低水量蛋白酶酶解大豆?jié)饪s蛋白工藝研究

楊 寧，宣 麗，梁麗萍，陳雪嬌，李春雨，李洪根，權(quán)志中*

（1.沈陽(yáng)市康普利德生物科技有限公司，遼寧沈陽(yáng) 110161；2.遼寧康普利德生物科技有限公司，遼寧省飼料預(yù)消化專業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心，遼寧鐵嶺 112600；3.沈陽(yáng)市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研發(fā)服務(wù)中心<沈陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院>，遼寧沈陽(yáng) 110025；4.遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧沈陽(yáng) 110003）

大豆?jié)饪s蛋白（SPC）是以脫脂大豆粕為原料，消除低聚糖腸脹氣因子、胰蛋白酶抑制因子和凝集素等抗?fàn)I養(yǎng)因子后的一種蛋白原料，蛋白質(zhì)含量不低于65%[1-2]，目前被廣泛應(yīng)用于食品和飼料等領(lǐng)域[3-4]。抗原蛋白是大豆蛋白中的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子，其抗?fàn)I養(yǎng)作用表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：降低飼料蛋白質(zhì)的利用率；活化免疫系統(tǒng)而加大動(dòng)物維持營(yíng)養(yǎng)需要；增加內(nèi)源蛋白質(zhì)的分泌，導(dǎo)致糞氮增加；出現(xiàn)過敏反應(yīng)，使動(dòng)物腸道受損，出現(xiàn)腹瀉，導(dǎo)致生產(chǎn)性能下降甚至死亡[3-5]。SPC作為大豆蛋白產(chǎn)品之一，也含有抗原蛋白，在動(dòng)物飼料中大量使用會(huì)引起腸道過敏、腹瀉等消化應(yīng)激反應(yīng)[6-7]，導(dǎo)致飼料消化率降低，因此在一定程度上限制了其在飼料領(lǐng)域的應(yīng)用。

目前，降解抗原蛋白的方法主要有物理法、化學(xué)法和生物酶解法[8]。生物酶解法可以通過不同酶制劑進(jìn)行選擇性酶解，被認(rèn)為是降低甚至完全消除大豆蛋白抗原性的有效方法[9]。侯瑤[10]的研究表明，采用中性蛋白酶和胰蛋白酶酶解SPC，當(dāng)水解度為2%時(shí)，β-伴大豆球蛋白的3個(gè)亞基基本被水解，而大豆球蛋白的酸性、堿性亞基也出現(xiàn)水解的情況，但水解并不徹底。張娜等[11]研究表明，采用堿性蛋白酶對(duì)SPC進(jìn)行一次酶解，當(dāng)水解度為3%時(shí)，β-伴大豆球蛋白的α亞基和β亞基基本被酶解，α' 亞基未全部酶解；采用風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行二次酶解后，α'亞基全部被酶解。酶解法是生產(chǎn)肽產(chǎn)品的主要方式，具有底物專一、產(chǎn)物明確、穩(wěn)定高效的特點(diǎn)，因此，本研究采用酶解法對(duì)SPC進(jìn)行處理。當(dāng)前酶解SPC的研究多集中在食品加工領(lǐng)域，主要考察酶解產(chǎn)物的溶解性、乳化性、發(fā)泡性、凝膠性等性質(zhì)的變化，且酶解體系含水量都在90%以上，存在產(chǎn)物濃縮干燥能耗高、水消耗量大、人工成本高等問題[12-17]。為了降低酶解的生產(chǎn)成本，提高SPC在飼料中的應(yīng)用效果，改善飼料利用率，本試驗(yàn)考慮在較低水量條件下，在不同的料水比、酶添加量、pH值、酶解溫度等工藝條件下，對(duì)SPC進(jìn)行酶解，考察水解度和酸溶蛋白指標(biāo)，研究降低水量對(duì)酶解效果的影響，以期在控制加水量的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)提高小肽含量及降解抗原蛋白的目的。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

SPC來源于益海（泰州）糧油工業(yè)有限公司，粗蛋白含量為66.7%，酸溶蛋白含量為1.1%。蛋白酶A（活力1.0×105U/g）、蛋白酶B（活力1.0×105U/g），均來自遼寧省飼料預(yù)消化專業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心實(shí)驗(yàn)室。

硼砂、十二烷基硫酸鈉、鄰苯二甲醛、1,4-二巰基蘇糖醇、三氯乙酸、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸、β-巰基乙醇、溴酚藍(lán)、過硫酸銨、冰乙酸、甲醇、考馬斯亮藍(lán)、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠、硫酸銅、硫酸鉀、濃鹽酸、濃硫酸、氫氧化鈉等，均來自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，純度99.4%，標(biāo)準(zhǔn)品號(hào)GBW（E）100051，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1700型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；HJ-M6型水循環(huán)磁力攪拌水浴鍋，金壇市城西春蘭實(shí)驗(yàn)儀器廠；STARTER 3100型pH計(jì)、CP 214型電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；K9860型全自動(dòng)凱氏定氮儀，濟(jì)南海能儀器股份有限公司；SC-3614型低速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；EPS-600型電泳儀，上海天能科技有限公司；101FA-0型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海樹立儀器儀表有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

為了研究低水量的酶解效果，試驗(yàn)將酶解的料水比固定為1∶1.5（g∶mL），體系含水量為60%。酶解時(shí)間模擬動(dòng)物消化過程，確定為6 h。酶解結(jié)束后滅酶，樣品直接干燥、粉碎，然后進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。前期筆者對(duì)不同來源的多種蛋白酶進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)蛋白酶A和蛋白酶B在低水量條件下對(duì)SPC有較明顯的酶解效果，本文首先通過單因素試驗(yàn)，分別確定蛋白酶A、蛋白酶B的最適添加量、pH及反應(yīng)溫度。在此基礎(chǔ)上，選擇蛋白酶A、蛋白酶B的最適酶解條件，研究不同料水比（1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2）對(duì)SPC水解度、酸溶蛋白含量及抗原蛋白降解效果的影響。

1.4 單因素試驗(yàn)

1.4.1 蛋白酶酶解條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

（1）酶添加量對(duì)SPC水解度和酸溶蛋白含量的影響

稱取20.00 g SPC于250 mL燒杯中，加入30 mL水，蛋白酶A添加量分別為0.1%、0.3%、0.6%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%，調(diào)整溶液pH值至9.5，55 ℃酶解6 h；蛋白酶B添加量分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.8%、1.0%，不調(diào)整溶液pH值，55 ℃酶解6 h。反應(yīng)結(jié)束后，沸水浴滅酶，樣品80 ℃烘干，粉碎后測(cè)定SPC的水解度和酸溶蛋白含量。

（2）pH對(duì)SPC水解度和酸溶蛋白含量的影響

稱取20.00 g SPC于250 mL燒杯中，加入30 mL水，蛋白酶A添加量為3.0%，分別調(diào)整溶液pH值為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，55 ℃酶解6 h；蛋白酶B添加量為0.8%，分別調(diào)整溶液pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，55 ℃酶解6 h。反應(yīng)結(jié)束后，沸水浴滅酶，樣品80 ℃烘干，粉碎后測(cè)定SPC的水解度和酸溶蛋白含量。

（3）溫度對(duì)SPC水解度和酸溶蛋白含量的影響

稱取20.00 g SPC于250 mL燒杯中，加入30 mL水，蛋白酶A添加量為3.0%，調(diào)整溶液pH值為9.0；蛋白酶B添加量為0.8%，調(diào)整溶液pH值為6.5，酶解溫度分別為40、45、50、55、60 ℃，酶解6 h。反應(yīng)結(jié)束后，沸水浴滅酶，樣品80 ℃烘干，粉碎后測(cè)定水解度和酸溶蛋白含量。

1.4.2 不同料水比對(duì)兩種蛋白酶酶解效果的影響

本試驗(yàn)設(shè)置了低水量條件下（料水比分別為1∶0.5、1∶1.0、1∶1.5、1∶2.0），采用蛋白酶A和蛋白酶B的最適添加量、pH、溫度對(duì)SPC進(jìn)行酶解處理，觀察不同水分含量時(shí)SPC的酶解情況。觀察水解度、酸溶蛋白含量、抗原蛋白降解效果等指標(biāo)。

1.5 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.5.1 水解度

采用鄰苯二甲醛（OPA）法[18]測(cè)定樣品的水解度。

1.5.2 酸溶蛋白含量

參照GB/T22492—2008附錄B[19]測(cè)定酸溶蛋白含量。

1.5.3 抗原蛋白降解效果評(píng)價(jià)

根據(jù)Laemmli[20]的方法進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試驗(yàn)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示兩者之間存在顯著差異。試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶最適添加量的確定

隨著蛋白酶A、蛋白酶B添加量的變化，SPC水解度及酸溶蛋白含量的變化趨勢(shì)如圖1、2所示。

圖1 蛋白酶A添加量對(duì)SPC水解度和酸溶蛋白含量的影響Fig.1 Effect of protease A enzyme amount on degree of hydrolysis and acid soluble protein content of SPC

由圖1可知，隨著蛋白酶A添加量的增加，SPC的水解度和酸溶蛋白含量變化趨勢(shì)一致，均呈持續(xù)上升趨勢(shì)。當(dāng)添加量從0.1%增加到3.0%時(shí)，水解度及酸溶蛋白含量顯著升高（P＜0.05），添加量繼續(xù)增加到4.0%時(shí)，水解度和酸溶蛋白含量略有升高，但差異不顯著（P＞0.05），表明蛋白酶A的最適添加量為3.0%。

圖2 蛋白酶B添加量對(duì)SPC水解度和酸溶蛋白含量的影響Fig.2 Effect of protease B enzyme amount on degree of hydrolysis and acid soluble protein content of SPC

由圖2可知，隨著蛋白酶B添加量的增加，SPC的水解度和酸溶蛋白含量均呈先增加后基本不變的趨勢(shì)。當(dāng)添加量從0.1%增加到0.8%時(shí)，水解度及酸溶蛋白含量顯著升高（P＜0.05），酶添加量繼續(xù)增加到1.0%時(shí)，水解度和酸溶蛋白含量略有升高，但差異不顯著（P＞0.05），表明蛋白酶B的最適添加量為0.8%。

2.2 蛋白酶最適pH的確定

蛋白酶A、蛋白酶B作用時(shí)，隨著pH的變化，SPC水解度及酸溶蛋白含量的變化趨勢(shì)分別見圖3、4。

圖3 蛋白酶A酶解pH對(duì)SPC水解度和酸溶蛋白含量的影響Fig.3 Effect of protease A pH on degree of hydrolysis and acid soluble protein content of SPC

由圖3可知，蛋白酶A在堿性環(huán)境中酶解效果更好。隨著酶解pH的升高，SPC水解度和酸溶蛋白含量均呈持續(xù)上升趨勢(shì)。當(dāng)pH為6.5和7.0時(shí)，水解度和酸溶蛋白含量的差異不顯著（P＞0.05），當(dāng)pH從7.5升高到9.0時(shí)，水解度和酸溶蛋白含量顯著上升（P＜0.05），當(dāng)pH繼續(xù)增加到9.5時(shí)，水解度和酸溶蛋白含量略有上升，但差異不顯著（P＞0.05），表明蛋白酶A的最適pH為9.0。

圖4 蛋白酶B酶解pH對(duì)SPC水解度和酸溶蛋白含量的影響Fig.4 Effect of protease B pH on degree of hydrolysis and acid soluble protein content of SPC

由圖4可知，隨著酶解pH從5.0升高到8.0，SPC水解度和酸溶蛋白含量均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，說明蛋白酶B在中性偏酸環(huán)境中酶解效果更好。當(dāng)pH為6.5時(shí)，水解度和酸溶蛋白含量均達(dá)到最大值，分別為14.1%和31.1%，表明蛋白酶B的最適pH為6.5。

2.3 蛋白酶最適反應(yīng)溫度的確定

蛋白酶A、蛋白酶B作用時(shí)，隨著酶解溫度的變化，SPC水解度的變化趨勢(shì)見圖5。

圖5 蛋白酶酶解溫度對(duì)SPC水解度的影響Fig.5 Effect of protease enzymolysis temperature on degree of hydrolysis and acid soluble protein content of SPC

由圖5可知，當(dāng)酶解溫度為40 ℃時(shí)，蛋白酶A的酶解效果略優(yōu)于蛋白酶B，隨著溫度繼續(xù)上升，蛋白酶B的酶解效果均優(yōu)于蛋白酶A。隨著溫度的升高，兩種蛋白酶作用后，SPC水解度均呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，當(dāng)溫度從40 ℃升高到50 ℃時(shí)，顯著升高（P＜0.05），當(dāng)溫度從50 ℃繼續(xù)升高到60 ℃時(shí)，兩種蛋白酶作用后，SPC水解度均顯著下降（P＜0.05），表明兩種蛋白酶的最適反應(yīng)溫度均為50 ℃。

2.4 不同料水比條件下兩種蛋白酶的酶解效果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，改變酶解料水比，考察降低水分含量對(duì)SPC水解度、酸溶蛋白含量、抗原蛋白含量的影響。水解度及酸溶蛋白含量測(cè)定結(jié)果見表1，電泳結(jié)果見圖6。

由表1可知，隨著酶解體系水量的增加，不論是蛋白酶A還是蛋白酶B作用，SPC水解度和酸溶蛋白含量均顯著升高（P＜0.05），但增幅逐漸變緩。

由圖6可知，豆粕中的抗原蛋白含量較高，β-伴大豆球蛋白的3個(gè)亞基和大豆球蛋白的酸性、堿性亞基條帶明顯。大豆?jié)饪s蛋白有效地去除了豆粕中的部分抗?fàn)I養(yǎng)因子[21]，抗原蛋白條帶已經(jīng)明顯減弱。經(jīng)兩種蛋白酶酶解后的SPC，β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的條帶均完全消失，可見，即使在低水量條件下，這兩種蛋白酶亦對(duì)β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白具有很好的降解能力。

表1 不同料水比對(duì)SPC水解度和酸溶蛋白含量的影響Table 1 Effect of ratio of material to water on degree of hydrolysis and acid soluble protein content of SPC

結(jié)合表1數(shù)據(jù)可知，當(dāng)SPC的水解度高于3.7%，酸溶蛋白含量高于6.6%時(shí)，抗原蛋白條帶完全消失。相同料水比條件下，蛋白酶B的水解度值均高于蛋白酶A，表明蛋白酶B酶解能夠釋放更多的游離氨基。當(dāng)酶解體系含水量小于50%時(shí)，蛋白酶A酶解能夠提供更高的酸溶蛋白含量；當(dāng)酶解體系含水量大于50%小于70%時(shí)，蛋白酶B能夠提供更高的酸溶蛋白含量。

本試驗(yàn)中選取的兩種蛋白酶在低水量條件下酶解SPC時(shí)，最適添加量和pH有較大差異，實(shí)際生產(chǎn)中可根據(jù)物料體系水分含量、酸堿度、營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)等多種需求，選擇合適的蛋白酶。

圖6 低水量條件下蛋白酶酶解SPC后電泳結(jié)果Fig.6 Electrophoresis results of SPC hydrolyzed by protease under low water content

3 討論

前人研究發(fā)現(xiàn)，生物酶解法的酶解效果受酶的種類、酶解條件等多種因素影響。如張梅等[14]采用Alcalase蛋白酶對(duì)SPC進(jìn)行酶法改性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度5%（料水比為1∶20），酶濃度2%（E/S），pH8.5，62 ℃酶解4 h，水解度大于12%；鄭芳燕等[15]研究表明，采用Alcalase堿性蛋白酶對(duì)SPC進(jìn)行酶法處理，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度10%（料水比為1∶10），酶濃度0.5%（占底物），pH8.0，50 ℃酶解3 h時(shí)，水解度為6.37%；馬宇翔等[16]研究表明，采用菠蘿蛋白酶對(duì)SPC進(jìn)行酶法改性，酶解的最佳條件為pH6.5，反應(yīng)溫度48 ℃，底物質(zhì)量濃度6%（料水比為1∶16.7），加酶量607 U/g，此條件下水解4 h，水解度可達(dá)11.07%。以上研究結(jié)果表明，酶的種類不同，酶解效果不同；同一種酶，酶解條件不同，酶解效果也不同。本試驗(yàn)中選取的兩種蛋白酶也得到了相似的結(jié)論。另外，以上研究中，酶解體系含水量均≥90%。本試驗(yàn)中，蛋白酶A在料水比1∶2，酶添加量3%，pH 9.0，50 ℃酶解6 h，水解度可達(dá)到12.4%；蛋白酶B在料水比1∶1.5，酶添加量0.8%，pH 6.5，50 ℃酶解6 h，水解度可達(dá)到14.2%?？梢姡驹囼?yàn)在降低加水量的同時(shí)依然保證了較高的水解度。且本試驗(yàn)中所用的兩種蛋白酶，當(dāng)水解度高于3.7%時(shí)，即可將SPC中的抗原蛋白完全降解?？梢姡ㄟ^優(yōu)化蛋白酶對(duì)SPC的酶解條件，即使在低水量條件下，也可實(shí)現(xiàn)降解抗原蛋白的目的。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)在較低水分條件下，以水解度和酸溶蛋白含量為考察指標(biāo)，確定了兩種蛋白酶在料水比為1∶1.5，酶解時(shí)間為6 h時(shí)SPC酶解的最適添加量、pH和溫度。其中蛋白酶A最適作用條件為蛋白酶添加量3%，pH 9.0、溫度50 ℃；蛋白酶B最適作用條件為蛋白酶添加量0.8%，pH6.5、溫度50 ℃。當(dāng)料水比為1∶0.5時(shí)，蛋白酶A酶解SPC，水解度為3.7%，酸溶蛋白含量為7.4%；蛋白酶B酶解SPC，水解度為4.0%，酸溶蛋白含量為6.7%；SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，此時(shí)SPC中抗原蛋白條帶可實(shí)現(xiàn)明顯降解。