Rho激酶抑制劑聯(lián)合葛根素通過抑制TGF?β1/Smads信號通路和炎癥反應(yīng)來減輕缺氧誘導(dǎo)肺動脈高壓對肺血管的損傷

陳晨 張妍蓓

1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年呼吸與危重癥（合肥230022）；2安徽省胸科醫(yī)院結(jié)核科（合肥230022）

許多肺部疾病均能引起肺部持續(xù)性的低氧環(huán)境，從而發(fā)展為缺氧性肺動脈高壓［1-3］，死亡率極高［4］。研究發(fā)現(xiàn)通過抑制TGF?β1/Smads 通路相關(guān)因子的表達(dá)能夠緩解缺氧性肺動脈高壓［5］，炎癥和重塑會使血管發(fā)生永久性的結(jié)構(gòu)改變，而半乳糖凝集素?3（galectin?3，Gal?3）的高表達(dá)能夠增加平滑肌細(xì)胞的非自然增殖和存活［6］。近年來研究發(fā)現(xiàn)Rho 激酶抑制劑法舒地爾在慢性阻塞性肺疾病相關(guān)性肺動脈高壓中有一定作用［7］。國內(nèi)對于中藥治療缺氧性肺動脈高壓的研究越來越多，研究發(fā)現(xiàn)黃酮類槲皮素能減輕肺動脈高壓的嚴(yán)重程度［8］，丹參通過抑制肺動脈平滑肌細(xì)胞過度增殖和過度激活RhoA/Rho 信號通路來預(yù)防大鼠缺氧性肺動脈高壓［9］，葛根素誘導(dǎo)人肺動脈平滑肌細(xì)胞線粒體依賴性凋亡［10］，但是對于Rho 激酶抑制劑法舒地爾聯(lián)合葛根素治療缺氧性肺動脈高壓的研究未見報道。因此研究Rho 激酶抑制劑法舒地爾聯(lián)合葛根素通過TGF?β1/Smads 通路和炎癥反應(yīng)來減輕缺氧誘導(dǎo)肺動脈高壓對肺血管的損傷程度具有重要的意義，對于臨床治療缺氧性肺動脈高壓提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組選取體質(zhì)量為180～200 g的SD 大鼠60 只（最后納入實驗的例數(shù)，HPH 模型成功率為72%），隨機(jī)分成5 組：正常對照組、模型組、葛根素組、法舒地爾組和法舒地爾與葛根素聯(lián)合治療組。

將模型組、葛根素組、法舒地爾組和法舒地爾與葛根素聯(lián)合治療組大鼠分別放入常壓缺氧艙內(nèi)缺氧，缺氧期間艙內(nèi)氧濃度控制在10%，每天缺氧8 h，連續(xù)21 d［11］。各組大鼠缺氧放置前30 min進(jìn)行腹腔注射，葛根素組大鼠注射葛根素注射液20 mg/kg，法舒地爾組大鼠注射法舒地爾注射液15 mg/kg，聯(lián)合治療組大鼠注射葛根素注射液20 mg/kg+法舒地爾注射液15 mg/kg，對照組和模型注射相當(dāng)體積的0.9%NaCl 溶液。

1.2 實驗方法

1.2.1 血流動力學(xué)指標(biāo)的測定將麻醉后的大鼠仰臥位固定在手術(shù)板上，用測壓導(dǎo)管沿著大鼠勁外靜脈經(jīng)右心房插入至右心室及肺動脈，記錄右心室收縮壓（RVSP）、平均肺動脈壓（mPAP）、肺動脈收縮壓（PASP）和肺小動脈楔壓（PAWP）。

1.2.2 右心室肥厚指數(shù)的測定開胸取心臟，采集并稱取右心室（RV）和左心室加室間隔（LV+S）的重量，計算右心室肥厚指數(shù)（RVHI）=RV/（LV+S）。

1.2.3 HE 染色法將石蠟切片脫蠟至水后，沒入Harris 蘇木素染液，蒸餾水洗后用1%的鹽酸酒精分化，0.6%氨水返藍(lán)，伊紅染液中染色。脫水透明后，用中性樹膠封片保存。用光學(xué)顯微鏡鏡觀察肺血管形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4 qPCR 檢測法肺組織被迅速分離后放于液氮中。采用Trizol 法提取樣品中總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，擴(kuò)增目的基因（表1）。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.5 Western blot檢測法提取總蛋白，采用SDS?PAGE 分離蛋白。隨后轉(zhuǎn)印蛋白到PVDF 膜上。5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗（兔抗鼠TGF?β1、Smad2、Smad4 和Smad7 多克隆抗體）4 ℃孵育過夜，二抗（HRP 標(biāo)記的山羊抗兔）室溫孵育1 h。采用ECL顯色法掃描獲得圖片。通過Image J 軟件對目的條帶進(jìn)行灰度分析，做統(tǒng)計學(xué)分析。

1.2.6 免疫組化檢測法將肺組織放入4 ℃4%多聚甲醛中固定6 h，再放入30%蔗糖4 ℃過夜，然后將組織包埋成石蠟塊，切片、爬片、脫臘后按照免疫組化試劑盒進(jìn)行免疫組化，置于倒置顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間多重比較采用單因素方差分析，采用最小顯著性差異（LSD）檢驗作為多重比較的事后分析。方差不整齊時進(jìn)行Dunnett′t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 法舒地爾聯(lián)合葛根素對HPH大鼠血流動力學(xué)和右心室重構(gòu)指標(biāo)的影響模型組RVSP、mPAP、PASP、PAWP和RVHI值明顯高于Sham組（P＜0.05）。與模型組、葛根素組和法舒地爾組比較，聯(lián)合治療組的RVSP、mPAP、PASP、PAWP 和RVHI 值顯著降低（P＜0.05）。見表2。

2.2 法舒地爾聯(lián)合葛根素對HPH 大鼠肺動脈血管壁的影響見圖1，對照組組肺動脈血管壁清晰、管壁薄、管腔大、細(xì)胞分布均勻、血管周圍無炎性浸潤。與對照組相比，模型組肺動脈血管壁明顯增厚、平滑肌增生、管腔變狹窄、細(xì)胞核增多、血管周圍出現(xiàn)炎性浸潤。與模型組相比，葛根素組、法舒地爾組和聯(lián)合治療組肺動脈血管壁厚度下降、管腔變小、細(xì)胞形態(tài)趨于正常、血管周圍炎性浸潤程度下降。

表2 各組大鼠血流動力學(xué)和右心室重構(gòu)指標(biāo)比較Tab.2 Comparison of hemodynamics and right ventricular remodeling in each group ±s

表2 各組大鼠血流動力學(xué)和右心室重構(gòu)指標(biāo)比較Tab.2 Comparison of hemodynamics and right ventricular remodeling in each group ±s

注：與對照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05；與葛根素組比較，cP ＜0.05；與法舒地爾組比較，dP ＜0.05

組別對照組模型葛根素組法舒地爾組聯(lián)合治療組RVSP（mmHg）16.89±0.85 39.45±1.25a 28.21±2.01b 31.12±0.85b 21.15±1.24bcd mPAP（mmHg）14.52±1.05 33.28±0.87a 27.68±0.92b 26.52±1.25b 20.94±2.07bcd PASP（mmHg）18.85±2.84 46.58±4.18a 38.94±3.05b 36.72±1.87b 26.84±0.92bcd PAWP（mmHg）13.37±0.82 28.64±2.35a 25.54±1.58b 26.37±1.40b 18.82±0.91bcd RVHI（%）21.47±1.24 45.42±1.22a 39.85±0.91b 36.17±1.05b 28.62±2.41bcd

圖1 法舒地爾聯(lián)合葛根素對HPH 大鼠肺動脈血管壁的影響Fig.1 Effect of fasudil combined with puerarin on pulmonary artery wall in HPH rats

2.3 法舒地爾聯(lián)合葛根素對HPH 大鼠TGF?β1/Smads 通路的影響見圖2，與模型組、葛根素組和法舒地爾組相比較，聯(lián)合治療組TGF?β1、Smad2、Smad4 和Smad7 蛋白的表達(dá)量顯著下降（P＜0.05）。

圖2 法舒地爾聯(lián)合葛根素對HPH 大鼠TGF?β1/Smad2/Smad4/Smad7 的影響Fig.2 Effects of fasudil combined with puerarin on TGF? β1/Smad2/Smad4/Smad7 in HPH rats

2.4 法舒地爾聯(lián)合葛根素對HPH 大鼠炎癥因子的影響見圖3，與模型組、葛根素組和法舒地爾組相比較，聯(lián)合治療組iNOS、COX?2、IL?6 和HIF?1α mRNA 的表達(dá)量顯著下降（P＜0.05）。

2.5 法舒地爾聯(lián)合葛根素對HPH 大鼠Gal?3 的影響見圖4，與模型組、葛根素組和法舒地爾組相比較，聯(lián)合治療組Gal?3 蛋白的表達(dá)量顯著下降（P＜0.01）。

圖3 法舒地爾聯(lián)合葛根素對HPH 大鼠iNOS/COX?2/IL?6/HIF?1α mRNA 的影響Fig.3 Effects of fasudil combined with puerarin on iNOS/COX?2/IL?6/HIF?1α mRNA in HPH rats

3 討論

圖4 法舒地爾聯(lián)合葛根素對HPH 大鼠Gal?3 蛋白的影響Fig.4 Effects of fasudil combined with puerarin on Gal?3 protein in HPH rats

本研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比，模型組右心室收縮壓和右心肥厚指數(shù)顯著升高，且肺動脈血管壁明顯增厚、平滑肌增生、管腔變狹窄、細(xì)胞核增多、血管周圍出現(xiàn)炎性浸潤等，說明缺氧誘導(dǎo)的肺動脈高壓會改變心臟右心室壓力，加重右心室負(fù)荷［12-13］的同時，導(dǎo)致肺循環(huán)阻力增大［14］，這與AGARWAL等［15］的研究結(jié)果相似。本研究還發(fā)現(xiàn)與模型組、葛根素組和法舒地爾組相比較，聯(lián)合治療組HPH大鼠RVSP、mPAP、PASP、PAWP、PVHI 和Gal?3 蛋白的表達(dá)量下降、脈血管壁厚度下降、管腔變小、細(xì)胞形態(tài)趨于正常、血管周圍炎性浸潤程度下降，提示法舒地爾聯(lián)合葛根素對大鼠缺氧誘導(dǎo)的肺血管損傷具有很好的修護(hù)作用，且效果優(yōu)于法舒地爾和葛根素單獨治療。Gal?3 的相對表達(dá)量能夠預(yù)測心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險及治療效果［16］，其高表達(dá)能夠增加平滑肌細(xì)胞的非自然增值和存活［17］。

進(jìn)一步檢測了炎癥相關(guān)因子的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)模型組炎癥相關(guān)因子iNOS、COX?2、IL?6 和HIF?1α mRNA 等炎癥因子的相對表達(dá)量顯著升高，而聯(lián)合治療組炎癥因子的相對表達(dá)量顯著下降，提示模型組大鼠為了保護(hù)機(jī)體免受低氧誘導(dǎo)肺動脈高壓的損傷炎性因子水平迅速上升［18］，而法舒地爾聯(lián)合葛根素具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用，保護(hù)肺血管免受缺氧誘導(dǎo)的肺動脈高壓的損傷［19］。本研究檢測了TGF?β1/Smads 通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示聯(lián)合治療組TGF?β1/Smads 通路相關(guān)蛋白相對表達(dá)量下降。缺氧誘導(dǎo)的肺動脈高壓可激活TGF?β1，激活的TGF?β1 首先與受體結(jié)合使其活化，受體活化后激活絲/蘇氨酸激酶從而磷酸化其下游信號蛋白Smad2［20］，磷酸化的Smad2 與Smad4 結(jié)合形成異二聚體，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，即Smad2 與Smad4 復(fù)合物的形成及核轉(zhuǎn)位是該通路活化的標(biāo)志［21-22］。受體激活性Smad 被激活以后，相對應(yīng)的靶基因的產(chǎn)物開始調(diào)控抑制性Smad7 的表達(dá)，構(gòu)成負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)路從而抑制Smad 通路信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，即Smad7 表達(dá)的上調(diào)也是該通路活化的標(biāo)志［23］。以上提示，缺氧誘導(dǎo)肺動脈高壓促進(jìn)TGF?β1/Smads 通路活化來增大肺血管損傷程度，而法舒地爾聯(lián)合葛根素通過促進(jìn)TGF?β1/Smads 通路負(fù)反饋調(diào)節(jié)來保護(hù)缺氧性肺血管損傷。

綜上所述，缺氧性肺動脈高壓可促使肺血管重建、導(dǎo)致肺損傷，法舒地爾聯(lián)合葛根素能保護(hù)肺動脈血管緩解缺氧誘發(fā)的肺動脈高壓引起一系列肺血管收縮失常、重建及肺血管壁病理變化，并通過調(diào)節(jié)TGF?β1/Smads 信號通路和緩解炎癥反應(yīng)來保護(hù)機(jī)體減輕損傷，為缺氧性肺動脈高壓的臨床治療提供參考。