基于整合藥理學的柴胡不同部位抗癲癇作用研究

王 鵬，高曉霞，高 耀，許文倩，馮 彥，李震宇，秦雪梅

基于整合藥理學的柴胡不同部位抗癲癇作用研究

王 鵬，高曉霞*，高 耀，許文倩，馮 彥，李震宇，秦雪梅*

山西大學 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006

研究柴胡的抗癲癇活性及其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)和潛在的分子作用機制。采用活性追蹤的方法，考察柴胡低、中、高極性部位分別對戊四唑誘導的小鼠致癲癇模型的影響。并采用LC-MS技術(shù)對柴胡抗驚厥活性部位化學成分進行全面表征。通過整合藥理學方法對柴胡抗癲癇活性部位潛在作用機制進行初步預(yù)測，并構(gòu)建柴胡潛在靶標與癲癇疾病靶標相互作用網(wǎng)絡(luò)。最后，對于其中重要的通路進行驗證。通過小鼠造模劑量篩選，選擇戊四唑55.18 mg/kg造模，發(fā)現(xiàn)柴胡高極性部位（20 g/kg）可以顯著延長癲癇小鼠的陣攣潛伏期與強直潛伏期，并能顯著減少驚厥次數(shù)。化學成分鑒定結(jié)果表明，在正、負離子模式下從柴胡抗驚厥活性部位共鑒定出32種化學成分，主要為柴胡皂苷類成分，還包括脂肪酸類、糖類和香豆素類等成分。通過整合藥理學平臺篩選出柴胡抗癲癇的關(guān)鍵靶標22個，其中疾病與藥物共有主要靶點有10個，包括ATP5A1、ATP5B、ATP1A1、ATP5C1、PPP3CA、PTGS2、AR等；其富集的通路包括帕金森病、能量代謝、亨廷頓氏病、卵母細胞減數(shù)分裂、神經(jīng)退行性疾病等。最終，驗證了能量代謝中關(guān)鍵節(jié)點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)柴胡高極性部位能明顯回調(diào)癲癇小鼠海馬和肝臟中三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）含量。柴胡高極性部位具有顯著抗驚厥活性，其主要通過調(diào)節(jié)能量代謝通路來抑制癲癇的發(fā)生，其中柴胡皂苷類成分主要調(diào)節(jié)能量代謝，并通過改善ATP含量水平起到抗癲癇的作用，這可能是柴胡治療癲癇的主要機制。

柴胡；戊四唑；癲癇；整合藥理學；能量代謝

癲癇是腦神經(jīng)元同步異常化放電而導致暫時性神經(jīng)功能障礙的一種慢性疾病，全球大約有5000萬癲癇患者[1]，據(jù)統(tǒng)計我國至少有900萬癲癇患者，同時每年有40萬左右新發(fā)癲癇患者。癲癇的發(fā)病機制十分復雜，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性與抑制性失衡是發(fā)病的主要誘因，而且與神經(jīng)遞質(zhì)失衡、離子通道、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、遺傳及免疫異常等密切相關(guān)[2]。目前，治療癲癇的手段主要為化學藥物治療，包括苯妥英鈉、丙戊酸鈉、卡馬西平等傳統(tǒng)型抗癲癇藥物，另有一些新型藥物如拉莫三嗪、托吡酯、加巴噴丁等也被用于臨床當中。盡管有20余種不同的抗癲癇藥物被應(yīng)用于臨床，但仍至少有1/3患者會發(fā)展為難治性癲癇[3]。另一方面，藥物的不良反應(yīng)也十分嚴重，包括加重癲癇發(fā)作或引發(fā)新的癲癇類型。中醫(yī)藥療法具有毒副作用小的優(yōu)勢，黃運生等[4]以中醫(yī)理論為切入點，探尋了癲癇從肝論治的方法體系，自擬柴胡疏肝散用于癲癇的臨床治療效果良好。另外，經(jīng)文獻檢索發(fā)現(xiàn)以柴胡為君藥的復方如柴胡加龍骨牡蠣湯、柴胡桂枝湯和小柴胡湯[5-7]等治療癲癇都具有顯著的臨床療效。

柴胡為傘形科植物柴胡DC.或狹葉柴胡Willd.的干燥根，味辛、苦，性微寒，歸肝、膽、肺經(jīng)，具有疏散退熱、舒肝解郁、升舉陽氣等作用。龔素珍等[8]以大鼠額葉皮層電驚厥閾值作為指標，發(fā)現(xiàn)柴胡具有抗癲癇活性。劉燕等[9-10]研究柴胡有效成分的抗癲癇作用，發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷組分、揮發(fā)油均對最大電休克（maximal electroshock seizure，MES）模型有明顯拮抗作用；高極性部位可有效對抗戊四唑（pentylenetetrazol）致癲癇模型，之后對其物質(zhì)基礎(chǔ)進行挖掘，推測亞油酸、丙三醇和木糖醇為主要抗癲癇活性成分。黃慶暉等[11]發(fā)現(xiàn)超臨界CO2萃取的柴胡揮發(fā)油也具有抗驚厥作用。同時，謝煒[12]對柴胡皂苷類成分進行藥效實驗以及作用機制研究，發(fā)現(xiàn)柴胡總皂苷存在抗癲癇活性，其機制可能與抑制大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）的過度表達有關(guān)?？梢?，柴胡作為具有抗癲癇作用的單味藥，其化學成分十分復雜，而現(xiàn)階段對中藥作用機制的研究認為，多成分、多靶點為其發(fā)揮藥理作用的重要方式[13]，因此，需要從多成分、整體性出發(fā)，研究柴胡治療癲癇的重要機制。

中藥整合藥理學平臺（https://www.tcmip.cn）是以中醫(yī)藥大數(shù)據(jù)為驅(qū)動，現(xiàn)代分析技術(shù)為手段的新興平臺[14]，整合了中藥材數(shù)據(jù)、中藥方劑數(shù)據(jù)、中藥成分數(shù)據(jù)、中藥靶標數(shù)據(jù)與疾病相關(guān)分子數(shù)據(jù)資源，采用人工智能、數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)計算及可視化等方法和技術(shù)，開展中藥（含方劑）靶標預(yù)測及功能分析、證候相關(guān)分子挖掘及功能分析等，建立“中藥-成分-靶標-疾病”多維分析平臺與多維度關(guān)聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，有效揭示了中藥藥效作用的分子機制[15-18]。

本研究基于活性篩選柴胡抗癲癇有效部位，明確柴胡有效部位成分，采用整合藥理學方法與平臺，從整體性的角度對柴胡抗癲癇有效部位的作用機制進行探討，并對關(guān)鍵通路進行驗證，為深入研究柴胡及含柴胡的中藥復方的抗癲癇作用提供參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

ICR小鼠，雄性，7～8周齡，體質(zhì)量23～25 g，SPF級，中國食品藥品檢定研究院動物實驗中心提供，動物許可證SCXK（京）2005-0004。動物實驗經(jīng)過山西大學動物實驗倫理委員會批準（批準編號SXULL2019003）動物自然晝夜節(jié)律光照條件下，自由進食進水，飼養(yǎng)7 d適應(yīng)環(huán)境，每天觸摸動物以適應(yīng)實驗人員操作。柴胡購于山西省華陽藥業(yè)有限公司，經(jīng)山西大學中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心主任秦雪梅教授鑒定為傘形科植物柴胡DC.的干燥根，習稱“北柴胡”。戊四唑購于上海依赫生物科技有限公司。

1.2 儀器

Dionex UltiMate 3000超高效液相色譜及四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀；Xcalibur工作站（美國Thermo Fisher Scientific公司）；電子分析天平BS210S（南京萊步科技實業(yè)有限公司）；Scientz-12N真空冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；超聲清洗儀KQ2200DB（昆山市超聲儀器有限公司）；小鼠行為觀測箱，自制，長×寬×高為80 cm×80 cm×50 cm。

2 方法

2.1 柴胡不同極性部位的制備

精密稱取適量柴胡，8倍量95%乙醇浸泡12 h，回流提取3次，每次2 h。合并濾液，濃縮至無乙醇味，得到柴胡提取物并進行極性梯度萃取。首先加入等體積石油醚萃取，多次萃取至萃取液無色，回收石油醚，濃縮至浸膏，于真空干燥箱（60 ℃）中干燥，得柴胡低極性部位（出膏率約為2.13%）；石油醚萃取后剩余部分，加入等體積醋酸乙酯萃取，多次萃取至萃取液無色，回收醋酸乙酯，濃縮至浸膏，于真空干燥箱（70 ℃）中干燥，得柴胡中極性部位（出膏率約為5.35%）；萃取后剩余部位蒸干得到柴胡高極性部位（出膏率約為8.11%）。按照《中國藥典》方法，以柴胡皂苷a和d為指標成分對柴胡不同提取部位進行質(zhì)量控制，其中柴胡低極性部位柴胡皂苷a和d質(zhì)量分數(shù)約為13.0、14.3 μg/g，柴胡醋酸酸乙酯部位約為1.095 0、0.775 5 mg/g，柴胡高極性部位約為231.0、104.3 μg/g。

2.2 模型動物的復制與給藥

2.2.1 戊四唑致慢性驚厥小鼠模型劑量篩選 采用單位概率回歸法[19]，測定造模藥物戊四唑的95%有效藥物劑量（ED95）。通過文獻檢索得到戊四唑致癲癇模型的常用劑量32 mg/kg[20-22]，分別取5個濃度（50、40、32、25.6、20.48 mg/kg）梯度（0.8倍梯度濃度）的溶液進行戊四唑ED95測定。

50只小鼠進行劑量篩選，第1只小鼠ip 40 mg/kg，觀察小鼠行為10 min：若發(fā)生3級以上行為則認定模型成功，下一只小鼠選用下一梯度濃度即32 mg/kg戊四唑造模；若未出現(xiàn)3級以上行為則認為造模失敗，下一只小鼠選用上一梯度濃度即50 mg/kg戊四唑造模。依次連續(xù)進行實驗，每只小鼠均進行1次劑量篩選實驗。結(jié)果采用Probit回歸模型進行統(tǒng)計分析，最終ED95有效劑量則為本實驗的造模劑量。

2.2.2 動物分組與給藥 50只小鼠一次與ip 55.18 mg/kg（最佳造模劑量）戊四唑造模，觀察小鼠行為10 min，若發(fā)生3級以上行為則認定小鼠能成功復制戊四唑致癇模型。經(jīng)過篩選得到造模成功小鼠48只，并隨機分為6組（＝8），包括對照組、模型組、柴胡低極性部位組、柴胡中極性部位組、柴胡高極性部位組、陽性藥地西泮（4 mg/kg）組。對照組小鼠安置在一個安靜的房間中，該房間12 h明暗循環(huán)，并隨意提供食物和水。除對照組外，其他組小鼠每2天進行1次造模（給藥60 min后，1次ip戊四唑）。各給藥組根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果確定了柴胡各部位給藥劑量均為20 g/kg（按生藥量計），對照組和模型組小鼠給予等體積藥物溶劑。實驗中藥物均用含0.1%聚山梨酯-80水溶解，給藥方式選擇ip給藥，劑量為0.1 mL/10 g體質(zhì)量，每天1次，連續(xù)給藥12 d。

2.2.3 柴胡不同部位對戊四唑致慢性驚厥小鼠的影響 每天記錄各組小鼠體質(zhì)量，利用活動儀記錄小鼠的行為動作，連續(xù)記錄10 min，記錄小鼠陣發(fā)性痙攣潛伏期（即從ip戊四唑開始至相當于癇性分級1～3級發(fā)作的時間）、強直性驚厥潛伏期（即從ip戊四唑開始至相當于癇性分級5級發(fā)作的時間）、驚厥次數(shù)（10 min內(nèi)小鼠發(fā)生癇性分級3～5級行為的次數(shù)）。

癇性發(fā)作分級：小鼠癇性發(fā)作分級采用Racine標準[23]，0級：無發(fā)作反應(yīng)；1級：節(jié)律性口角、耳或面部肌肉抽動陣攣；2級：點頭并伴隨更嚴重的面部肌肉抽動陣攣；3級：出現(xiàn)前肢陣攣但不伴隨直立；4級：前肢陣攣伴隨直立；5級：全身強直陣攣發(fā)作而跌倒。

2.2.4 樣本的收集 經(jīng)11 d實驗結(jié)束后，各組小鼠脫頸椎處死，置于冰上快速解剖取出肝臟與海馬，并放入液氮猝滅，后置于?80℃冰箱保存。

2.3 統(tǒng)計分析

2.4 柴胡有效部位化學成分分析

2.4.1 色譜條件 采用Waters Acquityuplc HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相為0.1%甲酸-水（A）和甲醇（B）；梯度洗脫：0～2 min，30%～40% B；2～10 min，40%～50% B；10～20 min，50%～55% B；20～30 min，55%～65% B；30～40 min，65%～75% B；40～50 min，75%～95% B；50～55 min，95% B。進樣量5 μL，體積流量0.2 mL/min，柱溫40 ℃。

2.4.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），同時進行正、負離子模式采集，掃描范圍為/100～1500；噴霧電壓3.5 kV（ESI+）和?2.5 kV（ESI?）；毛細管溫度為320 ℃；加熱器溫度為300 ℃；鞘氣體積流量35 arb，輔助氣體積流量10 arb；分辨率設(shè)定為MS full scan 35 000 FWHM以及MS/MS 17 500 FWHM，碰撞能量設(shè)定為12.5、25和37.5 eV。

2.4.3 化學成分檢測與鑒定 取柴胡高極性部位0.5 g，加入5 mL蒸餾水超聲溶解，12 000 r/min離心10 min，上清液用 0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得柴胡高極性部位供試品溶液。取該供試品溶液進行檢測，采集LC-MS色譜圖，觀察各色譜峰對應(yīng)質(zhì)譜圖中的準分子離子峰及多級碎片等信息，通過與對照品比對、檢索文獻及相關(guān)的數(shù)據(jù)庫進行成分鑒定指認，檢測成分用于后續(xù)整合藥理學分析。

2.5 整合藥理學方法

2.5.1 癲癇疾病的候選靶標來源 整合藥理學平臺疾病/癥狀靶標數(shù)據(jù)庫通過整合Drugbank數(shù)據(jù)庫（https://go.drugbank.com/）、Online Mendelian Inheritance in Man數(shù)據(jù)庫（OMIM，https://omim.org/）、Human Phenotype Ontology數(shù)據(jù)庫（HPO，https://hpo.jax.org/）、Therapeutic Target Database（TTD，http://db.idrblab.net/ttd/）、京都基因和基因組百科全書數(shù)據(jù)庫（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG，https://www.kegg.jp/）等資源，提取治療疾病或癥狀的藥物靶標的基因和蛋白質(zhì)相關(guān)信息[17-18]。在整合藥理學平臺疾病/證候靶標數(shù)據(jù)庫，以“convulsions or eclampsia or convulsion or epilepsia or epilepsy or epileptic or hieronosus or falling sickness”作為疾病或癥狀關(guān)鍵詞進行檢索，勾選檢索出來的所有靶標，作為候選的疾病靶標。

2.5.2 柴胡中化學成分的靶標預(yù)測 整合藥理學平臺的靶標預(yù)測和共性靶標分析基于化學信息學的藥物靶標預(yù)測方法，分別為基于配體特征的預(yù)測、基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征的預(yù)測和基于數(shù)據(jù)挖掘方法的預(yù)測。采用二維結(jié)構(gòu)相似性搜索，即采用分子ACCess系統(tǒng)（MACCS）分子指紋，使用開源軟件Open Babel進行柴胡化學成分的化學指紋特征的提取，并采用Tanimoto系數(shù)定義的相似度計量方法，通過與FDA上市藥物進行相似性打分（score＞0.8），并提取作用靶標，最后獲得中藥化學成分的靶標預(yù)測結(jié)果。

2.5.3 柴胡治療癲癇靶標間蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interactions，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 柴胡作用的潛在靶標與癲癇疾病靶標之間PPI通過整合藥理學平臺的PPI數(shù)據(jù)庫獲得，該平臺鑲嵌了Human Annotated and Predicted Protein Interaction Database（HAPPI）、Reactome，Online Predicted Human Interaction Database（OPHID）、In Act、Human Protein Reference Database（HPRD）、Molecular interaction Database（MINT）和Database of Interacting Proteins（DIP）等數(shù)據(jù)庫中PPI數(shù)據(jù)。通過整合藥理學平臺網(wǎng)絡(luò)分析模塊，針對柴胡作用的潛在靶標與驚厥疾病靶標之間的PPI計算網(wǎng)絡(luò)特征值，以節(jié)點連接度（degree）的2倍中位數(shù)為卡值，選取中藥靶標-疾病基因互作網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點（hubs）；在此基礎(chǔ)上，以degree、節(jié)點緊密度（closeness）和節(jié)點介度（betweenness）的中位數(shù)為卡值，選取同時滿足3個卡值的節(jié)點為中藥矯正疾病失衡網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵靶標網(wǎng)絡(luò)。然后，對關(guān)鍵靶標網(wǎng)絡(luò)進行通路富集分析，選取值前30的通路，構(gòu)建“中藥材-化學成分-核心靶標-關(guān)鍵通路”的多層次關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，并對關(guān)鍵靶標網(wǎng)絡(luò)和多層次關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)進行可視化。

2.5.4 基因功能和通路富集分析 基因功能和通路富集分析在整合藥理學平臺進行，相關(guān)信息來自于基因本體（gene ontology，GO）數(shù)據(jù)庫（http:// www.geneontology.org）和KEGG通路數(shù)據(jù)庫（http://www.genome.jp/kegg/）。

2.6 代謝通路的驗證

根據(jù)整合藥理學分析結(jié)果，篩選顯著性較高的通路中關(guān)鍵節(jié)點進行驗證，測定小鼠海馬與肝臟中的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）含量。

ATP含量測定采用增強型ATP檢測試劑盒（Beyotime），取凍存組織肝臟和海馬樣本約20 mg，加入20 μL裂解液，冰水浴勻漿后4 ℃、12 000×離心5 min，取上清進行測定。

將ATP標準溶液稀釋為1×10?4、1×10?3、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10 μmol/L濃度梯度。將100 μL ATP檢測工作液加入到檢測孔內(nèi)，于室溫放置3～5 min后，在檢測孔內(nèi)加入20 μL 不同濃度梯度的ATP標準品，并迅速用微量移液器混勻，用化學發(fā)光儀測定相對光單位（relative light unit，RLU）值。經(jīng)回歸分析后得到標準曲線（＝57 103－36.654，2＝0.996 6）。

3 結(jié)果

3.1 柴胡不同部位治療癲癇藥效研究

50只小鼠給予不同濃度梯度戊四唑造模結(jié)果如表1所示，基于Probit回歸模型進行統(tǒng)計分析，得到其Probit模型，響應(yīng)頻率（P）＝?11.486＋3.274（變量使用底數(shù)為2.718的對數(shù)來轉(zhuǎn)換）。最終ED95即造模劑量為55.18 mg/kg。

3.1.1 柴胡不同部位對戊四唑所致驚厥小鼠體質(zhì)量的影響 如圖1所示，與對照組相比，模型組小鼠體質(zhì)量無顯著變化（＞0.05），柴胡不同部位給藥組對小鼠體質(zhì)量也無影響（＞0.05）。而從第7天開始，地西泮組與對照組比較，小鼠體質(zhì)量明顯下降（＜0.05），表明地西泮組對于模型小鼠的生長發(fā)育存在一定影響。

表1 戊四唑致癲癇模型劑量篩選

與對照組比較：#P＜0.05

3.1.2 柴胡不同部位對戊四唑致驚厥小鼠陣攣潛伏期的影響 如圖2所示，與對照組相比，模型組小鼠陣攣潛伏期極顯著縮短（＜0.001），陽性藥地西泮組未發(fā)生驚厥，其陣攣潛伏期和對照組一致。與模型組相比，柴胡高極性部位組在給藥第1天即可顯著延長模型小鼠的陣攣潛伏期（＜0.05），給藥3～11 d維持極顯著延長陣攣潛伏期的藥效（＜0.001），且隨著給藥時間的增長作用更加明顯，呈時間相關(guān)性；柴胡中極性部位給藥第11天模型小鼠陣攣潛伏期也有顯著性延長（＜0.05）。柴胡低極性部位無明顯影響。

3.1.3 柴胡不同部位對戊四唑致驚厥小鼠強直性潛伏期的影響 如圖3所示，模型組與對照組比較，模型小鼠強直性潛伏期顯著縮短（＜0.05），陽性藥地西泮組未發(fā)生驚厥，其強直性潛伏期和對照組一致。與模型組相比，柴胡高極性部位組第5天起模型小鼠強直性潛伏期均顯著延長（＜0.05），隨著給藥時間的延長，強直性潛伏期的延長逐漸趨于穩(wěn)定。柴胡其他部位給藥組無明顯影響。

3.1.4 柴胡不同部位對戊四唑致模型小鼠驚厥次數(shù)的影響 如圖4所示，對照組與陽性藥組由于沒有出現(xiàn)驚厥，故驚厥次數(shù)均為0，未在圖中顯示。與模型組相比，柴胡高極性溶性部位組給藥第1天，模型小鼠驚厥次數(shù)顯著性下降（＜0.05），給藥3～11 d驚厥次數(shù)極顯著的下降（＜0.001）；柴胡中極性部位組給藥第7～11天，模型小鼠驚厥次數(shù)有明顯下降趨勢，但無顯著差異。且隨著給藥時間的延長，柴胡高極性部位組模型小鼠驚厥次數(shù)下降明顯，具有時間相關(guān)性，但仍不及地西泮組。

與對照組比較：###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 ***P＜0.001

與對照組比較：#P＜0.05；與模型組比較：*P＜0.05

與模型組比較：*P＜0.05 ***P＜0.001

3.2 基于UPLC-MS的柴胡高極性部位化學成分分析

根據(jù)上述實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)柴胡高極性部位具有顯著抗驚厥活性，需進一步對其物質(zhì)基礎(chǔ)進行分析。采用UPLC/Q-TOF-MS/MS技術(shù)的正、負離子模式分析柴胡高極性部位成分，其ESI-MS的質(zhì)譜總離子流圖（total ion chromatogram，TIC）如圖5所示，通過檢索國內(nèi)外文獻和Scifinder數(shù)據(jù)庫、TCMID與TCMSP數(shù)據(jù)庫，建立含有345個柴胡化學成分數(shù)據(jù)庫，結(jié)合Xcalibur軟件中Qual Browser功能對目標化合物進行了鑒定和確證。根據(jù)Xcalibur工作站給出的高分辨的精確相對分子質(zhì)量、二級質(zhì)譜碎片離子信息，結(jié)合文獻報道的質(zhì)譜裂解規(guī)律及在線數(shù)據(jù)庫（HMBD、Pub Chem、Mass Bank、Chem Spider等）的檢索，進行數(shù)據(jù)定性鑒定處理分析，共鑒定出32個化學成分，包括20個皂苷類成分、5個脂肪酸類成分、4個糖類成分、2個香豆素類成分和1個色原酮類成分，分析數(shù)據(jù)見表2。

3.3 基于整合藥理學的柴胡有效部位治療癲癇分子機制研究

3.3.1 柴胡化學成分靶標預(yù)測及分析 基于化學鑒定的32個成分，共預(yù)測出1384個靶標。將這些靶標進行基因分析，其基因功能主要涉及RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子活性，配體激活的序列特異性DNA結(jié)合、脂質(zhì)代謝過程等（表3）。對這些候選靶標進行通路富集分析可見，涉及的主要通路有脂質(zhì)代謝、卵母細胞減數(shù)分裂、PPAR信號通路等（表4）。

圖5 柴胡高極性部位正(B)、負(A) 離子模式總離子流圖與各級提取離子離子流圖(C～H)

表2 柴胡高極性部位化學成分鑒定

*表示與對照品比對

*Indicates comparison with the reference substance

表3 柴胡的候選靶標功能信息

3.3.2 柴胡治療癲癇的核心靶標網(wǎng)絡(luò)、基因功能和通路富集分析 通過整合藥理學的網(wǎng)絡(luò)分析模塊，基于PPI相互作用數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建柴胡有效成分組合潛在靶標與疾病靶標相互作用網(wǎng)絡(luò)。篩選關(guān)鍵靶標52個，根據(jù)degree顯示前22個靶點，圖中節(jié)點的大小與degree呈正比關(guān)系（圖6）。

通過GO和KEGG數(shù)據(jù)庫的基因和功能分析，柴胡治療癲癇的關(guān)鍵靶標基因功能富集分析結(jié)果顯示，基因功能包括線粒體ATP合成耦合質(zhì)子運輸、線粒體質(zhì)子轉(zhuǎn)運ATP合酶復合物、轉(zhuǎn)運體活性和ATP生物合成過程等（表5）。靶標通路富集結(jié)果顯示，柴胡治療癲癇的通路包括帕金森氏綜合癥、能量代謝和亨廷頓疾病等（表6）。

3.3.3 柴胡治療癲癇的“中藥-成分-靶標-通路”多維網(wǎng)絡(luò)分析 多層次關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)顯示了前30條的關(guān)鍵通路，這些通路主要有帕金森綜合征、能量代謝、亨廷頓病、卵母細胞減數(shù)分裂、神經(jīng)變性疾病等；根據(jù)degree僅顯示了前10個核心靶標包括ATP5B、ATP5C1、ATP5A1、ATP1A1、AR、PTGS2、PGR、PPP3CA、YWHAE、MED1（圖7）；同時顯示了與這些核心靶標相關(guān)聯(lián)的柴胡高極性部位32個化學成分（表2）。

3.4 柴胡改善癲癇小鼠海馬與肝臟組織中ATP含量

整合藥理學結(jié)果表明，柴胡高極性部位能調(diào)節(jié)能量代謝，并通過介導ATP合成進而改善癲癇發(fā)作狀態(tài)。因此，本研究測定了各組小鼠海馬與肝臟組織中的ATP含量，結(jié)果（圖8）表明，與對照組相比，模型組小鼠海馬組織ATP含量顯著降低（＜0.05），而柴胡高極性部位ATP含量顯著回調(diào)（＜0.05）并趨近對照，表明柴胡高極性部位能通過調(diào)節(jié)小鼠海馬組織中的ATP含量改善癲癇。在肝臟組織中，模型組與對照組ATP含量同樣存在顯著差異（＜0.05），柴胡高極性部位同樣存在回調(diào)現(xiàn)象，但無顯著性差異。

表4 柴胡候選靶標參與的通路信息

#表示大通路，表6同

#denotes a large path, same as table 6

圖6 柴胡潛在靶標與癲癇疾病靶標相互作用網(wǎng)絡(luò)

4 討論

柴胡在臨床上應(yīng)用十分廣泛，對發(fā)熱、消化系統(tǒng)疾病、抑郁癥、癌癥等多種疾病均有著十分顯著的療效[32]。本課題組致力于研究柴胡在精神疾病中的作用，對柴胡在抑郁癥中的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制做了大量研究，并發(fā)現(xiàn)了抗抑郁活性部位柴胡低極性部位[33-35]。根據(jù)化學致癇劑是作用于興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)來復制癲癇模型的，故本實驗采用了化學致癇劑進行造模，其中戊四唑為很強的致癇劑，其致癇模型被認為是理想的全身強直性驚厥發(fā)作模型之一。本研究結(jié)果表明柴胡低極性部位并未表現(xiàn)出抗驚厥活性，文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)，柴胡低極性部位表現(xiàn)出抗癲癇活性主要集中于最大電休克致驚厥模型中[8,11]。因此，柴胡低極性部位是否具有抗癲癇活性需要采用其他模型進一步的驗證。另外，前期預(yù)實驗中還考察了柴胡各部位ig給藥方式，但未發(fā)現(xiàn)明顯抗癲癇活性。在本實驗中，柴胡高極性部位表現(xiàn)出良好的抗驚厥活性，與文獻報道的研究結(jié)果相一致[8]。通過整合藥理學研究發(fā)現(xiàn)其作用機制和能量代謝密切相關(guān)。同時，其皂苷類成分可能是柴胡抗驚厥的主要的物質(zhì)基礎(chǔ)。

表5 柴胡治療癲癇關(guān)鍵靶標基因功能信息

表6 柴胡治療癲癇關(guān)鍵靶標通路信息

與對照組比較：#P＜0.05；與模型組比較：*P＜0.05

本實驗中，地西泮表現(xiàn)出了良好的鎮(zhèn)靜效果，其抗驚厥指標均優(yōu)于柴胡高極性部位。但在本研究中發(fā)現(xiàn)，戊四唑致癇模型以及柴胡各部位給藥組對小鼠體質(zhì)量并無明顯影響，但是陽性藥地西泮組小鼠體質(zhì)量較對照組有顯著下降趨勢，體質(zhì)量是反映動物生長發(fā)育水平的重要指標，另有文獻報道地西泮會導致抑郁小鼠體質(zhì)量下降[36]，并減弱小鼠學習記憶能力與自主活動能力[37]。這可能也從一定程度上體現(xiàn)了中藥不良反應(yīng)小的優(yōu)勢。

中藥整合藥理學是多學科融合、多平臺的整合，以中醫(yī)藥大數(shù)據(jù)為支撐，集成了靶標預(yù)測、數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析、可視化等網(wǎng)絡(luò)藥理學模塊，采取自助模式，集眾家之所長，強調(diào)多層次、多環(huán)節(jié)的整合研究，適用于中藥復雜體系作用機制的初步預(yù)測研究。方歡樂等[15]運用整合藥理學平臺構(gòu)建了柴胡-黃芩改善COVID-19臨床癥狀的“藥對-活性成分-關(guān)鍵靶標-作用通路”多維網(wǎng)絡(luò)，獲得了112個化學成分并對應(yīng)預(yù)測篩選了343個潛在靶標，表明柴胡-黃芩藥通過調(diào)控白介素信號通路、Ｃ型凝集素域7家族成員A/炎癥途徑、免疫應(yīng)激等相關(guān)信號通路，達到抑制活化的細胞因子、緩和過激的免疫反應(yīng)、消除炎癥、抗病毒等相關(guān)作用。于華蕓等[17]運用中醫(yī)藥整合藥理學平臺構(gòu)建了當歸貝母苦參丸治療前列腺疾病的“中藥材-核心成分-關(guān)鍵靶標-主要通路”多維網(wǎng)絡(luò)，獲得了核心成分65個，并對應(yīng)預(yù)測篩選了532個潛在靶標，發(fā)現(xiàn)當歸貝母苦參丸是以多成分交互作用于多靶點，通過參與雌激素、凋亡、趨化因子等信號通路以調(diào)控良性前列腺增生癥、前列腺癌等疾病發(fā)生發(fā)展過程。李曉宇等[18]、王玉等[16]以中醫(yī)藥整合藥理學平臺為方法深入挖掘了心可舒片干預(yù)動脈粥樣硬化與大黃抗肝癌的網(wǎng)絡(luò)作用機制。這些研究表明整合藥理學平臺適用于的中藥藥效成分以及分子機制的初步探索。本研究借助中藥整合藥理學計算平臺，分析柴胡高極性提部位對癲癇發(fā)揮治療作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及其分子機制。在整合藥理學平臺中藥材數(shù)據(jù)庫，鑒定了柴胡高極性部位化學成分共32種，進行了潛在靶標預(yù)測；同時建立了“menstrual”的候選疾病靶標；基于PPI相互作用數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建了柴胡潛在靶標與疾病靶標相互作用網(wǎng)絡(luò)，篩選出關(guān)鍵靶標22個，疾病與藥物共有靶點為ATP5A1、ATP5B、ATP1A1、ATP5C1、PPP3CA、AR、MED1、PGR、PTGS2、YWHAE；進一步進行了基因功能分析和通路富集分析，通路集中在帕金森病、能量代謝、亨廷頓氏病、卵母細胞減數(shù)分裂、神經(jīng)退行性疾病等。

本研究發(fā)現(xiàn)柴胡改善癇性發(fā)作與能量代謝密切相關(guān)。研究結(jié)果也顯示，ATP含量在癲癇小鼠海馬中的含量顯著降低，柴胡高極性部位能顯著提高ATP含量，與文獻報道一致。首先，線粒體功能障礙在癲癇的發(fā)生發(fā)展中占據(jù)重要作用，其中線粒體氧化呼吸鏈障礙是癲癇的重要誘因[38]。線粒體呼吸鏈是氧化磷酸化的場所，主要功能是完成電子傳遞過程，驅(qū)動氫離子移出內(nèi)膜轉(zhuǎn)變成跨膜的氫離子梯度，用于ATP的生物合成。因此，線粒體生物氧化呼吸鏈功能障礙可影響氧化磷酸化的功能，使ATP生成減少，若累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，則導致癲病發(fā)作[39]，同時有研究發(fā)現(xiàn)新生兒期癲癇患者腦組織中發(fā)現(xiàn)了線粒體氧化磷酸化抑制[40]。其中，ATP5B、ATP5C1和ATP5A1均為編碼線粒體ATP合成酶的亞單位，線粒體ATP合成酶在氧化磷酸化過程中利用跨膜質(zhì)子的電化學梯度催化ATP合成，柴胡可通過調(diào)節(jié)這些靶點影響ATP合成酶的生成，增加ATP的生成，從而改善癲癇狀態(tài)。在“成分-靶標”的關(guān)聯(lián)中（圖7），柴胡高極性部位主要成分包括柴胡皂苷C、柴胡皂苷B2與葡萄糖等，這些成分通過影響ATP合成酶、增加ATP的生成最終達到抗癲癇的作用。其次，柴胡可能通過ATP1A1調(diào)節(jié)離子通道異常在癲癇發(fā)作中能量代謝方面發(fā)揮了重要作用。1950年至今，細胞外高鉀離子濃度一直被認為會導致癲癇放電[41-43]。Na+, K+-ATP酶是一種完整的膜蛋白，負責建立和維持細胞膜上Na和K離子的電化學梯度。ATP1A1編碼的蛋白屬于P型陽離子轉(zhuǎn)運ATP酶家族，屬于Na+, K+-ATP酶亞家族。在本研究中，柴胡能作用于ATP1A1靶點，通過調(diào)節(jié)Na、K離子梯度，起到改善癲癇的作用。在“成分-靶標”的關(guān)聯(lián)中（圖7），柴胡高極性部位主要成分柴胡皂苷類，包括柴胡皂苷A[44]、柴胡皂苷M和柴胡苷元F等，通過影響Na+, K+-ATP酶起到細胞內(nèi)外的鉀鈉離子的平衡，最終達到抗癲癇的作用。最后，本研究發(fā)現(xiàn)柴胡可能通過調(diào)節(jié)鈣離子通路起到抗癲癇作用。最近研究表明，在癲癇患者中PPP3CA的突變，可能會刪除自抑制自動抑制（auto-inhibition，AI）結(jié)構(gòu)域，從而改變鈣調(diào)磷酸酶（一種鈣調(diào)節(jié)依賴的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶）的活性[45-47]。鈣是控制突觸質(zhì)變、分化和興奮性毒性過程的最重要的胞內(nèi)信使之一。鈣通過天冬氨酸受體（-methyl--aspartate，NMDARs）進入樹突狀棘是突觸傳遞的長時程增強和長期抑制所必需的[48]。其中鈣調(diào)磷酸酶是突觸囊泡循環(huán)的重要調(diào)節(jié)因子，是控制神經(jīng)傳遞的關(guān)鍵過程[49]。PPP3CA編碼Ca2+/CaM依賴的蛋白磷酸酶，介導轉(zhuǎn)錄因子和離子通道的活性，參與調(diào)節(jié)T細胞的活化。在本研究中，柴胡能作用于PPP3CA靶點，在“成分-靶標”的關(guān)聯(lián)（圖7）中，柴胡高極性部位主要成分脂肪酸類，包括棕櫚酸、硬脂酸、油酸等成分，通過調(diào)節(jié)鈣依賴性鈣調(diào)磷酸酶，來改善突觸囊泡循環(huán)最終達到抗驚厥的活性。

同時，本研究發(fā)現(xiàn)其他和癲癇發(fā)作密切相關(guān)的通路。帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是一種好發(fā)于中老年人的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是繼阿爾茨海默病后第2常見的神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病機制涉及線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥等多方面[50]。亨廷頓?。℉untington’s disease）是一種常染色體顯性遺傳的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，主要臨床特點為慢性進行性舞蹈樣不自主運動、精神障礙及癡呆，其發(fā)病機制與神經(jīng)元線粒體和新陳代謝的異常導致的能量代謝水平下調(diào)、軸突傳輸改變和突觸失衡密切相關(guān)[51]。帕金森病和亨廷頓病同時與能量代謝異常表現(xiàn)出很高的相關(guān)性，而柴胡高極性部位治療癲癇的靶點也主要集中在能量代謝，這可能是通路富集在帕金森病、亨廷頓病的主要原因。但是對于柴胡是否能通過調(diào)節(jié)能量代謝來治療帕金森病與亨廷頓病需要進一步的實驗證明。此外，富集通路還包括卵母細胞減數(shù)分裂與內(nèi)分泌系統(tǒng)，應(yīng)激是癲癇患者癲癇發(fā)作的主要誘因，激素水平與癲癇發(fā)作密切相關(guān)。PTGS2為前列腺素內(nèi)切酶又稱環(huán)氧合酶，是前列腺素生物合成中的關(guān)鍵酶；雄激素受體基因（androgen receptor，AR）能調(diào)控雄激素應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄；PGR基因編碼類固醇受體超家族的一個成員，編碼蛋白介導孕酮的生理效應(yīng)。柴胡的作用靶點包括PTGS2、AR和PGR，表明柴胡可能通過調(diào)節(jié)激素水平，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)起到治療癲癇的作用。

本研究從動物水平篩選出了柴胡抗驚厥活性部位，確定柴胡高極性部位具有顯著抗驚厥活性，并借助化學成分分析與中藥整合藥理學平臺結(jié)合對藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機制進行了預(yù)測，發(fā)現(xiàn)柴胡高極性部位主要通過調(diào)節(jié)能量代謝通路來抑制癲癇的發(fā)生，并通過改善ATP水平起到抗癲癇的作用。為進一步研究提供了方向性指導，其關(guān)鍵有效成分、靶點和通路仍有待進一步研究和驗證。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Antiepileptic effect and mechanism of different parts ofby integrative pharmacology

WANG Peng, GAO Xiao-xia, GAO Yao, XU Wen-qian, FENG Yan, LI Zhen-yu, QIN Xue-mei

Modern Research Center of Traditional Chinese Medicine, Shanxi University, Taiyuan 030006, China

To investigate the major active components and potential molecular mechanism ofin treatment of epilepsy.The activity-tracking method was used to obtain the anticonvulsant active parts ofby investigating the effects of three different polar sites on pentylenetetrazol (PTZ) kindled seizures in the rat. And the LC-MS technology was used to fully characterize the chemical components of the anticonvulsant active parts of. The protein targets related with epilepsy were collected by integrated pharmacology method and the interaction network of potential targets ofand epilepsy disease targets was constructed to illustrate the molecular mechanism.By screening for model dosage, 55.18 mg/kg PTZ was selected to establish the model. The time of clonic latency and tonic latency significantly was prolonged and number of convulsions significantly reduced in rats after high-polar fraction of(20 g/kg) treatment. A total of 32 chemical components was identified with the positive and negative ion mode, primarily including saikosaponins, fatty acids, sugars and coumarins, etc. A total of 22 key targets were screened. The main targets of disease and drug were ATP5A1, ATP5B, ATP1A1, ATP5C1, PPP3CA, PTGS2, AR, etc, which mainly related to Parkinson’s disease, energy metabolism, Huntington’s disease, oocyte meiosis, neurodegenerative diseases and other pathways. Furthermore, the keystone node in energy metabolism was validated by determining ATP content of hippocampus and liver, and the result showed that the decrease of ATP content in hippocampus and liver induced by epilepsy was significantly reversed by the high-polar fraction of.The high-polar fraction ofhas anticonvulsant activity, it inhibited the occurrence and development of seizures mainly by regulating energy metabolism. And saikosaponins and flavonoids mainly regulated energy metabolism by improving ATP content, which may be the main mechanism for the treatment of epilepsy with.

; pentylenetetraol; epilepsy; integrative pharmacology; energy metabolism

R285

A

0253 - 2670(2021)07 - 2024 - 15

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.07.020

2020-09-11

國家自然科學基金資助項目（81473415）；國家重點研發(fā)計劃課題項目（2019YFC1710800）；山西省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目杰出青年基金資助項目（201701D211009）；國家國際科技合作專項（2017ZX09301-047）；山西省重點研發(fā)計劃（社會發(fā)展方面）項目（201803D31019）；地產(chǎn)中藥功效物質(zhì)研究與利用山西省重點實驗室（201605D111004）

王 鵬（1994—），男，湖北天門人，博士研究生，研究方向為中藥藥動學研究。Tel: 18406592715 E-mall: wp18406592715@outlook.com

高曉霞，女，教授，博士生導師，主要從事中藥藥動學研究。Tel: (0351)7019297 E-mail: gaoxiaoxia@sxu.edu.cn

秦雪梅，女，教授，博士生導師，主要從事中藥質(zhì)控、評價與代謝組學研究。Tel: (0351)7011202 E-mail: qinxm@sxu.edu.cn

[責任編輯 潘明佳]