伸筋草多糖鎮(zhèn)痛功效成分的分離鑒定

田家寶 徐德平

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

伸筋草(LycopodiumjaponicumThunb)為石松科植物石松的干燥全草，民間用于祛風(fēng)除濕，舒筋活絡(luò)，關(guān)節(jié)酸痛，屈伸不利，中老年人常將伸筋草、益智仁、遠(yuǎn)志混合后泡茶，泡酒，東南沿海地區(qū)也常將伸筋草與肉類搭配作為佐料煲湯?，F(xiàn)代藥理研究[1-3]表明，伸筋草具有鎮(zhèn)痛、消炎、調(diào)節(jié)免疫、清除自由基、參與生物活性的調(diào)節(jié)等作用。關(guān)于伸筋草鎮(zhèn)痛作用的報道，國內(nèi)外目前主要集中在伸筋草粗提物的鎮(zhèn)痛作用和伸筋草的化學(xué)成分上，如：曾元兒等[4]對伸筋草不同提取部位的藥效進(jìn)行對比研究認(rèn)為，伸筋草的鎮(zhèn)痛功效主要存在于氯仿、正丁醇和水提取部位；李墨嬌等[5]對伸筋草的化學(xué)成分研究主要集中在三萜類和生物堿上。但關(guān)于伸筋草提取物鎮(zhèn)痛的具體功效成分未見報道。

試驗擬通過小鼠醋酸扭體反應(yīng)[6]和熱板模型[7]，利用水提醇沉[8]和多種層析分離法，篩選和分離伸筋草起鎮(zhèn)痛效果的主要組分，以期為其綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

伸筋草：安徽亳州中藥市場；

無水葡萄糖、無水乙醇、濃硫酸、苯酚、冰醋酸等：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

Sephacry S-400色譜柱：美國GE Healthcare公司；

硅膠板：GF254，山東煙臺芝罘化工廠；

Sephadex G-100色譜柱：瑞典Pharmaeia公司；

AB-8型大孔吸附樹脂：天津南開大學(xué)化學(xué)工廠；

HW-55F色譜柱：日本TOSOH公司；

DEAE-纖維素色譜柱：日本TOSOH公司；

UltrahydrogelTMLinear色譜柱：美國Waters公司；

雌雄ICR小鼠：體重18～22 g，上海斯萊克動物實驗有限公司；

試驗用水選用去離子水。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

磨粉機(jī)：GLF-205型，浙江省溫州市創(chuàng)立藥材器械廠；

紫外分光光度計：UV-2450型，日本島津公司；

萃取罐：RAT-100型，無錫申科儀器有限公司；

恒流泵：SYB106-100型，天津市科器高新技術(shù)公司；

暗室紫外投射儀：ZF-90型，上海顧順電光儀器廠；

色譜儀：GPC型，日本島津公司；

核磁共振儀：Avance500MHz型，德國Bruke公司；

示差檢測器：RID-10A型，日本島津公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 伸筋草提取物制備與粗分離 將伸筋草粉碎，經(jīng)40目分樣篩篩分得10 kg伸筋草粉末，與體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇按料液比(m伸筋草粉∶V乙醇)1∶10 (g/mL)混合，置于100 L雙層反應(yīng)釜中提取，反應(yīng)溫度設(shè)為65 ℃，勻速攪拌4 h，靜置過濾，依上述步驟重復(fù)提取2次，減壓濃縮[9]所得濾液，即為伸筋草乙醇提取物，將其于-20 ℃冷凍保存。依上述步驟，伸筋草醇提所得濾渣加入去離子水100 L，于反應(yīng)釜中勻速攪拌4 h，在反應(yīng)溫度65 ℃的條件下重復(fù)提取2次，靜置3 h后抽濾，取濾液減壓濃縮至5 L，合并濃縮液即為伸筋草水提物，4 ℃下冷藏保存。

取適量伸筋草水提物加入3倍無水乙醇，邊加邊攪拌，靜置過夜，重復(fù)3次，過濾得醇沉相(A)、醇溶相(B)。于AB-8型大孔樹脂柱(10 cm×150 cm)中上適量醇提物，利用梯度洗脫法，以水、40%乙醇、80%乙醇和無水乙醇為洗脫劑順序洗脫。洗脫過程采用薄層色譜法[10](TLC)檢測成分并分為4部分，水洗脫(C)、40%乙醇洗脫(D)、80%乙醇洗脫(E)和無水乙醇洗脫(F)部分。將各組分分別減壓濃縮后冷凍保存。

1.2.2 伸筋草粗分組分的鎮(zhèn)痛作用

(1) 醋酸扭體測反應(yīng)發(fā)生時間：選取70只4周齡SPF級ICR小鼠，雌雄各半，體重(20±2) g。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為7組，每組10只，雌雄各半。試驗組為A、B、C、D、E、F，每日以1.0 g/kg劑量灌胃[11]，空白對照為K，灌同體積的蒸餾水，連續(xù)灌胃3 d，試驗前12 h禁食不禁水。試驗在23～25 ℃下進(jìn)行，試驗組在灌胃給藥1 h 后，腹腔注射體積分?jǐn)?shù)0.5%醋酸，注射劑量為0.2 mL/只，試驗在注射后開始，10 min內(nèi)小鼠第一次扭體出現(xiàn)時間記為反應(yīng)時間，超過10 min以10 min記錄。

(2) 熱板法測舔足時間：于熱板上測定ICR雌性小鼠(18±2) g舔足閾值[12]，小鼠為4周齡SPF級，熱板溫度(55±5) ℃，舔足閾值應(yīng)在5～30 s，共選取70只分為7組，每組10只，試驗組為A、B、C、D、E、F，連續(xù)3 d以每日1.0 g/kg劑量灌胃，去離子水連續(xù)3 d以每日1.0 g/kg劑量灌胃，空白對照為K，試驗前12 h禁食不禁水。試驗在各組小鼠灌胃給藥后開始，測定各組小鼠30，45，60 min 的舔足時間，若60 s仍無反應(yīng)者，將其取出以免燙傷，該鼠以60 s計。

1.2.3 醇沉相活性組分的分離 將含有鎮(zhèn)痛功效的醇沉相A組分減壓濃縮后，加入適量的去離子水至適宜體積并上樣至DEAE柱(5 cm×100 cm)，流速恒定5 mL/min，洗脫液為去離子水和0.05，0.10 mol/L的NaCl溶液，自動收集器收集洗脫液每管10 mL，并采用苯酚硫酸法[13]檢測洗脫液成分，將相同組分收集合并得水洗脫G、鹽洗脫H。

1.2.4 DEAE柱不同洗脫組分活性的檢測 按1.2.2方法對DEAE柱分離得到的G、H兩個組分展開動物試驗，分析各組鎮(zhèn)痛作用。

1.2.5 鎮(zhèn)痛活性成分的分離 取40 mL具有鎮(zhèn)痛活性的水洗脫組分G，質(zhì)量濃度為40 mg/mL，去離子水以2 mL/min 洗脫通過HW-55F(3 cm×100 cm)色譜柱，收集洗脫液每管10 mL，采用苯酚硫酸法分析組分，將相同組分合并收集。取40 mL主要組分G1上Sephacry S-400(3 cm×100 cm)凝膠色譜柱，質(zhì)量濃度為40 mg/mL，去離子水洗脫，流速2 mL/min，苯酚硫酸法跟蹤監(jiān)測組分。

1.2.6 多糖純度鑒定 多糖P加水配制5 mg/mL溶液，分光光度計于200～400 nm測其吸光光度[14]。于Sephadex G-100 (3 cm×100 cm)色譜柱中通過多糖P溶液，去離子水以2 mL/min速度洗脫，收集洗脫液采用苯酚硫酸法鑒別純度。

1.2.7 高效凝膠過濾色譜測定分子量 準(zhǔn)確稱取1 mg多糖P，加入去離子水配制質(zhì)量濃度為5 mg/mL的多糖P溶液，進(jìn)樣量20 μL，上UltrahydrogelTMLinear(7.8 mm×300 mm)色譜柱測定分子量[15]，流速0.5 mL/min，柱溫40 ℃。

1.2.8 多糖P的結(jié)構(gòu)鑒定 取適量多糖P，用重水溶解，進(jìn)行1H-NMR、13CNMR、13DEPT-NRM光譜數(shù)據(jù)分析，分析其結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 伸筋草粗分組分鎮(zhèn)痛活性

2.1.1 扭體反應(yīng)時間 由表1可知，醇溶相B組比空白組扭體反應(yīng)時間顯著延長，鎮(zhèn)痛效果顯著(P<0.05)。醇沉相A組較空白組，扭體反應(yīng)時間顯著延長，鎮(zhèn)痛效果極顯著(P<0.01)，且A組較其他組均有顯著性差異(P<0.05)，A組中存在具有鎮(zhèn)痛功效的成分且能在短時間內(nèi)迅速鎮(zhèn)痛。其他組較空白組無顯著差異，對醋酸扭體反應(yīng)時間無明顯延長，無顯著鎮(zhèn)痛作用。

表1 伸筋草粗分組分對小鼠醋酸扭體反應(yīng)時間的影響?

2.1.2 熱板法測小鼠舔足時間 由表2可知，各給藥組中，給藥30 min后，A組小鼠舔足時間明顯提高，鎮(zhèn)痛效果顯著(P<0.01)，并且該組在給藥45 min后舔足時間提高明顯，鎮(zhèn)痛效果顯著(P<0.05)，而給藥60 min后舔足時間略有提高，無顯著鎮(zhèn)痛效果，說明醇沉相A給藥30 min 后鎮(zhèn)痛效果最好，隨時間的延長鎮(zhèn)痛效果減弱。其他組無顯著鎮(zhèn)痛效果。結(jié)合表1、表2可知，醇沉相A較醇溶相B的鎮(zhèn)痛效果更好。

2.2 DEAE色譜柱各洗脫組鎮(zhèn)痛效果的檢測

由圖1可知，醇沉相A過DEAE柱，洗脫曲線中出現(xiàn)2個洗脫峰，且只有G是水洗脫物，可確定多糖組分主要存在水洗脫的G組，而NaCl溶液洗脫部分H組含量較少。兩組分鎮(zhèn)痛效果見表3、表4。由表3可知，在各給藥組中發(fā)現(xiàn)G組較空白組醋酸扭體反應(yīng)時間顯著延長，有顯著鎮(zhèn)痛效果(P<0.05)。H組較空白組，醋酸扭體反應(yīng)時間有一定的延長作用但無顯著性差異，無顯著鎮(zhèn)痛效果。

由表4可知，在各給藥組中G組在給藥30 min后，舔足時間提高明顯，有極顯著的鎮(zhèn)痛效果(P<0.01)，在給藥45 min后舔足時間明顯提高，鎮(zhèn)痛效果極顯著(P<0.01)，在給藥60 min后，舔足時間提高明顯，鎮(zhèn)痛效果顯著(P<0.05)。G組在給藥30 min后鎮(zhèn)痛效果最好，隨著時間的延長鎮(zhèn)痛效果減弱。其他組無顯著鎮(zhèn)痛效果。

2.3 伸筋草鎮(zhèn)痛活性多糖類的分離

2.3.1 凝膠色譜柱分離結(jié)果 G組分經(jīng)HW-55F凝膠色譜柱進(jìn)一步分離得到G1、G2組分，所得洗脫曲線如圖2所示，將含量極少無法支撐繼續(xù)分離的G2組分排除，選取含量較大的G1組分進(jìn)一步分離。G1經(jīng)Sephacryl S-400凝膠色譜柱多次分離純化，得多糖P，如圖3所示，多糖P有且僅有一對稱峰，表明P為均一多糖[16]。

表2 伸筋草粗分組分對小鼠舔足時間的影響?

圖1 DEAE纖維素柱洗脫曲線Figure 1 Elution curve of DEAE cellulose column

表3 DEAE洗脫組分對小鼠醋酸扭體反應(yīng)時間的影響?

表4 DEAE洗脫組分對小鼠舔足時間的影響?

2.3.2 多糖純度鑒定及其分子量的測定 于260～280 nm 下，紫外吸光光度顯示多糖P溶液無吸收峰，可得多糖P不含蛋白質(zhì)和核酸或含量極低，是單一化合物。經(jīng)高效凝膠滲透色譜測得多糖P相對分子量為3.24×105Da。

2.3.3 NMR分析 由圖4可知，δ4.84，4.78處為端基H信號，由于與重水的峰相互重迭，不能確定H信號的積分，δ1.15處有一個甲基H信號，說明含有甲基，但多糖H信號復(fù)雜相互重迭難以進(jìn)一步確定甲基歸屬。伸筋草多糖13CNMR如圖5所示，該多糖在δ176.3處含有一個羧基，表明為酸性多糖，而在DEAE柱用水洗脫下來應(yīng)為中性多糖，δ23.1處有一甲基信號，從化學(xué)位移看應(yīng)為乙酰基的甲基，得出該多糖含有乙?；?。δ104.0，101.9，101.4處有3個碳信號，可以判定有3個糖殘基存在且都為葡萄糖。從δ104.0，79.5，77.6，73.4，71.3，63.3處的碳信號豐度得出，這些碳信號為主鏈，并以1→4鍵相連，δ83.7 處碳信號說明有1→2健存在，從豐度看為側(cè)鏈，δ67.5 處碳信應(yīng)為C6信號，由于化學(xué)位移向低場移，推斷乙?；B在該位點。異頭碳在β構(gòu)型的化學(xué)位移值一般大于103，δ104.0處是多糖P主鏈C1的化學(xué)鍵位移值，所以可推測為β構(gòu)型，故該多糖為主鏈為葡萄糖以1→4鍵相連，β構(gòu)型，側(cè)鏈連在2位上。由圖6可知，δ69.7 處的碳為CH2信號，表明C6位向低場移動，可以得出乙?；B在6位上，具體結(jié)構(gòu)與數(shù)量還需進(jìn)一步研究。

圖2 HW-5F凝膠柱洗脫曲線Figure 2 Elution curve of HW-55F gel colum

圖3 Sephacryl S-400凝膠柱洗脫曲線Figure 3 Elution curve of Sephacryl S-400 gel column

圖4 多糖P 1H-NMR圖譜Figure 4 1H-NMR spectrum of polysaccharide P

圖5 多糖P 13CNMR圖譜Figure 5 13CNMR spectrum of polysaccharide P

圖6 多糖P 13DEPT-NRM圖譜Figure 6 13DEPT-NRM spectrum of polysaccharide P

3 結(jié)論

伸筋草經(jīng)水提醇沉后，其醇沉相具有顯著的鎮(zhèn)痛作用，該組分經(jīng)DEAE柱分離后發(fā)現(xiàn)，鎮(zhèn)痛功效主要存在于多糖中，對其進(jìn)一步分離得到1個主要多糖P，通過多糖P的13C-NMR譜分析可以推測多糖P的框架是以(1→4)-β-葡萄糖為主鏈，存在側(cè)鏈與?；?，且其側(cè)鏈連在2號位，乙酰基連在6號位。

有研究[17]認(rèn)為伸筋草的氯仿與正丁醇提取部分是起鎮(zhèn)痛作用的主要部位。試驗結(jié)果表明，伸筋草多糖是起鎮(zhèn)痛作用的主要成分，有著良好的外周鎮(zhèn)痛作用和中樞鎮(zhèn)痛作用，主要是因為通過熱板法和扭體法觀察外周鎮(zhèn)痛作用和中樞鎮(zhèn)痛作用[18]，發(fā)現(xiàn)在此次試驗中小鼠熱板舔足時間顯著提高，醋酸扭體發(fā)生時間顯著延長。免疫器官指數(shù)和免疫細(xì)胞因子[19]的改善可能是伸筋草多糖具有鎮(zhèn)痛功效的主要原因，具體機(jī)制還需深入研究。