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    高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定柚子中的4種黃酮苷和檸檬苦素

    2021-04-08 11:29:14黃雪松
    食品與機(jī)械 2021年3期
    關(guān)鍵詞:苦素蕓香橙皮

    張 珊 黃雪松

    (暨南大學(xué)理工學(xué)院,廣東 廣州 510632)

    二氫黃酮類化合物(包括蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷)[1]和三萜內(nèi)酯化合物檸檬苦素均為柚子中的活性成分,其中柚皮苷和檸檬苦素為苦味物質(zhì),前者造成“直接”苦味,后者呈現(xiàn)“后苦”現(xiàn)象[2-3],兩類物質(zhì)的含量是衡量柚子加工產(chǎn)品質(zhì)量和保健功效的重要品質(zhì)指標(biāo),因此兩類物質(zhì)的測(cè)定方法成為相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

    但現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)及報(bào)道中,這兩類物質(zhì)都是分別測(cè)定的,如:GB 1886.262—2016僅規(guī)定了柚皮苷的高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)測(cè)定方法;NY/T 2014—2011規(guī)定了同時(shí)測(cè)定橙皮苷、柚皮苷的HPLC方法;朱露等[4]提出同時(shí)測(cè)定枳實(shí)中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的HPLC方法;蔡艷芳等[5]提出測(cè)定枳實(shí)中檸檬苦素的HPLC方法,迄今尚未見檸檬苦素與黃酮類物質(zhì)同時(shí)測(cè)定的報(bào)道。試驗(yàn)擬以柚子幼果和柚子果汁為樣品,研究一種方便、快速、準(zhǔn)確且同時(shí)測(cè)定蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素5種成分的HPLC方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    白肉蜜柚幼果(直徑小于5 cm)、白肉蜜柚:廣東順興種養(yǎng)股份有限公司;

    蕓香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品:成都普菲生物技術(shù)有限公司;

    柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品:上海麥克林生化科技有限公司;

    檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品:上海源葉生物科技有限公司;

    甲醇、乙腈:色譜純:瑞典歐森巴克化學(xué)公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    高效液相色譜儀:LC-20A nence型,配SPD-M20A紫外檢測(cè)器,島津(廣州)檢測(cè)技術(shù)有限公司;

    冷凍干燥機(jī):SCIENTZ-10N型,寧波新芝生物科技股份有限公司;

    二兩裝高速中藥粉碎機(jī):111型,瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司;

    高速離心機(jī):HC-3514型,安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備 精確稱取一定量的蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷分別用甲醇溶解于50 mL容量瓶中并定容,制成質(zhì)量濃度分別為1.053,1.363,1.102,1.096 g/L的單標(biāo)溶液,測(cè)定其出峰時(shí)間及紫外吸收光譜。

    精確稱取一定量蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素,用甲醇溶解于同一50 mL容量瓶中并定容,制成質(zhì)量濃度分別為1.080,1.146,1.104,1.176,0.812 g/L 的混標(biāo)母液,用甲醇倍比稀釋至0.50,0.25,1.25×10-1,6.25×10-2,3.13×10-2,1.56×10-2,7.81×10-3,3.91×10-3,1.95×10-3,9.77×10-4倍,測(cè)定其濃度。

    1.3.2 樣品制備 精確稱取凍干柚子粉末(100目)樣品0.107 7 g于50 mL容量瓶中,用甲醇定容,超聲提取30 min,用0.45 μm微孔濾膜過濾,待測(cè)。

    取新鮮柚子以果肉榨汁,取1 g柚子汁溶于10 mL甲醇,超聲提取30 min后,6 000 r/min離心10 min,取上清液,將上清液與甲醇(V上清液∶V甲醇)以1∶50的比例再次混合,靜置30 min,10 000 r/min離心10 min,取上清液,用0.45 μm微孔濾膜過濾后待測(cè)。

    1.3.3 HPLC梯度洗脫方法 參考朱露等[4]和蔡艷芳等[5]的方法,設(shè)計(jì)如表1中的5種方法。根據(jù)所獲HPLC色譜圖從中選出最適宜的方法予以評(píng)價(jià)。

    1.3.4 HPLC測(cè)定條件 色譜柱Bio-Bond 5 μm C18(4.6 mm×250 mm);流動(dòng)相為乙腈(A)和水(B),流速1 mL/min,進(jìn)樣量10 μL,柱溫40 ℃。配二極管陣列紫外檢測(cè)器(PDA),分別在283 nm和220 nm檢測(cè)4種黃酮苷和檸檬苦素。

    混標(biāo)溶液洗脫條件由表1中的5種洗脫方法逐個(gè)試用,單標(biāo)溶液洗脫條件和柚子樣品的洗脫條件為表1中選取的最優(yōu)方法。

    1.3.5 重復(fù)性的測(cè)定 取1.3.2中的供試品溶液,制成平行樣品5份,以1.3.4中的HPLC條件進(jìn)行測(cè)定,每份樣品連續(xù)進(jìn)樣3次,記錄峰面積,分別計(jì)算5種成分的含量和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

    1.3.6 精確度與加樣回收率的測(cè)定 精密稱取201.5 mg柚子幼果粉末,置于50 mL容量瓶中,分別加入不同質(zhì)量的5種標(biāo)準(zhǔn)品,定容。以1.3.2中的方法處理后,制成平行樣品5份,在1.3.4中的HPLC條件下進(jìn)行測(cè)定,每份樣品連續(xù)進(jìn)樣3次,記錄峰面積,按式(1)計(jì)算平均回收率。用平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)評(píng)價(jià)精確度高低。

    (1)

    式中:

    R——回收率,%;

    m1——測(cè)得量,mg;

    m2——樣品中成分質(zhì)量,mg;

    m3——加標(biāo)量,mg。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 測(cè)定條件的確定

    2.1.1 測(cè)定波長(zhǎng) 圖1分別為蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素的紫外吸收光譜圖。由圖1(a)~(d)可知,蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的最大吸收波長(zhǎng)分別為282,282,283,283 nm,為操作與計(jì)算方便,選取283 nm為4種黃酮苷的紫外吸收波長(zhǎng)。由圖1(e)可知,當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)<240 nm時(shí),波長(zhǎng)越小,檸檬苦素的響應(yīng)值越大,但考慮到既能檢測(cè)到檸檬苦素又盡可能減少雜質(zhì)或溶劑導(dǎo)致的紫外吸收誤差,選擇220 nm 為測(cè)定檸檬苦素的吸收波長(zhǎng)。據(jù)此,定量測(cè)定上述5種成分時(shí),檸檬苦素選擇采用220 nm時(shí)的吸收峰面積,而4種黃酮?jiǎng)t采用283 nm測(cè)定時(shí)的吸收峰面積。

    表1 5種不同的洗脫程序

    圖2(a)~圖2(e)分別為蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素的單標(biāo)在方法5的洗脫程序下所獲色譜圖,圖2(f)和圖2(g)為上述5種物質(zhì)的混標(biāo)在方法5的洗脫程序下所獲色譜圖。由單標(biāo)和混標(biāo)的出峰時(shí)間對(duì)比分析可知,圖2(f)和圖2(g)中峰1~5分別為蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素。

    圖1 4種黃酮苷和檸檬苦素的紫外吸收光譜圖Figure 1 UV absorption spectra of four flavonoid glycosides and limonin

    1. 蕓香柚皮苷 2. 柚皮苷 3. 橙皮苷 4. 新橙皮苷 5. 檸檬苦素圖2 5種標(biāo)準(zhǔn)品在283 nm和220 nm處的色譜圖Figure 2 Chromatograms of 5 standards at 283 nm and 220 nm

    2.1.2 最佳HPLC梯度洗脫條件 如圖3所示,逐步提高流動(dòng)相中乙腈比例,可使檸檬苦素的出峰時(shí)間提前。檸檬苦素出峰時(shí)間由方法1中21.15 min提前至方法5中15.84 min[圖2(g)],提前了5.31 min,這是因?yàn)镃18反相色譜柱的填料以硅膠為基質(zhì),表面鍵合有極性相對(duì)較弱的官能團(tuán)。因此,選擇系統(tǒng)洗脫時(shí)間最短的方法5測(cè)定4種物質(zhì);在該條件下,各成分的分離度均大于1.5,滿足測(cè)定要求[6]。

    2.2 測(cè)定方法的可靠性

    2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、檢測(cè)限和定量限 在1.3.4的條件下,對(duì)不同質(zhì)量濃度的4種黃酮苷與檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定。以各組分的峰面積為縱坐標(biāo)(y),對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到5種物質(zhì)的線性方程(見表2)。信噪比(S/N)為3時(shí)所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度即為檢出限(LOD),信噪比為10時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量下限(LOQ)[7]。

    2.2.2 重復(fù)性 按照1.3.5的處理方法,得出表3的重復(fù)性進(jìn)樣結(jié)果,其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于2%,表明此種方法重復(fù)性良好。

    2.2.3 精確度與加樣回收率 按照1.3.6的處理方法,得出表4中一系列結(jié)果,5種成分的平均回收率范圍為98.47%~99.81%,RSD均小于2%,表明此種方法測(cè)量精確,回收率良好。

    2.3 柚子幼果與柚子汁中5種物質(zhì)的含量

    根據(jù)上述測(cè)定方法與標(biāo)準(zhǔn)曲線,測(cè)定按照1.3.5準(zhǔn)備的柚子樣品,測(cè)得柚子幼果(圖4)中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8.49%,8.05%,1.30%,1.31%,1.46%;測(cè)得柚子汁(圖5)中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.41%,2.63%,0.23%,0.16%,0.78%。

    1. 蕓香柚皮苷 2. 柚皮苷 3. 橙皮苷 4. 新橙皮苷 5. 檸檬苦素圖3 不同洗脫條件下的色譜圖(220 nm)Figure 3 Comparison of tailing of limonoid peaks under different elution conditions (220 nm)

    表2 5種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限、定量限?

    由圖4、圖5可知:4種黃酮物質(zhì)分離度高,峰型好;但檸檬苦素峰型受到樣品中雜質(zhì)的影響,有一定的偏差,需要注意選擇積分曲線;由表5可知:不同品種、不同生長(zhǎng)期和不同部位的柑橘作物中成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)各不相同。

    盡管如此,通過上述方法一次測(cè)定且同時(shí)獲得上述5種成分的含量是非常方便的。此前,人們或分為2~3次分別測(cè)量5種物質(zhì),或僅測(cè)其中的3~4種,試驗(yàn)所建立的HPLC方法可方便地同時(shí)測(cè)得其含量,為測(cè)定柑橘水果中類黃酮和苦味物質(zhì)節(jié)約大量的成本與時(shí)間。

    表3 5種成分的重復(fù)進(jìn)樣結(jié)果

    表4 5種成分的加樣回收率?

    1. 蕓香柚皮苷 2. 柚皮苷 3. 橙皮苷 4. 新橙皮苷 5. 檸檬苦素圖4 柚子幼果在283 nm和220 nm處的色譜圖Figure 4 Chromatograms of young pomelo sample solution at 220 nm and 283 nm

    1. 蕓香柚皮苷 2. 柚皮苷 3. 橙皮苷 4. 新橙皮苷 5. 檸檬苦素圖5 柚子汁在283 nm和220 nm處的色譜圖Figure 5 Chromatograms of young pomelo sample solution at 283 nm and 220 nm

    表5 不同柚子品種與部位的5種成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)

    3 結(jié)論

    試驗(yàn)建立的高效液相色譜法在20 min內(nèi),利用PDA檢測(cè)器在283 nm與220 nm分別完成了對(duì)柚子幼果及柚子果汁中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素5種關(guān)鍵的黃酮類和苦味物質(zhì)的同時(shí)定量測(cè)定,測(cè)得柚子幼果中5種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8.49%,8.05%,1.30%,1.31%,1.46%,柚子果汁中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和檸檬苦素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.41%,2.63%,0.23%,0.16%,0.78%。但最終確定的方法中,新橙皮苷與檸檬苦素峰[圖2(g)]之間的時(shí)間間隔仍然較長(zhǎng),后續(xù)可使用不同流動(dòng)相組分或洗脫方法予以減少。

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