藥業(yè)股份有限公司中試生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：20200101。

1.3 主要試劑

血細(xì)胞計(jì)數(shù)配套試劑（稀釋液、溶血素、清洗液等），購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

血液生化指標(biāo)配套試劑盒（質(zhì)控血清、ALP、TP、ALB、ALT、AST 、BUN、TG、TH0、GLU 等）,購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

甲醛、氯化鈉、乙醇、肝素鈉等，購自成都化學(xué)試劑廠。

1.4 主要儀器

離心機(jī)：EPPendorf5804；邁瑞血細(xì)胞分析儀：深圳邁瑞生物醫(yī)學(xué)電子有限公司，BC-2800；邁瑞血液生化分析儀：深圳邁瑞生物醫(yī)學(xué)電子有限公司，BS-180；顯微鏡：奧林巴斯；切片機(jī)：徠卡（2016）；電子天平：賽多利斯。

2 方法

2.1 試驗(yàn)分組

選用健康的SD 大鼠80 只（4 周齡，體重90 ～110 g），雌雄各半，隨機(jī)分為4 組，設(shè)高、中、低劑量組和對(duì)照組，每組20 只。

2.2 給藥劑量與給藥途徑

參照獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則匯編中亞慢性試驗(yàn)方法進(jìn)行[9]，試驗(yàn)組設(shè)高中低劑量組分別為3125 mg/kg、1042 mg/kg、313 mg/kg，空白對(duì)照組每天給予等劑量的生理鹽水。各給藥組均按每組動(dòng)物的平均體重分別計(jì)算出每天的給藥量，灌胃針每天開水煮沸消毒，每天上午灌胃1 次，連續(xù)灌服30 d，自由采食飲水，停藥后觀察2 周。

2.3 臨床表現(xiàn)觀察

整個(gè)試驗(yàn)期間，每日早晚觀察并記錄大鼠被毛、眼、粘膜改變和呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、肢體活動(dòng)、行為方式等變化發(fā)生的時(shí)間、程度和持續(xù)時(shí)間。對(duì)發(fā)現(xiàn)的死亡動(dòng)物或?yàn)l危動(dòng)物進(jìn)行及時(shí)剖檢。

2.4 體重和攝食量

每日測(cè)量1 次飼料和飲水消耗量，每周測(cè)體重1 次。

2.5 血液學(xué)檢查

給藥結(jié)束后每組剖殺10 只大鼠，雌雄各半。大鼠眼眶靜脈采血0.5 ml，注入真空肝素鈉抗凝管中，進(jìn)行血液生理指標(biāo)的測(cè)定，檢查指標(biāo)包括血紅蛋白（HGB）、紅細(xì)胞（RBC）、血小板（PLT）、白細(xì)胞（WBC）及分類計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞（GRA）、淋巴細(xì)胞（LYM）和單核細(xì)胞（MID），嗜酸性粒細(xì)胞（EO），嗜堿性粒細(xì)胞(BASO)。

2.6 血液生化檢查

大鼠眼眶靜脈采血2.0 ml，放入潔凈離心管中，室溫下靜置析出血清，3500 r/min 離心10 min，收集血清進(jìn)行血液生化指標(biāo)的測(cè)定。檢查指標(biāo)包括白蛋白(ALB)、總蛋白（TP）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、血糖（GLU）、甘油三酯（TG）和總膽固醇（CHO）。

2.7 臟器系數(shù)測(cè)定

對(duì)所有大鼠進(jìn)行大體解剖，檢查體表、體腔的各開口處，顱、胸、腹腔及其內(nèi)容物；心、肝、脾、肺、腎等臟器分離后盡快稱重，以防水分丟失。記錄臟器的絕對(duì)重量，并計(jì)算出相對(duì)重量（臟器系數(shù)=臟器重量/體重×100%）。

2.8 病理組織學(xué)檢查

試驗(yàn)期間死亡的大鼠及試驗(yàn)結(jié)束后處死的大鼠，在剖檢后取有關(guān)組織器官（心、肺、肝、脾、腎、胃、腸、睪丸、卵巢）放入預(yù)冷的4 %多聚甲醛固定液內(nèi)固定。按照石蠟切片常規(guī)制作程序制作組織切片，經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察其病理組織學(xué)變化并采集圖片。

2.9 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)使用SPSS19.0 軟件進(jìn)行ANOVA 單因素方差分析，多個(gè)試驗(yàn)組與對(duì)照組的比較用LSD 法，組間比較用Duncan 法，結(jié)果用（±s）表示。

3 結(jié)果與分析

3.1 臨床表現(xiàn)

整個(gè)試驗(yàn)期間，各劑量組大鼠體重持續(xù)增長(zhǎng)。大鼠精神正常，飲水采食活躍，眼黏膜、行為活動(dòng)正常，未見被毛有脫落，分泌物和排泄物無異常，未出現(xiàn)中毒癥狀以及其它的毒性反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)期間也沒有出現(xiàn)受試動(dòng)物因藥物劑量而死亡的現(xiàn)象。

3.2 體重與攝食量比較

試驗(yàn)期間，大鼠的采食、飲水等行為活動(dòng)正常，藥物組與空白組比較飲水?dāng)z食量均無明顯差異。各給藥組與空白對(duì)照組大鼠體重變化比較差異不顯著（P ＞0.05）。表明地龍口服液對(duì)大鼠的生長(zhǎng)無影響（見表1）。

表1 亞慢性毒性試驗(yàn)中地龍口服液對(duì)大鼠體重的影響（±s，g）

表1 亞慢性毒性試驗(yàn)中地龍口服液對(duì)大鼠體重的影響（±s，g）

性別組別試驗(yàn)前第1周第2周第3周第4周雄空白對(duì)照組109.5±4.12159.75±11.9231.75±20.95261.5±26.59289±28.18低劑量組108.5±5160±5.03212±9.06252±11.94266.5±11.68中劑量組108±2.16153.25±6.7155±91.01242.25±17.17268.75±34.09高劑量組107±2.83154.75±6.08205.25±11.3255±9.52274.75±14.24雌空白對(duì)照組98.5±7.33134.75±10.08171.25±13.91197±16.81205.25±20.6低劑量組104.5±2.89141.25±5.44167.75±6.24199.75±7.27207.75±6.99中劑量組93.25±1.5105.75±62.13171.75±15.17199±18.89206.25±23.75高劑量組93.75±3.3131±2.16162±5.6186.25±9.46196±5.89

2.3 血液學(xué)指標(biāo)比較

與對(duì)照組相比較，高劑量組嗜堿性細(xì)胞顯著高于空白組，其他血液學(xué)指標(biāo)各組差異均不顯著(P＞0.05)。具體數(shù)據(jù)見表2。

表2 地龍口服液對(duì)大鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響（±s）

表2 地龍口服液對(duì)大鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05。

指標(biāo)空白組低劑量組中劑量組高劑量組白細(xì)胞（WBC，109/L）10.79±3.310.16±3.719.37±3.8212.28±6.64紅細(xì)胞（RBC，1012/L）7.17±0.788.56±0.867.87±2.317.5±1.87血小板（PLT，109/L）888.43±622.9761.88±227.94824.11±307.06783.63±247.32淋巴細(xì)胞（LYM，109/L）7.17±1.337.14±2.36.66±2.597.63±3.56單核細(xì)胞（MID，109/L）0.49±0.20.39±0.140.37±0.160.5±0.32血紅蛋白（HGB，g/L）176.71±17.09192.25±25.53180.56±55.41167.5±44.22嗜酸性粒細(xì)胞（EO，109/L）0.48±0.20.38±0.140.36±0.160.49±0.32嗜堿性粒細(xì)胞（BASO，109/L）0.01±00.01±00.01±0.010.02±0.01*中性粒細(xì)胞（GRA，109/L）0.49±0.20.39±0.140.37±0.160.5±0.32

2.4 血清生化比較

大鼠的各項(xiàng)生化指標(biāo)對(duì)比空白組均差異不顯著?？梢哉J(rèn)為地龍口服液對(duì)大鼠的較高劑量30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)低毒或無毒（見表3）。

表3 地龍口服液對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響（±s）

表3 地龍口服液對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響（±s）

項(xiàng)目空白組低劑量組中劑量組高劑量組ALB（g/L）40.9±2.7241.5±3.4649.91±33.1331.72±6.01 ALT（U/L）33.99±7.3440.19±8.7737.99±9.7238.25±6.92 AST（U/L）51.32±9.8747.88±5.1748.85±5.1445.17±3.97 BUN（mmol/L）0.7±0.720.94±0.971.08±0.820.95±0.78 GLU（mmol/L）3.95±0.653.91±0.374.73±1.214.82±0.87 CRE（μmol/L）82.92±108.4291.58±66.4387.08±26.9362.49±17.19 CHO（mmol/L）2.61±0.282.68±0.682.91±0.512.55±0.34 TG（mmol/L）0.52±0.190.74±0.20.59±0.310.46±0.24 TP（g/L）40.9±2.7241.5±3.4649.91±33.1331.72±6.01

2.5 臟器系數(shù)比較

試驗(yàn)結(jié)束后剖殺各試驗(yàn)大鼠，高劑量組肝臟表面部分區(qū)域有較淺的黃斑，可能與脂肪變性有關(guān)；其他各臟器未見明顯異常病變和損傷；與對(duì)照組相比，高劑量雄鼠的心臟系數(shù)升高；肝臟系數(shù)高劑量組雄鼠升高，所有給藥組的雌鼠降低，其他各劑量組臟器系數(shù)均差異不顯著(P ＞0.05)。結(jié)果見表4。

表4 地龍口服液對(duì)大鼠主要臟器系數(shù)的影響（±s）

表4 地龍口服液對(duì)大鼠主要臟器系數(shù)的影響（±s）

注：表示與對(duì)照組比較，*P ＜0.05，*P ＜0.01。

組別心（g/100 g）肝（g/100 g）脾（g/100 g）肺（g/100 g）腎（g/100 g）胃腸（g/100 g）卵巢/睪丸（g/100 g）雄空白組0.33±0.042.64±0.160.21±0.030.49±0.020.72±0.025.13±0.331.23±0.1低劑量組0.35±0.032.59±0.320.18±0.020.46±0.040.68±0.035.13±0.241.05±0.17中劑量組0.37±0.12.93±0.720.19±0.050.58±0.180.75±0.175.28±1.611.29±0.26高劑量組0.52±0.17*3.53±0.41*0.21±0.030.55±0.10.72±0.16.26±0.911.32±0.2空白組0.41±0.043.3±0.120.26±0.010.54±0.030.66±0.057.19±0.330.07±0.02低劑量組0.29±0.172.91±0.24*0.21±0.030.58±0.040.67±0.086.78±0.660.09±0.01中劑量組0.37±0.032.9±0.19**0.25±0.050.69±0.08*0.69±0.07*6.35±0.50.06±0.01高劑量組0.36±0.032.9±0.19**0.23±0.010.56±0.070.73±0.09**5.99±0.450.09±0.01雌

2.6 組織病理學(xué)比較

對(duì)第30 天采樣的各劑量試驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠心、肝、脾、肺、腎、胃腸、睪丸、卵巢進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。結(jié)果表明：高劑量組的心肌細(xì)胞間有輕微的淤血（見圖1），肝索邊緣的細(xì)胞部分發(fā)生脂肪變性和水泡變性，細(xì)胞腫脹變圓（見圖2）。試驗(yàn)組的低、中、高劑量組大鼠肺泡壁有不同程度的增厚，肺泡上皮細(xì)胞增生，間隙增厚肺泡腔變窄，毛細(xì)血管有輕微的充血，腔內(nèi)干凈無滲出（見圖3），腎小球毛細(xì)血管均發(fā)生了輕度的充血和溶血；低劑量組腎小管上皮細(xì)胞有輕微腫脹變圓，腎小管管腔變窄，間質(zhì)部分區(qū)域發(fā)生了溶血（見圖4）。各試驗(yàn)組與對(duì)照組其它臟器病理組織結(jié)構(gòu)均正常。

圖1 對(duì)照組（A）：大鼠心臟具有清晰完整的結(jié)構(gòu)，心肌細(xì)胞呈條索狀規(guī)則排列（HE 400 ×）；高劑量組（B）：心肌細(xì)胞間有輕微的淤血（HE 400 ×）

圖2 對(duì)照組（A）：肝臟具有正常的肝小葉結(jié)構(gòu)，在中央靜脈周圍肝細(xì)胞排列呈索狀結(jié)構(gòu)，中央靜脈內(nèi)有輕微的充血和溶血（HE 400 ×）；高劑量組（B）：肝索邊緣的細(xì)胞部分發(fā)生脂肪變性和水泡變性，細(xì)胞腫脹變圓（HE 400 ×）

圖3 對(duì)照組（A）：具有正常完整的肺泡結(jié)構(gòu)，肺泡壁薄，由單層或多層細(xì)胞組成，肺泡腔內(nèi)干凈無異物（HE 400 ×）；高、中、低劑量組（B）：肺泡壁有不同程度的增厚，肺泡上皮細(xì)胞增生，間隙增厚肺泡腔變窄，毛細(xì)血管有輕微的充血，腔內(nèi)干凈無滲出（HE 400 ×）

圖4 對(duì)照組（A）：具有正常的組織結(jié)構(gòu)，皮質(zhì)和髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰完整（HE 400 ×）；高、中、低劑量組（B）：腎小球毛細(xì)血管均發(fā)生了輕度的充血和溶血，腎小管上皮細(xì)胞有輕微腫脹變圓，腎小管管腔變窄，間質(zhì)部分區(qū)域發(fā)生了溶血（HE 400 ×）

3 討論與結(jié)論

3.1 血常規(guī)檢測(cè)

血常規(guī)檢查是臨床上最基礎(chǔ)、最重要的化驗(yàn)檢查之一，可作為臨床診治疾病的重要依據(jù)，判斷外源化學(xué)物對(duì)機(jī)體的感染損傷[10～11]。本研究結(jié)果表明，地龍口服液30 d 亞慢性毒性試驗(yàn)的高劑量組嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)量增加。通常情況下，嗜堿性粒細(xì)胞在血液中含量太低，略微的升高或降低一般不具有臨床意義。且在本實(shí)驗(yàn)中，其他指標(biāo)，如淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、白細(xì)胞的差異均不顯著，因此認(rèn)為地龍口服液對(duì)大鼠血常規(guī)各指標(biāo)無影響。表明地龍口服液對(duì)大鼠血液系統(tǒng)、骨髓造血功能無影響。

3.2 血液生化檢測(cè)

血液學(xué)指標(biāo)是反應(yīng)機(jī)體健康狀況的主要指標(biāo)，也是疾病診斷和檢測(cè)的指標(biāo)之一。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶和尿素氮是反映肝、腎功能的主要指標(biāo)[12]。血清中尿素氮（BUN）和肌酐（CRE）的含量高低與腎功能密切相關(guān)，當(dāng)腎臟受損時(shí)，可導(dǎo)致腎小球?yàn)V過能力下降，使BUN 和CRE 含量升高[13]。血糖、總膽固醇和甘油三酯作為重要的生化指標(biāo)，3 個(gè)指標(biāo)均與肝臟有關(guān)[14]。當(dāng)肝臟發(fā)生炎癥、壞死、中毒等損害及膽道疾病時(shí)，血糖、總膽固醇和甘油三酯將會(huì)出現(xiàn)變化[12]。亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，空白組與藥物組的各項(xiàng)生化指標(biāo)均無顯著性差異，因此認(rèn)為地龍口服液對(duì)大鼠的較高劑量30 d 喂養(yǎng)試驗(yàn)低毒或無毒。

3.3 病理組織學(xué)變化

對(duì)各劑量組大鼠內(nèi)臟器官進(jìn)行病理組織學(xué)觀察結(jié)果顯示：地龍口服液造成了肝臟和腎臟輕微淤血，高劑量組可能會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞部分脂肪變性和水泡變性；藥物組的肺泡壁均有不同程度地增厚，但是14 d 后再次觀察，發(fā)現(xiàn)這些病理變化都能夠得到恢復(fù)，表明這些損傷是可逆的，證明了地龍口服液的安全性。

4 結(jié)論

地龍口服液的高、中、低劑量組大鼠連續(xù)30 d灌胃給藥后未出現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)。試驗(yàn)組大鼠采食、飲水和體重增長(zhǎng)均正常。給藥后30 d 所測(cè)得的大鼠血液學(xué)指標(biāo)、血液生化指標(biāo)與正常對(duì)照組比較，個(gè)別有一定的變化。各臟器組織病理學(xué)檢查結(jié)果表明其可導(dǎo)致肝臟和肺臟發(fā)生可逆性的輕微變性變化，高劑量組可能會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞的部分脂肪變性和水泡變性，無實(shí)質(zhì)性變化。綜上所述，對(duì)大鼠給予地龍口服液灌胃毒性小，長(zhǎng)期服用安全，無明顯的毒副作用，在3125 mg/kg 及其以下的劑量不會(huì)對(duì)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生明顯的毒性反應(yīng)。