黃白溫敏型原位凝膠的處方篩選與評(píng)價(jià)

朱衛(wèi)豐，劉水婷，王萬(wàn)春，管詠梅

黃白溫敏型原位凝膠的處方篩選與評(píng)價(jià)

朱衛(wèi)豐1，劉水婷1，王萬(wàn)春2，管詠梅1*

1. 江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004 2. 江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 外一科，江西 南昌 330004

篩選并優(yōu)化黃白溫敏型原位凝膠的處方，并考察其經(jīng)皮滲透性能。以泊洛沙姆407（P407）、泊洛沙姆188（P188）、聚乙二醇6000（PEG6000）作為凝膠基質(zhì)材料，以膠凝溫度為考察指標(biāo)，采用Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化溫敏凝膠處方；對(duì)制備的溫敏凝膠進(jìn)行理化表征，并采用Franz透皮擴(kuò)散池法考察黃白溫敏凝膠的經(jīng)皮滲透性能。黃白溫敏型原位凝膠的最佳處方為P407 20.10%，P188 2.54%，PEG6000 2.00%，膠凝溫度為（34.2±0.2）℃，24 h內(nèi)歐前胡素、鹽酸小檗堿的累積滲透量分別為（14.07±1.34）、（395.72±35.04）μg/cm2，均符合Higuchi動(dòng)力學(xué)方程。制備的凝膠具有溫敏、緩釋作用，為臨床提供治療蛇蟲(chóng)咬傷的制劑奠定基礎(chǔ)。

黃白溫敏型原位凝膠；處方優(yōu)化；Box-Behnken效應(yīng)面法；經(jīng)皮滲透性能；歐前胡素；鹽酸小檗堿；Higuchi動(dòng)力學(xué)方程；溫敏；緩釋

毒蛇咬傷是嚴(yán)重影響勞動(dòng)人民生命健康的常見(jiàn)災(zāi)害性疾病，在我國(guó)每年有超過(guò)1萬(wàn)人死于毒蛇咬傷。中醫(yī)中藥治療毒蛇咬傷不僅有著悠久的歷史，并且獨(dú)具特色[1]。蛇蟲(chóng)咬傷后毒蛇毒蟲(chóng)的毒液進(jìn)入人體，患處表現(xiàn)出紅腫熱痛、皮膚表層溫度升高、炎癥反應(yīng)等局部癥狀，故臨床常外用給藥，直達(dá)病灶，發(fā)揮抗炎、消腫的作用。通過(guò)中華醫(yī)典數(shù)據(jù)庫(kù)和中醫(yī)資源網(wǎng)等的古文檢索發(fā)現(xiàn)，白芷外用常用于治療蛇蟲(chóng)咬傷，黃柏外用常用于解毒消腫，且以“黃柏”“白芷”“外敷/外用”為關(guān)鍵詞檢索發(fā)現(xiàn)，二者常配伍使用，發(fā)揮解毒、消腫、止痛等作用。然而，臨床治療蛇蟲(chóng)咬傷所致腫痛外用制劑多為散劑，其顆粒粗大，刺激性強(qiáng)，患者依從性不高。近年來(lái)，半固體凝膠劑以其制備簡(jiǎn)單、使用溫和備受青睞，而具有溫度響應(yīng)型凝膠頗具潛力，其為智能給藥系統(tǒng)，能夠?qū)崟r(shí)感知環(huán)境、用藥部位等的溫度變化并隨之發(fā)生相轉(zhuǎn)變，當(dāng)溫度低于臨界相變溫度（lower critical solution temperature，LCST）時(shí)呈液態(tài)，高于LCST時(shí)呈半固體凝膠態(tài)，從而延長(zhǎng)藥物滯留時(shí)間，持續(xù)釋藥，提高生物利用度[2-4]。因此，本課題組研制了一種環(huán)境響應(yīng)型凝膠劑——黃白溫敏凝膠，旨在研發(fā)出一種便于患者使用且能快速消除蛇蟲(chóng)咬傷致患處疼痛、腫脹的新型中藥外用制劑，擴(kuò)大其在臨床的使用范圍，為中藥復(fù)方外用制劑的發(fā)展提供借鑒。

1 材料

1.1 動(dòng)物

健康SPF級(jí)雄性昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)于江西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（贛）2018-0003，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號(hào)：JZSYDWLL-20200901。

1.2 試藥

白芷飲片，江西江中中藥飲片公司，批號(hào)160718，產(chǎn)地安徽；黃柏飲片，江西繼中堂健康科技有限公司，批號(hào)180801，產(chǎn)地四川，上述藥材均經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室葛菲教授鑒定，白芷為傘型科當(dāng)歸屬植物白芷(Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook. f.的干燥根，黃柏為蕓香科黃柏屬植物黃皮樹(shù)Schneid.的干燥樹(shù)皮，均符合《中國(guó)藥典》2020年版質(zhì)量要求。

對(duì)照品歐前胡素（批號(hào)110826-201616，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%）、鹽酸小檗堿（批號(hào)110713-201814，質(zhì)量分?jǐn)?shù)86.7%），中國(guó)食品藥品檢定研究院；泊洛沙姆407（P407，批號(hào)GNC2192B）、泊洛沙姆188（P188，批號(hào)GNC33221B），德國(guó)BASF公司；聚乙二醇6000（PEG6000，批號(hào)810T032），北京索萊寶科技有限公司；聚乙二醇4000（PEG4000，批號(hào)M1005A）、聚乙二醇400（PEG400，批號(hào)D1101A）、甘油（批號(hào)M1101A），大連美侖生物技術(shù)有限公司；甲醇，色譜純，西隴科學(xué)股份有限公司；磷酸，西隴化工股份有限公司；無(wú)水乙醇（批號(hào)2008239），西隴科學(xué)股份有限公司；純水，實(shí)驗(yàn)室純水儀自制。

1.3 儀器

EPED實(shí)驗(yàn)室級(jí)超純水器，南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司；Anto paar Physica MCR101型流變儀，奧地利安東帕公司；ZNCL-BS智能磁力攪拌器，西安安泰儀器科技有限公司；Agilent1260型高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司；Turbiscan Lab穩(wěn)定性分析儀，法國(guó)Formulaction公司；BSA 124S型電子分析天平，德國(guó)Sartorius公司；PHS-3C型pH計(jì)，上海雷磁儀器有限公司；SU8010掃描電子顯微鏡（SEM），日本日立公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取物的制備

在前期的提取工藝考察基礎(chǔ)上，提取藥材得到提取液，水浴蒸干后置于45 ℃真空干燥得提取物粉末。黃柏提取物：8倍量60%乙醇為溶劑，提取3次，每次1 h，投藥量為5%（按原粉計(jì)，浸膏得率為13.42%）；白芷提取物：10倍量75%乙醇為溶劑，提取3次，每次1 h，投藥量為5%（按原粉計(jì)，浸膏得率為10.12%）。

2.2 助溶劑的篩選

采用法國(guó)Turbiscan Lab型近紅外穩(wěn)定性分析儀比較溫敏凝膠的穩(wěn)定性[5-6]。固定P407和P188的比例不變，以不同的助溶劑（PEG6000、PEG4000、甘油、PEG400）制備溫敏凝膠，篩選最佳助溶劑；將樣品置于樣品瓶中，25 ℃下測(cè)定，每天掃描1次，連續(xù)測(cè)定7 d。體系整體動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定性結(jié)果如圖1所示，由圖1可知?jiǎng)恿W(xué)不穩(wěn)定性指數(shù)（TSI）值為PEG4000＞甘油＞PEG400＞PEG6000，即以PEG6000為助溶劑時(shí)溫敏凝膠的穩(wěn)定性最佳，因此選擇PEG6000作為凝膠助溶劑。

圖1 穩(wěn)定性掃描圖

2.3 制備工藝

采用“冷溶法”制備溫敏凝膠[7]，將PEG6000溶于處方量的水中，并加入處方量的黃柏和白芷提取物，超聲使其完全溶解，冰水浴下依次緩慢加入處方量的P407、P188，攪拌均勻，然后置于4～10 ℃冰箱冷藏24 h，使其充分溶脹，得到澄清、分散均勻的藥物凝膠溶液。

2.4 膠凝溫度（gelation temperature，Tg）的測(cè)定

采用“攪拌子法”測(cè)定溫敏凝膠的g[8-9]，取溫敏凝膠液5 mL，加入攪拌子，并插入探針式溫度計(jì)（準(zhǔn)確度為0.1 ℃），使溫度計(jì)的探針完全浸沒(méi)在溫敏凝膠液中，置于磁力攪拌器上，轉(zhuǎn)速設(shè)置為200 r/min，持續(xù)緩慢升溫，使凝膠液的溫度上升速率為1～2 ℃/min，觀察并記錄凝膠完全凝結(jié)（不流動(dòng)）時(shí)的溫度，即為g，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，取平均值。

2.5 處方優(yōu)化

2.5.1 單因素考察 以g作為考察指標(biāo)，對(duì)不同用量的P407（20%、21%、22%、23%、24%）、P188（1%、2%、3%、4%、5%）及PEG6000（1%、2%、3%、4%、5%）進(jìn)行單因素考察，結(jié)果P407用量越高，g越低；P188用量越高，g越高；PEG6000用量越高，g越高，且PEG6000用量超過(guò)3%時(shí)凝膠黏度降低，用量為5%時(shí)溫度加熱至55 ℃仍無(wú)法完全膠凝。

2.5.2 Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化溫敏凝膠基質(zhì)處方 使用Design Expert 8.0.6軟件，根據(jù)單因素考察的試驗(yàn)結(jié)果，選擇P407用量（1）、P188用量（2）、PEG6000用量（3）為主要影響因素，并確定其用量范圍：120%～24%、21%～5%、31%～3%，以g為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行處方優(yōu)選，根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)的原理，各因素設(shè)置3水平，用代碼值?1、0、+1來(lái)表示，以g為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行處方優(yōu)選，Box-Behnken效應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)的因素水平、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5.3 方差分析與顯著性檢驗(yàn) 采用ANOVA分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，由表2的各回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)可得，模型方程中1、2、3均為對(duì)g有極顯著影響。

2.5.4 模型擬合 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸擬合，得到方程：g＝30.66－4.341＋1.752＋1.943－0.4012－0.8313＋0.3523－0.1412－0.01722－1.5432。通過(guò)方程可以看出，在測(cè)定范圍內(nèi)，隨著1的升高，膠凝溫度明顯降低，而隨著2、3的升高，膠凝溫度明顯升高。該模型＜0.000 1，表明有極顯著性差異；相關(guān)系數(shù)2＝0.985 8，表明該模型預(yù)測(cè)值與測(cè)定值的相關(guān)性良好。失擬項(xiàng)＝0.102 1＞0.05，不具有顯著性，表明方程擬合度和可信度良好。利用Design Expert 8.0.6軟件繪制實(shí)驗(yàn)結(jié)果的二維等高線圖和三維效應(yīng)圖見(jiàn)圖2。

表1 Box-Behnken效應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)的因素水平、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表2 各項(xiàng)因素回歸系數(shù)和方差分析

圖2 X1、X2、X3對(duì)Tg影響的效應(yīng)面圖與等高線圖

2.5.5 優(yōu)化工藝驗(yàn)證 通過(guò)分析結(jié)果，并將膠凝溫度控制在34～36 ℃，從而得到最佳處方為1＝20.10%，2＝2.54%，3＝2.00%；即P407 20.10%，P188 2.54%，PEG6000 2.00%。按優(yōu)化工藝制備3批溫敏凝膠，測(cè)定其g，實(shí)測(cè)值為（34.2±0.2）℃（＝3），預(yù)測(cè)值為34.15 ℃，偏差為0.73%。

2.6 凝膠載藥量的考察

2.6.1 載藥量對(duì)溫敏凝膠性狀的影響考察 采用上述最優(yōu)處方，考察不同載藥量，按照“2.3”項(xiàng)方法制備載藥量為2%、3%、4%、5%、6%、7%、9%、10%、12%、15%、20%（按原粉計(jì)，且黃柏-白芷1∶1）的凝膠，比較以下性狀，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.6.2 載藥量對(duì)凝膠黏彈性區(qū)間及頻率掃描曲線的影響考察 使用Anton Paar Physica MCR101型流變儀，試樣用PP50不銹鋼平行板（直徑50 mm），間隙1 mm，測(cè)定儲(chǔ)能模量（′）和損耗模量（″），測(cè)試均在（35.0±0.5）℃下進(jìn)行。通過(guò)振幅掃描（應(yīng)變?yōu)?.01%～100%，頻率為10 rad/s）測(cè)定樣品的線性黏彈區(qū)間，結(jié)果如圖3所示，頻率掃描（應(yīng)變?yōu)?%，頻率掃描范圍0.1～100 Hz）如圖4所示。

由上述結(jié)果可知，載藥量對(duì)溫敏凝膠的黏彈性及頻率掃描曲線無(wú)顯著性影響，但是隨著載藥量增加溫敏凝膠的pH值也隨之降低，并呈現(xiàn)出一定的pH值依賴性，當(dāng)載藥量過(guò)大時(shí)，溫敏凝膠的膠凝溫度開(kāi)始下降，可能原因?yàn)檩d藥量增加，pH值降低，溶液存在大量氫離子，從而影響了分子間氫鍵結(jié)合力，相鄰分子間的纏結(jié)作用減弱，致使膠凝溫度降低。綜合以上結(jié)果確定最終凝膠載藥量為5%。

表3 不同載藥量的考察

2.7 黃白溫敏凝膠的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.7.1 外觀及性狀觀察 室溫下，載藥溶膠為黃棕色均勻分散的溶液，流動(dòng)性好。相變溫度以上（溫度＞34.2 ℃）載藥凝膠為黃棕色的半固體，形態(tài)良好，透明均勻，有一定彈性，不能流動(dòng)，見(jiàn)圖5。

圖3 不同載藥量的線性黏彈區(qū)間圖

圖4 不同載藥量的頻率掃描曲線圖

2.7.2 膠凝溫度與膠凝時(shí)間的測(cè)定 采用“2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定凝膠的膠凝溫度為（34.2±0.2）℃，另取4 ℃冷藏24 h的溫敏凝膠溶液，恢復(fù)至室溫后，取5 mL于西林瓶中，放在35 ℃水浴鍋中，以倒置西林瓶15 s凝膠溶液未發(fā)生流動(dòng)時(shí)的時(shí)間作為該凝膠溶液的膠凝時(shí)間，平行測(cè)定3次，結(jié)果膠凝時(shí)間為（53.6±0.8）s。

圖5 溫敏凝膠形態(tài)

2.7.3 pH值的測(cè)定 使用pH計(jì)直接測(cè)定溫敏凝膠的pH值，結(jié)果pH值為5.78±0.02，符合經(jīng)皮給藥制劑pH 5～7的要求。

2.7.4 離心、耐寒、耐熱穩(wěn)定性 取本品適量置于離心管中，分別于3000 r/min離心30 min、50 ℃和?20 ℃儲(chǔ)存24 h，均未出現(xiàn)分層現(xiàn)象。

2.7.5 溫敏凝膠的SEM觀察 先將溫敏凝膠制成凍干粉，取適量凝膠粉末，噴金，加速電壓3.0 kV，采用場(chǎng)發(fā)射SEM[10-11]觀察凝膠表面的微觀結(jié)構(gòu)形態(tài)及其孔徑大小。結(jié)果溫敏凝膠三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖6。

圖6 溫敏凝膠SEM圖

2.7.6 溫敏凝膠的滲透壓的測(cè)定 采用Osmomat 030冰點(diǎn)滲透壓計(jì)測(cè)定凝膠的滲透壓[12]，測(cè)得其平均滲透壓為1302 mOsmol/kg，大于等滲溶液（280～320 mOsmol/kg），即其具有高滲作用，基于唐南平衡理論，表明該制劑應(yīng)用于蛇蟲(chóng)咬傷所致的腫脹傷口，具有良好的消腫作用。

2.7.7 溫敏凝膠的流變學(xué)性質(zhì)考察[13-14]使用Anton Paar Physica MCR101型流變儀，試樣用PP50不銹鋼平行板（直徑50 mm），間隙1 mm，除相變溫度測(cè)定外其他均在（35.0±0.5）℃下進(jìn)行測(cè)試。

（1）凝膠線性黏彈區(qū)（LVER）：通過(guò)LVER測(cè)試結(jié)果可得到凝膠的內(nèi)部三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞所能承受的最大形變，振幅掃描（應(yīng)變?yōu)?.01%～100%，頻率為10 rad/s）測(cè)定樣品的LVER的結(jié)果見(jiàn)圖7。從圖中可知應(yīng)變（）＜1%，′＞″，彈性占主體，既樣品表現(xiàn)出凝膠結(jié)構(gòu)，當(dāng)＞1%，′開(kāi)始下降，當(dāng)′＝″時(shí)，凝膠結(jié)構(gòu)完全被破壞，′＜″，黏性占主體，表現(xiàn)出流體性質(zhì)。因此，所有的動(dòng)態(tài)振蕩實(shí)驗(yàn)都需控制在1%以內(nèi)。

圖7 凝膠線性黏彈區(qū)間

（2）相變溫度測(cè)定：在振蕩模式下測(cè)量凝膠的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變溫度。頻率固定在1 Hz，進(jìn)行1%應(yīng)變。樣品以2 ℃/min的速率加熱，溫度范圍在5～50 ℃。結(jié)果見(jiàn)圖8和9。由圖8可知，在34 ℃左右′和″相交，交點(diǎn)即其相變溫度。在此溫度前樣品主要存在損耗模量，表現(xiàn)出明顯的流體性質(zhì)，相變溫度后逐漸′＞″，說(shuō)明凝膠結(jié)構(gòu)正在形成，且′和″趨于平緩，證明凝膠黏彈性趨于穩(wěn)定。圖9為通過(guò)復(fù)合黏度可表征樣品整體的黏彈性質(zhì)，隨著溫度的升高，樣品的復(fù)合黏度發(fā)生突變，突變點(diǎn)即為凝膠的相變溫度，與圖8一致。

（3）頻率掃描：頻率掃描旨在描述樣品在非破壞性變形范圍內(nèi)的時(shí)間相關(guān)特性，在振蕩模式下對(duì)凝膠進(jìn)行頻率掃描（應(yīng)變?yōu)?%，頻率掃描范圍0.1～100 Hz）。高頻率指在較短時(shí)間尺度內(nèi)的快速運(yùn)動(dòng)，而低頻率指在較長(zhǎng)時(shí)間尺度內(nèi)的緩慢運(yùn)動(dòng)或靜止?fàn)顟B(tài)?？捎糜诒碚髂z內(nèi)部結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。結(jié)果如圖10所示。在整個(gè)頻率掃描范圍內(nèi)中，′曲線始終高于″曲線，表現(xiàn)出明顯的以彈性為主的特性，且′較穩(wěn)定，未出現(xiàn)顯著的頻率依賴性，表明凝膠始終具有穩(wěn)定的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

圖8 動(dòng)態(tài)溫度掃描圖

圖9 復(fù)合黏度隨溫度變化掃描圖

圖10 頻率掃描圖

2.8 溫敏凝膠離體經(jīng)皮滲透性研究[15-16]

2.8.1 白芷中歐前胡素經(jīng)皮滲透方法學(xué)的建立

（1）色譜條件：菲羅門C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水溶液（75∶25）；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)300 nm；進(jìn)樣20 μL；柱溫30 ℃。理論塔板數(shù)≥5000，分離度＞1.5。

（2）對(duì)照品溶液的配制：精密稱定歐前胡素對(duì)照品適量于量瓶中，加甲醇定容并制成歐前胡素質(zhì)量濃度為14.75 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，低溫密封儲(chǔ)存，備用。

（3）專屬性試驗(yàn)：精密吸取歐前胡素對(duì)照品溶液、藥物凝膠透皮接收液、空白凝膠透皮接收液各20 μL，按“2.8.1（1）”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖（圖11），結(jié)果表明方法專屬性良好。

（4）線性關(guān)系考察：取歐前胡素對(duì)照品儲(chǔ)備液，用甲醇依級(jí)稀釋至7.38、3.69、1.84、0.92、0.46、0.23 μg/mL的系列歐前胡素對(duì)照品溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，將對(duì)照品溶液注入液相色譜儀，按“2.8.1（1）”項(xiàng)方法測(cè)定峰面積。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示歐前胡素的線性方程為＝34.857－0.916 6，＝1.000 0，結(jié)果表明歐前胡素在0.23～14.75 μg/mL線性關(guān)系良好。

圖11 歐前胡素對(duì)照品(A)、藥物凝膠透皮接收液(B)和空白凝膠透皮接收液(C)的HPLC圖

（5）精密度試驗(yàn)：精密吸取0.92 μg/mL歐前胡素對(duì)照品溶液20 μL，按“2.8.1（1）”項(xiàng)方法重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果歐前胡素峰面積的RSD為0.59%，表明儀器精密度良好。

（6）重復(fù)性試驗(yàn)：平行制備透皮供試品溶液6份，按“2.8.1（1）”項(xiàng)方法測(cè)定，計(jì)算的歐前胡素質(zhì)量濃度的RSD為4.37%，結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

（7）穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算其峰面積的RSD為0.34%。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

（8）加樣回收率試驗(yàn)：精密吸取1.88、3.76、7.36 μg/mL歐前胡素對(duì)照品儲(chǔ)備液，用空白凝膠透皮接收液配制低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，各平行3份，按“2.8.1（1）”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果平均加樣回收率為101.64%，RSD為2.08%。

2.8.2 黃柏中鹽酸小檗堿經(jīng)皮滲透方法學(xué)的建立

（1）色譜條件：菲羅門C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50）（每100毫升加十二烷基磺酸鈉0.08 g）；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm，進(jìn)樣量5 μL。

（2）對(duì)照品溶液的配制：精密稱定鹽酸小檗堿對(duì)照品適量于量瓶中，加甲醇定容并制成鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度為125.00 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，低溫密封儲(chǔ)存，備用。

（3）專屬性試驗(yàn)：精密吸取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液、藥物凝膠透皮接收液、空白凝膠透皮接收液各5 μL，按“2.8.2（1）”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖（圖12），結(jié)果表明方法專屬性良好。

圖12 鹽酸小檗堿對(duì)照品(A)、藥物凝膠透皮接收液(B)和空白凝膠透皮接收液(C)的HPLC圖

（4）線性關(guān)系考察：取鹽酸小檗堿對(duì)照品儲(chǔ)備液，用甲醇依級(jí)稀釋至62.50、31.25、15.63、7.81、3.91、1.96 μg/mL的系列鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，將對(duì)照品溶液注入液相色譜儀，按“2.8.2（1）”項(xiàng)方法測(cè)定峰面積。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示歐前胡素的線性方程為＝11.231－10.604，＝0.999 8，結(jié)果表明鹽酸小檗堿在1.96～125.00 μg/mL線性關(guān)系良好。

（5）精密度試驗(yàn)：精密吸取15.63 μg/mL鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液5 μL，按“2.8.2（1）”項(xiàng)方法重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果鹽酸小檗堿峰面積的RSD為0.15%，表明儀器精密度良好。

（6）重復(fù)性試驗(yàn)：平行制備透皮供試品溶液6份，按“2.8.2（1）”項(xiàng)方法測(cè)定，計(jì)算鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度的RSD為2.19%，結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

（7）穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算鹽酸小檗堿峰面積的RSD為0.13%。結(jié)果表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

（8）加樣回收率試驗(yàn)：精密吸取15.63、31.25、62.50 μg/mL鹽酸小檗堿對(duì)照品儲(chǔ)備液，用空白凝膠透皮接收液配制低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，各平行3份，按“2.8.2（1）”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果平均加樣回收率為104.16%，RSD為0.38%。

2.8.3 小鼠離體皮膚的制備 選取18～22 g健康SPF級(jí)昆明雄性小鼠，剃除腹部毛發(fā)，麻醉后剃毛，快速分離腹部皮膚，用脫脂棉擦除皮下脂肪及黏液組織，生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分后用鋁箔紙包裹，于?20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.8.4 離體透皮滲透擴(kuò)散裝置及條件 采用改良Franz擴(kuò)散池，擴(kuò)散面積1.825 cm2，接收池容積為12 mL，恒溫水浴溫度控制在（37.0±0.5）℃，轉(zhuǎn)速設(shè)定為300 r/min，每次取樣量為1 mL。將制備好的小鼠腹部皮膚按照擴(kuò)散池面積裁剪，置于擴(kuò)散池與接收池之間，真皮層面向接收池。接收池中放入磁力攪拌子，并加入含30%乙醇溶液的生理鹽水12 mL，使用前超聲脫氣。將1 mL凝膠均勻涂抹于皮膚表面，平行6份。分別于4、6、8、10、12、24 h精密移取接收液1 mL，同時(shí)立即補(bǔ)加等量的空白接收液，以保證接收液環(huán)境不變。接收液以0.22 μm的微孔濾膜濾過(guò)，備用。

2.8.5 數(shù)據(jù)分析[17]藥物的累積透過(guò)量（Q）的計(jì)算公式如下。

表示有效擴(kuò)散面積（1.825 cm2），為接收液總體積（12 mL），V為取樣體積（1 mL），C為第次取樣時(shí)接收液中藥物的質(zhì)量濃度，C表示第次取樣時(shí)接收液中藥物的質(zhì)量濃度

以藥物的Q為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，并采用零級(jí)、一級(jí)、Higuchi、Ritger-Peppas、Hixon-Crowell模型對(duì)-進(jìn)行模型擬合，同時(shí)對(duì)曲線中的直線部分進(jìn)行線性回歸，求出的直線斜率即為穩(wěn)態(tài)透皮速率［s，μg/(cm2·h)］，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取下皮膚，生理鹽水洗凈，將給藥部分皮膚剪碎后，加入甲醇1 mL，超聲30 min，于8000 r/min離心10 min，取上清液，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，測(cè)定含量，并計(jì)算藥物滯留量（s，s＝/，為有效擴(kuò)散面積，為溶解樣品體積，為測(cè)得的藥物質(zhì)量濃度），結(jié)果見(jiàn)圖13和表4。黃白溫敏凝膠中歐前胡素與鹽酸小檗堿的釋藥均Huguchi釋放動(dòng)力學(xué)方程，且Ritger-Peppas方程擬合系數(shù)均大于0.89。

圖13 溫敏凝膠中歐前胡素和鹽酸小檗堿累積透過(guò)量(, n = 5)

3 討論

溫敏凝膠是一種新型的智能緩釋制劑，其凝膠過(guò)程不需要額外的添加劑和化學(xué)反應(yīng)參與，且溫度是生物體本身所具備的一種體征，故其自發(fā)現(xiàn)以來(lái)一直是醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，已被應(yīng)用于黏膜給藥、注射給藥、直腸給藥及經(jīng)皮給藥等。

在凝膠劑的制備過(guò)程中，通常以水作為介質(zhì)，故只能溶解水溶性藥物，當(dāng)需要在凝膠體系中加入不溶于水或難溶于水的藥物時(shí)，親水性助溶劑的使用是必要的。本研究使用Turbiscan Lab穩(wěn)定性分析儀比較了不同助溶劑對(duì)溫敏凝膠體系的穩(wěn)定性影響，其優(yōu)點(diǎn)在于：①溫敏凝膠在常溫下呈液態(tài)溶膠狀態(tài)，符合Turbiscan Lab穩(wěn)定性分析儀的測(cè)定要求；②儀器測(cè)量時(shí)采用非進(jìn)入式方法，不稀釋，無(wú)外力，不攪動(dòng)，可直接表述分散體系的真實(shí)狀態(tài)；③可準(zhǔn)確、快速、完全地表征處方不穩(wěn)定性和變化過(guò)程，為溫敏凝膠的處方篩選和評(píng)價(jià)提供了理想手段。

本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken響應(yīng)面法[18]對(duì)處方進(jìn)行了優(yōu)化，二項(xiàng)式擬合效應(yīng)面反映了P407、P188、PEG6000與溫度的變化規(guī)律，且模型擬合度和可信度良好。此外，本研究還對(duì)溫敏凝膠進(jìn)行了表征，掃描電鏡結(jié)果可看出溫敏凝膠形成了一定的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)排列整齊，孔隙疏松，相互貫通；通過(guò)冰點(diǎn)滲透壓儀測(cè)定其滲透壓，發(fā)現(xiàn)以高分子材料制備的溫敏凝膠劑具有高滲作用，基于唐南平衡理論，可知其作用于腫脹皮膚可以快速的反滲出腫脹部位的組織液，以達(dá)到良好的消腫止痛作用，這不僅解決了散劑由于礦物藥加入，在溶解時(shí)放熱和高濃度鹽溶液環(huán)境帶來(lái)的皮膚刺激性，同時(shí)水凝膠的使用也可以增加患者舒適性與適應(yīng)性；同時(shí)還采用流變儀對(duì)溫敏凝膠流變學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，流變學(xué)特性是凝膠劑的重要特征[19]，相對(duì)于黏稠度、硬度、涂展性這類宏觀且主觀性質(zhì)評(píng)價(jià)，流變學(xué)的精確度、可信度、重復(fù)性更高[20]，且獲得的參數(shù)對(duì)于分析凝膠結(jié)構(gòu)、凝膠強(qiáng)度、黏彈性、膠凝行為、物理穩(wěn)定性等具有更高價(jià)值和意義，并使凝膠劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)更趨科學(xué)化[21]。

表4 歐前胡素和鹽酸小檗堿的經(jīng)皮滲透動(dòng)力學(xué)參數(shù)(,n = 5)

本實(shí)驗(yàn)采用Franz擴(kuò)散池法研究了黃白溫敏凝膠的體外經(jīng)皮吸收行為，結(jié)果顯示其中歐前胡素和鹽酸小檗堿的累積滲透量Q-模型擬合均符合Huguchi釋放動(dòng)力學(xué)方程，表明藥物釋放存在一定的緩釋效果，且Ritger-Peppas方程擬合系數(shù)大于0.89，說(shuō)明釋藥機(jī)制骨架溶蝕作用。

由于本實(shí)驗(yàn)主要研究了完整皮膚的經(jīng)皮滲透性，而臨床實(shí)際情況為被蛇蟲(chóng)咬傷的破損皮膚，故后期應(yīng)該增加其他更深入的研究從而更真實(shí)的描述藥物的經(jīng)皮吸收行為。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 王志強(qiáng), 陳思婷, 吳事仁, 等. 王萬(wàn)春運(yùn)用中醫(yī)藥綜合治療毒蛇咬傷經(jīng)驗(yàn) [J]. 光明中醫(yī), 2017, 32(12): 1706-1708.

[2] Wang W, Wat E, Hui P C,. Dual-functional transdermal drug delivery system with controllable drug loading based on thermosensitive poloxamer hydrogel for atopic dermatitis treatment [J]., 2016, 6: 24112.

[3] Qi X J, Liu X Y, Tang L M,. Anti-depressant effect of curcumin-loaded guanidine-chitosan thermo-sensitive hydrogel by nasal delivery [J]., 2020, 25(3): 316-325.

[4] Gong C, Qi T, Wei X,. Thermosensitive polymeric hydrogels as drug delivery systems [J]., 2013, 20(1): 79-94.

[5] Bordes C, Snabre P, Frances C,. Optical investigation of shear- and time-dependent microstructural changes to stabilized and depletion- flocculated concentrated latex sphere suspensions [J]., 2003, 130(1/2/3): 331-337.

[6] 孫美潔, 鄭劍平, 王浩, 等. 利用Turbiscan Lab穩(wěn)定性分析儀研究水焦?jié){的穩(wěn)定性 [J]. 石油學(xué)報(bào): 石油加工, 2016, 32(6): 1164-1170.

[7] 盧浩揚(yáng), 林媛媛, 車俊秀, 等. 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化芷芎散溫敏凝膠的處方及其鼻黏膜滲透特性研究 [J]. 中草藥, 2014, 45(13): 1845-1849.

[8] 梁浩明, 龍曉英, 盧彬. 黃芩苷外用溫敏凝膠的處方設(shè)計(jì)及優(yōu)化 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2014, 20(24): 34-38.

[9] 劉媛媛. 溫敏型眼用葛根素原位凝膠的制備與質(zhì)量評(píng)價(jià) [J]. 華西藥學(xué)雜志, 2019, 34(3): 132-136.

[10] 潘亞輝, 高樹(shù)中. 基于溫度響應(yīng)性納米復(fù)合物對(duì)臍療新制劑及藥物釋放的研究 [J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2019, 34(5): 2145-2149.

[11] 羅堯堯, 廖倩, 王婷, 等. 美洲大蠊溫敏凝膠的制備及其促糖尿病大鼠創(chuàng)面修復(fù)作用考察 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2020, 26(14): 164-172.

[12] 李春雨, 張丹參, 王樹(shù), 等. 珍珠滴眼凝膠的滲透壓測(cè)定 [J]. 河北北方學(xué)院學(xué)報(bào): 醫(yī)學(xué)版, 2009, 26(1): 16-18.

[13] 唐隨意. 布地奈德溫敏凝膠灌腸液的研究 [D]. 武漢: 湖北中醫(yī)藥大學(xué), 2019.

[14] 李曼. 托吡卡胺眼用溫度敏感原位凝膠的研制 [D]. 重慶: 第三軍醫(yī)大學(xué), 2014.

[15] 管詠梅, 宋昕祁, 劉佳, 等. 解郁安神凝膠貼膏劑的處方優(yōu)選與質(zhì)量評(píng)價(jià) [J]. 中草藥, 2019, 50(23): 5731-5738.

[16] 劉麗麗, 史畑女, 方蕾, 等. 馬錢子總堿-白芍總苷脂質(zhì)立方液晶納米粒制備及體外評(píng)價(jià) [J]. 中草藥, 2019, 50(17): 4076-4083.

[17] 夏愛(ài)曉, 蔣正立, 李勝英, 等. 馬來(lái)酸噻嗎洛爾溫敏凝膠的制備及體外透皮考察 [J]. 中國(guó)藥師, 2020, 23(7): 1453-1456,1463.

[18] 甘帥, 章津銘, 江茂源, 等. 基于響應(yīng)面法優(yōu)選美洲大蠊口腔原位溫敏凝膠的制備研究 [J]. 中草藥, 2020, 51(8): 2134-2140.

[19] Pisal P B, Patil S S, Pokharkar V B. Rheological investigation and its correlation with permeability coefficient of drug loaded carbopol gel: Influence of absorption enhancers [J]., 2013, 39(4): 593-599.

[20] 鄭學(xué)晶, 劉芳蓓, 裴瑩, 等. 水凝膠流變學(xué)研究概況 [J]. 高分子通報(bào), 2017(5): 1-10.

[21] Siska B, Snejdrova E, Machac I,. Contribution to the rheological testing of pharmaceutical semisolids [J]., 2019, 24(1): 80-88.

Selection and evaluation of prescription of temperature-sensitive-gel ofand(Yellow-white)

ZHU Wei-feng1, LIU Shui-ting1, WANG Wan-chun2, GUAN Yong-mei1

1. Key Laboratory of Modern Preparation of Traditional Chinese Medicine (TCM) of Ministry of Education, Jiangxi University of TCM, Nanchang 330004, China 2. Department of External Medicine, Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China

To select and optimize theand(Yellow-white) thermosensitive in-situ gel, and to investigate its transdermal permeability.Using poloxamer 407, poloxamer 188, and PEG6000 as gel matrix materials, and taking gelation temperature as investigation index, Box-Behnken response surface method was used to optimize the gel matrix prescription. At the same time, the thermosensitive gel was characterized, and the transdermal permeability of drugs in the yellow-white thermosensitive in-situ gel was investigated by Franz transdermal diffusion cell.The best prescription of thermosensitive in-situ gel is P407 20.10%, P188 2.54%, PEG6000 2.00%, and the gelation temperature is (34.2 ± 0.2) ℃. Within 24 h, the cumulative permeation of imperatorin and berberine were (14.07 ± 1.34) and (395.72 ± 35.04) μg/cm2, respectively, and the release process of imperatorin and berberine followed Higuchi kinetic equation.The gel prepared in this study has temperature sensitivity and slow release, which can lay the foundation for clinical preparation for treating snake and insects bites.

yellow-white temperature sensitive in situ gel; optimization of prescription; Box-Behnken response surface methodology; percutaneous permeability; imperatorin; berberine hydrochloride; Higuchi kinetic equation; temperature sensitive; release slowly

R283.6

A

0253 - 2670(2021)07 - 1914 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.07.008

2020-11-20

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)基金項(xiàng)目（82060722）；江西省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（20202BAB206081）

朱衛(wèi)豐，教授，博士研究生導(dǎo)師，博士，研究方向?yàn)橹兴幮聞┬团c新制劑研究。E-mail: zwf0322@126.com

管詠梅，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樗幬镄聞┬汀⑿录夹g(shù)。Tel: (0791)87118614 E-mail: guanym2008@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]