規(guī)模化羊場致羔羊腹瀉大腸桿菌的毒力基因檢測及致病性試驗(yàn)

龍海寧，農(nóng)紹鋒，吳 靜，謝芙蓉，劉 玉

（廣西壯族自治區(qū)柳州種畜場，廣西柳州 545003）

作為規(guī)?；驁鲎顬槌Ｒ姷囊环N疾病，羔羊腹瀉發(fā)生的原因并不單一，極為復(fù)雜。其中大腸桿菌因素造成的羔羊腹瀉十分普遍，若在此病發(fā)生后，未采取針對性措施予以治療，就會(huì)嚴(yán)重威脅羊場，造成大量羔羊死亡。當(dāng)前在對腹瀉羔羊進(jìn)行治療的過程中，主要采取抗生素的方式，但近年來在各類抗生素的濫用下，臨床耐藥性不斷升高，使得菌株對抗生素的敏感性較低。由于羊場地區(qū)的差異性，使得各地羔羊腹瀉的病原菌流行也不一樣，對于抗生素的耐藥性也不同。鑒于此，需要在對羔羊腹瀉之前，通過對致病菌的明確，制定科學(xué)的治療方法，提升臨床中對羔羊腹瀉病癥的治療效果。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)菌株

全面掌握羊場羔羊飼養(yǎng)管理方式，探究羔羊圈舍存在的羔羊腹瀉情況，了解羊場消毒程序，患病羔羊被毛十分暗淡，精神過于沉郁，糞便顏色多為褐色。對腹瀉羔羊肛門處的糞便使用棉簽進(jìn)行少量蘸取并收集集中，隨后將這些樣品送入到實(shí)驗(yàn)室處理，在實(shí)施分離試驗(yàn)后共獲得大腸桿菌55 株，并抽取了其中的十株開展毒力基因檢測及致病性試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

由某學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供的試驗(yàn)小鼠體重為（25±2）g，隨后開展相關(guān)試驗(yàn)。

1.3 主要試驗(yàn)試劑及儀器

主要試驗(yàn)試劑有麥?zhǔn)媳葷峁堋?×ma sterPCRMix、核酸染液GelvlewI、DL-2000DNAMarker以及細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒。

主要試驗(yàn)儀器有購自Bio-Rad 公司的H1650-W臺(tái)式高速離心機(jī)、購自日本 sHIMADZU 的超凈工作臺(tái)、購自EPPendorf5453 的恒溫振蕩培養(yǎng)箱、購自尼康ECLIP sECi-L 的電泳儀、購自北京市六一儀器廠的GelDocXR+型凝膠成像系統(tǒng)、購自合肥美的電冰箱有限公司的-20℃冰箱、購自上海和泰儀器有限公司的電泳槽以及購自天根生物科技有限公司的細(xì)菌DNA 提取試劑盒。

1.4 RPCR 擴(kuò)增引物的合成

引物序列由某生物科技公司合成，在本試驗(yàn)開展期間，共使用了fimC、FyuA、hiyF、eae 以及irP2 引物。

2 試驗(yàn)方法

2.1 株菌株DNA 提取

針對選出的十株樣品開展試驗(yàn)，提取這些菌株中的DNA。

2.2 菌株大腸桿菌毒力基因試驗(yàn)

表1為PCR 反應(yīng)體系詳情，表2為不同毒力基因PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件詳情。

表1 PCR 反應(yīng)體系

表2 不同毒力基因PCR 擴(kuò)增條件

2.3 RPCR 產(chǎn)物凝膠電泳

制備凝膠的制作：在三角瓶中加入1 g 瓊脂糖，并加入100 ml 的緩沖液，通過電磁爐加熱后使液體變清，并將5 μl 核酸染液加入到完全冷卻的溶液，隨后倒入制膠板，等待30 min 左右，拔出梳子。再將5 μl PCR 產(chǎn)物使用移液槍點(diǎn)入孔內(nèi)，第一空加入5 μl 的DL2000marker，第二空對照不加樣做陰性，剩下的樣品產(chǎn)物再依次加入其余各孔，在電泳槽負(fù)極放入帶孔的一端，蓋好電泳槽，并接好電，在第四小格上有條帶運(yùn)動(dòng)后馬上切斷電路，在成像儀內(nèi)放置取出膠，針對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行詳細(xì)觀察，并拍照進(jìn)行詳細(xì)記錄。

3 針對小白鼠實(shí)施致病性試驗(yàn)

在試驗(yàn)開展期間，主要對象為分離后隨機(jī)選取的10 株菌株，在LB 液體培養(yǎng)基中接種選取的10株細(xì)菌純培養(yǎng)物，基于37℃的搖床針對細(xì)菌實(shí)施全天培養(yǎng)，時(shí)間為24 h，并對菌液使用無菌生理鹽水將其稀釋至0.5 麥?zhǔn)媳葷醿x中。

將55 只體重為（25±2）g 的小白鼠分為11組。每組共5 只小鼠，將1 ～10 組分為實(shí)驗(yàn)組，第11 組為對照組，每5 只小鼠接種一種株菌，作為對照組的第11 組則接種無菌生理鹽水。實(shí)驗(yàn)組腹腔注射細(xì)菌溶液每只為0.3 ml，對照組腹腔注射無菌生理鹽水每只為0.3 ml。給小鼠喂食24 h。觀察其腹瀉現(xiàn)象、精神情況以及被毛光澤程度。解剖實(shí)驗(yàn)小鼠，無菌取小鼠的心臟和肝臟，浸泡在一定量的無菌MacConkey 瓊脂培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)過夜，觀察細(xì)菌生長特性，為鏡檢奠定基礎(chǔ)。

4 試驗(yàn)結(jié)果

4.1 毒力基因RPCR 檢測結(jié)果

通過針對十株大腸桿菌實(shí)施eae、fimC、hlyF、fyuA、irP2 毒力基因測試后表明，不僅涵蓋irP2 毒力基因，還在10 菌菌株中查到了其它毒力基因。10 株大腸桿菌除irP2 毒力基因外，在10 菌菌株中還分為檢測到了其它毒力基因；10 株大腸桿菌中都具有eae 毒力基因，而69 號(hào)、74 號(hào)、76 號(hào)、77 號(hào)則具有菌株含毒力。具體數(shù)據(jù)見表3。

表3 毒力基因PCR 檢測

4.2 小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果

大腸桿菌菌株64 號(hào)、69 號(hào)、70 號(hào)、71 號(hào)、73號(hào)、74 號(hào)、76 號(hào)和77 號(hào)均導(dǎo)致小鼠腹瀉和死亡。2 組、3 組、5 組、7 組、9 組小鼠在12 h 內(nèi)出現(xiàn)黑發(fā)、抑郁、腹瀉等癥狀，24 h 內(nèi)全部死亡；1 組和6 組小鼠在排便后12 h 內(nèi)死亡。8 組和4 組在12 h內(nèi)出現(xiàn)了3 只小鼠抑郁現(xiàn)象，2 只小鼠肛門內(nèi)有少量糞便，但是未死亡。對照組小鼠生長良好，并未出現(xiàn)腹瀉和死亡。腹瀉死亡小鼠，會(huì)發(fā)現(xiàn)小腸明顯病變，腸壁變薄，肝臟充血。采集實(shí)驗(yàn)組心臟和肝臟，接種于MacConkey 瓊脂中，37℃培養(yǎng)12 h 后，得知該菌落基本等同于大腸桿菌的菌落。革蘭氏染色陰性，兩端可見短桿菌和鈍圓。

5 討論

5.1 研究結(jié)論

選擇10 株菌株進(jìn)行毒力基因檢測。結(jié)果表明，通過進(jìn)一步檢測毒力基因，每5 個(gè)就有4 個(gè)毒力基因。4 株菌株攜帶3-4 個(gè)毒力基因，沒有檢測到irP2 基因。7 株菌株攜帶fyua 基因，陽性率為70%。9 株菌株攜帶FIMC 基因，陽性率為90%。腸出血性大腸桿菌攜帶EAE 和FIMC 毒力基因，在此期間檢出率較高的莫過于EAE 和FIMC，以此證實(shí)分離菌株致病性較高。從相關(guān)文獻(xiàn)中得知EAE 的陽性率為32.3%，可見在此病發(fā)生后，最關(guān)鍵的毒力因子就是EAE 基因。

本實(shí)驗(yàn)在致病性試驗(yàn)中選取了10 株攜帶毒力基因的大腸桿菌。將細(xì)菌溶液的濃度調(diào)整為0.5 米氏比濁管，并向每只小鼠腹腔注射0.3 ml。等24 h 后，觀察到2 株沒有引起小鼠腹瀉和死亡，另外8 株則分別呈現(xiàn)了輕度或重度腹瀉，均在隨后死亡；腸壁變薄，肝臟部分充血。對死于腹瀉的小鼠進(jìn)行接種和分離。革蘭氏染色顯微鏡檢測致病性大腸桿菌。結(jié)果表明，分離的細(xì)菌致病性特征明顯，可見在羔羊腹瀉中致病性大腸桿菌占有比例極高，已成為導(dǎo)致羔羊腹瀉的一種主要病原體。

5.2 規(guī)?；驁龈嵫蚋篂a的有效防治方法

5.2.1 建設(shè)良好養(yǎng)殖環(huán)境

養(yǎng)殖地的衛(wèi)生狀況和基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)是影響羊羔產(chǎn)量和質(zhì)量的重要方面。建設(shè)羊圈初期，羊圈的基礎(chǔ)設(shè)備，比如草架、料槽、飲水槽等都應(yīng)符合國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，要配置調(diào)節(jié)舍溫的設(shè)備，為育羊提供一個(gè)相對穩(wěn)定的溫度環(huán)境，致力于冬暖夏涼羊圈的建設(shè)。

在日常管理中，養(yǎng)殖人員要做好養(yǎng)殖場的衛(wèi)生清潔工作，定期對羊圈進(jìn)行打掃，每周不低于2 次。大多數(shù)規(guī)模化養(yǎng)殖對羊群都會(huì)進(jìn)行分類管理，通常用木欄桿將羊舍分為公羊圈、母羊圈、羔羊圈、肥羊圈等。工作人員在進(jìn)行衛(wèi)生打掃時(shí)，清潔用具應(yīng)該區(qū)別使用，每個(gè)羊圈應(yīng)該有一套清潔用具，避免羊群病菌的交叉感染。羊圈漏糞板需要清潔，清理掉堆積在漏糞板表面的羊糞減少惡臭。潮濕陰暗的環(huán)境往往會(huì)就增大羔羊患病的可能性，所以羊圈內(nèi)要保持通風(fēng)見陽，使其干燥舒適，利于羊群的活動(dòng)。日常衛(wèi)生管理工作越細(xì)致入微，腹瀉病發(fā)病率會(huì)在一定程度上減少，如果羔羊患病了，其負(fù)面影響也會(huì)減弱。

5.2.2 關(guān)注母羊飼養(yǎng)和管理工作

在母羊育種的各個(gè)環(huán)節(jié)都需要設(shè)置一整套針對母羊飼養(yǎng)的具體方案，包括飲食搭配、活動(dòng)區(qū)域等等，合理規(guī)劃產(chǎn)羔母羊的飼養(yǎng)，對產(chǎn)出健壯的羊羔具有積極意義。養(yǎng)殖戶要保證母羊飼料的充足，同時(shí)，母羊進(jìn)食和活動(dòng)環(huán)境也必須干凈衛(wèi)生，并定期對母羊圈進(jìn)行消毒殺菌。飼養(yǎng)管理方面，需要開始抓膘保脂肪，飼喂優(yōu)質(zhì)的草料和飲用水。

產(chǎn)羔時(shí)的消毒工作最為關(guān)鍵，保證接產(chǎn)工具是經(jīng)過嚴(yán)格的消毒。產(chǎn)后要檢查母羊乳房的情況，保證羔羊飲用到的初乳的質(zhì)量。產(chǎn)羔母羊的飼養(yǎng)關(guān)系著母羊的泌乳機(jī)能，母羊需要優(yōu)質(zhì)的飼料得到營養(yǎng)才能正常產(chǎn)奶，因此產(chǎn)后母羊體況的護(hù)理和恢復(fù)工作尤為重要。

5.2.3 合理安排工作環(huán)節(jié)

在大部分的養(yǎng)殖中，由于大量的市場需求，養(yǎng)殖場為了提供充足的供應(yīng)，往往沒有分批次，錯(cuò)時(shí)段進(jìn)行羔羊養(yǎng)殖，而是將一大批母羊在同一時(shí)期采用發(fā)情技術(shù)，導(dǎo)致產(chǎn)羊期集中，初生羊羔數(shù)量大。然而如果飼養(yǎng)場的基礎(chǔ)設(shè)施不完善，工作人員數(shù)量配給不足，在羔羊生長的各個(gè)環(huán)節(jié)不能完全注意到羊羔的生長狀況，就極有可能導(dǎo)致患有傳染病的羊羔不能及時(shí)隔離，羊羔群受到比較大范圍傳染，造成無法挽回的損失。所以養(yǎng)殖人員在產(chǎn)羔、育羔各個(gè)環(huán)節(jié)的工作安排中，都需要注重科學(xué)性，合理把控羔羊的生長和發(fā)育。

尤其是在斷奶后，羔羊最容易出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)的時(shí)期，飼養(yǎng)員更應(yīng)該注重羔羊的飼喂。在母羊分娩后奶水不足的情況下，應(yīng)該及時(shí)補(bǔ)給袋裝鮮奶，將羊奶和鮮奶按照合適的比例混合，并且添加5g 活性酵母，減少羔羊因不是母乳而拒絕進(jìn)食、適口性差以及腹瀉等情況出現(xiàn)的可能性，幫助羔羊順利過渡到完全進(jìn)食羊飼料的階段。

6 結(jié)論

通過相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果可以看出，大腸桿菌具有致病性是引起該場羔羊腹瀉的病原之一。養(yǎng)殖戶需要結(jié)合規(guī)?；驁鲳B(yǎng)殖的實(shí)際情況，明確其腹瀉原因，通過采取針對性、科學(xué)、有效的防治措施，才能有效預(yù)防羔羊腹瀉現(xiàn)象，提升羊場的養(yǎng)殖效益。