不同粒徑波棱甲素納米混懸劑的制備及藥動(dòng)學(xué)研究

杭凌宇，申寶德，沈成英，楊 闊，袁海龍*

·藥劑與工藝·

不同粒徑波棱甲素納米混懸劑的制備及藥動(dòng)學(xué)研究

杭凌宇1, 2，申寶德2，沈成英2，楊 闊1，袁海龍2*

1. 江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌 330004 2. 空軍特色醫(yī)學(xué)中心 藥學(xué)部，北京 100042

制備不同粒徑波棱甲素納米混懸劑（herpetrione nanosuspension，Her-NS），并探討粒徑對(duì)Her-NS口服生物利用度的影響。采用反溶劑沉淀法制備2種不同粒徑Her-NS，采用單因素實(shí)驗(yàn)以平均粒徑、多分散系數(shù)、穩(wěn)定性指數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)化處方工藝參數(shù)，掃描電子顯微鏡（SEM）觀察Her-NS形態(tài)，X射線衍射（XRD）分析晶型，透析法研究體外釋放特性。通過SD大鼠比較2種不同粒徑Her-NS口服藥動(dòng)學(xué)差異。以P188、P407為穩(wěn)定劑分別制備了200、450 nm 2種不同粒徑Her-NS（Her-NS200、Her-NS450），SEM顯示2種粒徑的Her-NS均為球狀，XRD分析表明2種粒徑Her-NS均為無定型態(tài)。體外釋放度與藥動(dòng)學(xué)結(jié)果顯示，與波棱甲素原料藥比較，2種粒徑Her-NS的累積釋放度明顯提高，Her-NS的達(dá)峰濃度（max）、藥時(shí)曲線下面積（AUC0～t）均顯著提高；Her-NS200的max、AUC0～t均高于Her-NS450。Her-NS可明顯提高波棱甲素口服生物利用度，且粒徑越小，生物利用度越高。

波棱甲素；反溶劑沉淀法；納米混懸劑；粒徑；體外釋放；藥動(dòng)學(xué)；口服生物利用度

波棱瓜子是葫蘆科波棱瓜屬植物波棱瓜Wall.的干燥成熟種子，為藏醫(yī)臨床治療肝病的常用藥物之一[1]。波棱瓜子藥用歷史悠久，療效確切，其味苦，性寒，能清腑熱、膽熱，具有清熱解毒、去火降熱、助消化的作用，用于治療肝熱、黃疸性傳染型肝炎等[1]?，F(xiàn)代研究表明，波棱瓜子具有保肝降酶、抗乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）及抗肝纖維化等多種藥理作用[2-3]。波棱甲素（herpetrione，Her）分子式為C30H32O10，相對(duì)分子質(zhì)量552.579，是從波棱瓜子的中分離得到的活性木脂素單體化合物[4-5]，其對(duì)-氨基半乳糖誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用，可有效抑制HepG2.215細(xì)胞乙型肝炎表面抗原HBsAg和乙型肝炎e抗原HBeAg的表達(dá)及HBV-DNA的復(fù)制，并呈現(xiàn)一定的劑量相關(guān)性。但它在水中幾乎不溶，屬于難溶性木脂素類藥物，口服生物利用度低，極大地限制了該藥物的臨床應(yīng)用。

納米混懸劑（nanosuspension，NS）是由藥物粒子與少量穩(wěn)定劑組成的亞微膠體分散體系[6-7]，不同于傳統(tǒng)意義上的基質(zhì)骨架型納米體系，NS輔料添加少，載藥量高，尤其適用于難溶性中藥有效成分及有效部位的開發(fā)[8]。近年來，NS的體內(nèi)行為越來越受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，粒徑通過影響表觀溶解度及其在生物膜上的通透性和轉(zhuǎn)運(yùn)途徑從而影響NS的吸收和分布[9-11]。

本實(shí)驗(yàn)采用反溶劑沉淀法制備2種不同粒徑的Her-NS，以平均粒徑（PS）、多分散指數(shù)（PDI）及穩(wěn)定性指數(shù)（SI）為指標(biāo)，通過單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化處方和工藝，利用掃描電子顯微鏡（SEM）、X射線衍射分析（XRD）觀察其形態(tài)、晶型變化，并進(jìn)行初步的藥動(dòng)學(xué)研究。

1 儀器與試藥

LCMS-2010EV高效液相色譜儀，日本島津公司；Winner802納米粒度儀，濟(jì)南微納顆粒儀器股份有限公司；BT125D分析天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；DF-101D集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；KH5200DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；WH861渦旋混合器，北京科爾德科貿(mào)有限公司；S-4800掃描電子顯微鏡，日本日立公司。

波棱甲素，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%，實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)SPR190505-KZ01；泊洛沙姆188（P188）、泊洛沙姆407（P407）均購于北京鳳禮精求商貿(mào)有限責(zé)任公司；羥丙甲纖維素HPMC-E15、HPMC-E50，購自安徽山河藥用輔料有限公司；甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑為分析純。

SD大鼠，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，SPF級(jí)，北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2018-0010。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)空軍特色中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號(hào)：空特（科研）第2020-148-PJ01。

2 方法與結(jié)果

2.1 波棱甲素納米混懸劑（Her-NS）的制備

采用反溶劑沉淀法制備Her-NS[12-13]。稱取50 mg Her粉末，溶于0.25 mL乙醇溶液中，超聲使其充分溶解。然后在磁力攪拌條件下，將含有Her的乙醇溶液快速倒入到5 mL含有一定量穩(wěn)定劑溶液中，減壓旋蒸揮去有機(jī)溶劑，補(bǔ)充適量去離子水定容至原體積，即得Her-NS。

2.2 粒徑分析

取適量Her-NS，加蒸餾水稀釋20倍，采用納米粒度儀測(cè)定PS與PDI，重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

2.3 SI的測(cè)定

取適量Her-NS于離心管中，1500 r/min離心30 min，取上層混懸液，加蒸餾水稀釋20倍，采用納米粒度儀測(cè)定PS與PDI，重復(fù)測(cè)定3次，取平均值，Her-NS的穩(wěn)定性通過SI進(jìn)行評(píng)估，SI值越接近1，表示Her-NS越穩(wěn)定。

SI＝離心前PS/離心后PS

2.4 單因素考察

本實(shí)驗(yàn)以納米混懸劑的PS、PDI和SI為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別對(duì)穩(wěn)定劑種類、穩(wěn)定劑用量、聯(lián)合穩(wěn)定劑比例、藥物與穩(wěn)定劑比例、攪拌轉(zhuǎn)速5個(gè)因素進(jìn)行考察。

2.4.1 穩(wěn)定劑種類的篩選 固定穩(wěn)定劑用量為0.6%，藥物與穩(wěn)定劑比例為2∶1，攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min，考察P188、P407、羥丙基甲基纖維素（HPMC）E15和HPMC E50[14]對(duì)Her-NS的PS、PDI和SI的影響，結(jié)果見圖1和表1。以HPMC系列作為穩(wěn)定劑，所制備的混懸液不穩(wěn)定，易產(chǎn)生藥物黏壁的現(xiàn)象。單獨(dú)以P407為穩(wěn)定劑時(shí)，Her-NS的PDI雖然小于0.3（SI＞0.75），但粒徑較大；單獨(dú)以P188為穩(wěn)定劑時(shí)，納米混懸劑的粒徑小，但PDI大于0.3或SI＜0.60；因此，選擇將P188和P407聯(lián)用作為Her-NS的穩(wěn)定劑。

2.4.2 穩(wěn)定劑用量的篩選 固定藥物與穩(wěn)定劑比例為2∶1，穩(wěn)定劑（P188-P407）比例為2∶1，攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min，攪拌時(shí)間20 s，穩(wěn)定劑用量分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%，按照“2.1”項(xiàng)下方法制備Her-NS，考察聯(lián)合穩(wěn)定劑用量對(duì)PS、PDI和SI的影響，結(jié)果見表2。隨著穩(wěn)定劑用量的增加，納米混懸劑的PS及PDI呈先降低后升高趨勢(shì)，當(dāng)穩(wěn)定劑用量為0.6%時(shí)，PS、PDI和SI最佳。

圖1 穩(wěn)定劑種類的影響

表1 穩(wěn)定劑種類對(duì)Her-NS的PS、PDI和SI的影響 (,n = 3)

與P188比較：*＜0.05

*< 0.05P188

2.4.3 穩(wěn)定劑比例的篩選 固定藥物與穩(wěn)定劑比例為2∶1，穩(wěn)定劑用量為0.6%，攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min，攪拌時(shí)間20 s，P188-P407比例分別為4∶1、2∶1、1∶1、1∶2，按照“2.1”項(xiàng)下方法制備Her-NS，并測(cè)定PS、PDI和SI，結(jié)果見表3。隨著P407比例的增加，NS溶液PDI減小、SI增大，繼續(xù)增加P407，Her-NS的粒徑和PDI、SI無明顯變化。當(dāng)2種穩(wěn)定劑比例達(dá)到1∶1時(shí)，可獲得粒徑相對(duì)較低，溶液狀態(tài)良好，PDI合格、SI＞0.75的NS。

表2 穩(wěn)定劑用量對(duì)Her-NS的PS、PDI和SI的影響(,n = 3)

與穩(wěn)定劑用量為0.6%組比較：*＜0.05

*< 0.05the stabilizer dosage of 0.6% group

表3 穩(wěn)定劑比例對(duì)Her-NS的PS、PDI和SI的影響(, n = 3)

與穩(wěn)定劑比例1∶1組比較：*＜0.05

*< 0.05the stabilizer ratio 1:1 group

2.4.4 藥物與穩(wěn)定劑比例的篩選 固定P188-P407比例分別為2∶1，穩(wěn)定劑用量為0.6%，攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min，攪拌時(shí)間20 s，按照“2.1”項(xiàng)下方法制備Her-NS，對(duì)藥物與穩(wěn)定劑的比例（5∶1、5∶3、1∶1）進(jìn)行考察，并測(cè)定PS、PDI和SI，結(jié)果見表4。當(dāng)藥物與穩(wěn)定劑比例為5∶3時(shí)，各項(xiàng)指標(biāo)較優(yōu)。

2.4.5 攪拌速度 固定P188-P407比例分別為2∶1，藥物與穩(wěn)定劑的比例2∶1，穩(wěn)定劑用量為0.6%，攪拌時(shí)間20 s，攪拌速度分別為400、600、800 r/min，按照“2.1”項(xiàng)下方法制備Her-NS，并測(cè)定PS、PDI和SI，結(jié)果見表5。Her-NS的粒徑隨攪拌速度增大而減小，當(dāng)轉(zhuǎn)速為400 r/min時(shí)，可獲得粒徑為450 nm左右的Her-NS（Her-NS450），當(dāng)轉(zhuǎn)速為600、800 r/min時(shí)，可獲得粒徑為200 nm左右的Her-NS（Her- NS200），但當(dāng)轉(zhuǎn)速為800 r/min時(shí)，PDI明顯增加，SI減小，可能是由于轉(zhuǎn)速過大導(dǎo)致液體產(chǎn)生氣泡，使NS穩(wěn)定性降低。

表4 藥物與穩(wěn)定劑比例對(duì)Her-NS的PS、PDI和SI的影響(, n = 3)

與藥物與穩(wěn)定劑比例5∶3組比較：*＜0.05

*< 0.05the 5:3 group of drug and stabilizer ratio

表5 攪拌速度對(duì)Her-NS的PS、PDI和SI的影響(, n = 3)

與攪拌速度600 r?min?1組比較：*＜0.05

*< 0.05the stirring speed 600 r?min?1group

2.4.6 工藝條件的確定 稱取穩(wěn)定劑P407和P188（P407與P188比例1∶1，質(zhì)量濃度6 mg/mL），置于5 mL去離子水中，攪拌使其充分溶解，得到穩(wěn)定劑溶液。稱取波棱甲素粉末50 mg，溶于0.25 mL乙醇溶液中，超聲使其充分溶解，分別在400、600 r/min轉(zhuǎn)速的磁力攪拌條件下，將含有藥物的有機(jī)溶液快速倒入到穩(wěn)定劑溶液中混合均勻，持續(xù)攪拌 20 s，減壓揮去有機(jī)溶劑，補(bǔ)充適量去離子水定容至原體積，即得Her-NS450、Her-NS200。以PS、PDI和SI為指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表6。

表6 Her-NS最佳工藝條件驗(yàn)證(, n = 3)

2.5 Her-NS的表征

2.5.1 形態(tài)觀察 SEM觀察Her-NS和波棱甲素原料藥的形態(tài)，將樣品適當(dāng)稀釋后，將Her-NS制劑滴在錫紙上，然后在20 mA電流下用金鈀導(dǎo)電層濺射鍍膜1 min，并在10 kV的加速激勵(lì)電壓下進(jìn)行觀察，Her-NS的形態(tài)見圖2，波棱甲素原料藥呈球狀及不規(guī)則塊狀，棱角分明，大小不一，粒徑在5～40 μm（圖2-A）；Her-NS200呈均勻球狀（圖2-B），粒徑在150～200 nm；Her-NS450呈球狀（圖2-C），可看到納米粒之間有黏附，其長徑和短徑不同；短徑小于400 nm，長徑在600～800 nm。

2.5.2 晶型表征 采用XRD分別對(duì)2種粒徑的Her-NS及波棱甲素原料藥晶型進(jìn)行掃描分析。分別對(duì)波棱甲素原料藥、P188、P407、波棱甲素與P188、P407的物理混合物及2種粒徑的Her-NS樣品進(jìn)行XRD分析。工作條件：Cu靶，管電壓40 kV，管電流60 mA。掃描速率2o/min，掃描2范圍為3o～60o。結(jié)果（圖3）顯示，不同粒徑的Her-NS及波棱甲素原料藥相同的位置上均無衍射峰，說明波棱甲素制備成不同粒徑的Her-NS，制備過程不會(huì)影響藥物的晶型。

圖2 Her-NS的SEM圖

2.5.3 穩(wěn)定性考察 將Her-NS200、Her-NS450在室溫條件下分別放置7 d，每天取樣，蒸餾水稀釋20倍測(cè)定PS和PDI，結(jié)果如圖4，Her-NS200、Her-NS450在室溫條件下放置7 d，粒徑分別在200、450 nm左右，PDI在0.25左右，表明Her-NS在7 d內(nèi)物理穩(wěn)定。

圖3 Her-NS的XRD圖

圖4 Her-NS的粒徑和PDI隨時(shí)間的變化(n = 3)

2.6 體外釋放度研究

2.6.1 色譜條件 色譜柱為Inertsil?ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-2%醋酸水溶液（30∶70），檢測(cè)波長280 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL，體積流量1.0 mL/min，理論塔板數(shù)按波棱甲素峰計(jì)算不低于4500，色譜圖見圖5。

圖5 波棱甲素對(duì)照品(A)、Her-NS樣品(B)、空白(C)的HPLC圖

2.6.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取波棱甲素對(duì)照品6.97 mg，置于10 mL量瓶中，加入一定量的甲醇超聲溶解并定容至刻度，配成波棱甲素質(zhì)量濃度為697 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.6.3 供試品溶液的配制 精密吸取新鮮制備的Her-NS 0.1 mL于10 mL量瓶中，加適量甲醇超聲溶解，定容，濾過，精密吸取續(xù)濾液1 mL于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度線，搖勻即得供試品溶液。

2.6.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液用甲醇稀釋成34.850、27.880、13.940、6.970、3.485 μg/mL的波棱甲素對(duì)照品溶液，用甲醇稀釋并定容至刻度線，搖勻HPLC法依次測(cè)定各個(gè)質(zhì)量濃度，以藥物質(zhì)量濃度（）對(duì)峰面積（）作線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程＝25 051－52.926，＝0.999 9，線性范圍為3.485～34.850 μg/mL。

2.6.5 方法學(xué)驗(yàn)證 分別取低、中、高（3.485、13.940、34.850 μg/mL）3個(gè)質(zhì)量濃度的波棱甲素對(duì)照品溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣HPLC測(cè)定6次，計(jì)算各個(gè)質(zhì)量濃度的精密度，結(jié)果顯示，低、中、高質(zhì)量濃度的波棱甲素對(duì)照品溶液RSD值分別為0.94%、0.19%、0.23%。表明儀器精密度良好。

按“2.6.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，分別于0、1、2、4、8、12、24 h按色譜條件測(cè)定峰面積，觀察峰面積比值變化情況，其RSD為1.71%，表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

按照“2.6.3”項(xiàng)下分別制備6份供試品溶液，按色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算NS中波棱甲素的量，其RSD為0.52%，表明該方法重復(fù)性良好。

精密量取已測(cè)定含量的同一供試品溶液9份各1 mL，分別加入對(duì)照品的量與其在NS中的量的比值為0.8∶1、1∶1、1.2∶1，每個(gè)比例3份，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果低、中、高不同質(zhì)量濃度的平均回收率分別為101.12%、102.74%、101.17%，RSD值均小于1.81%。表明回收率符合要求。

2.6.6 測(cè)定方法 采用透析袋擴(kuò)散法測(cè)定Her- NS200、Her-NS450和波棱甲素在PBS（pH 7.4）中的釋放行為。取溶液2 mL（相當(dāng)于20 mg波棱甲素）及等質(zhì)量濃度的波棱甲素溶液于截留相對(duì)分子質(zhì)量8000的透析袋內(nèi)，以200 mL蒸餾水作為溶出介質(zhì)，控制溫度為（37.0±0.5）℃，轉(zhuǎn)速為100 r/min，于釋放后1、2、4、6、8、12、16、22、24 h取樣1 mL，同時(shí)補(bǔ)足等溫等量的溶出介質(zhì)，樣品經(jīng)微孔濾膜濾過，通過HPLC測(cè)定含量（以波棱甲素計(jì)）。并繪制釋放度曲線，見圖6。結(jié)果顯示，在12 h內(nèi)，Her-NS200、Her-NS450和波棱甲素的累積釋放率分別為49.78%、40.76%、21.95%。在24 h內(nèi)，分別在透析袋外檢測(cè)到85.88%、80.10%、35.41%。在24 h內(nèi)，與波棱甲素原料藥相比，Her-NS200、Her-NS450的釋放度顯著提高（＜0.05），粒徑越小，累積釋放度越大。

圖6 Her-NS200、Her-NS450和波棱甲素原料藥在PBS (pH 7.4) 中的體外藥物釋放曲線(n = 3)

2.7 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

2.7.1 給藥方案與樣品采集 SD大鼠18只，隨機(jī)分為3組，每組6只，給藥前禁食12 h，不禁水，分別ig給藥Her-NS200、Her-NS450及波棱甲素原料藥（0.5% CMC-Na配制的波棱甲素混懸液）。每只大鼠給藥劑量為250 mg/kg（以波棱甲素計(jì)），給藥后分別在0.083、0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、12 h于大鼠眼底靜脈叢取血，所得血樣放置肝素浸潤的離心管中，6000 r/min離心10 min后吸取上清液，待測(cè)。

2.7.2 血漿樣品處理 精密移取空白血漿0.2 mL，置于具塞離心管中，加入600 μL的甲醇沉淀蛋白，渦旋振搖30 s，8000 r/min離心10 min，吸取上清液，在25 ℃下用氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)尤?00 μL甲醇溶解，充分渦旋振蕩，8000 r/min離心10 min，取上清液40 μL進(jìn)樣分析。

2.7.3 色譜條件 色譜柱為Inter Sustain?C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-2%醋酸水溶液（30∶70），檢測(cè)波長280 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量40 μL，體積流量1.0 mL/min，理論塔板數(shù)按波棱甲素峰計(jì)算不低于4500。色譜圖見圖7。

2.7.4 方法專屬性 取“2.7.2”項(xiàng)預(yù)處理后的空白血漿、空白血漿加標(biāo)樣品和含藥血漿樣品各40 μL進(jìn)樣分析，結(jié)果見圖7。大鼠血漿中內(nèi)源物質(zhì)對(duì)波棱甲素的測(cè)定無干擾，該方法專屬性強(qiáng)。

2.7.5 線性關(guān)系考察 取空白血漿0.2 mL，分別精密加入系列的波棱甲素對(duì)照品溶液，渦旋混勻，配制成0.945 1、1.890、3.780、5.671、7.561、9.451 μg/mL質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品。按“2.7.2”項(xiàng)下處理血漿樣品，按“2.7.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行藥物測(cè)定，以藥物質(zhì)量濃度（）對(duì)峰面積（）作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程＝47 700＋29 285，＝0.999 3，線性范圍為0.945 1～9.451 μg/mL。

圖7 波棱甲素對(duì)照品(A)、空白血漿樣品(B)、空白血漿樣品＋波棱甲素對(duì)照品(C)和大鼠給藥Her-NS1 h后血漿樣品(D)的HPLC圖

2.7.6 回收率試驗(yàn) 分別取高、中、低（7.561、3.780、0.945 1 μg/mL）3個(gè)質(zhì)量濃度的加藥血漿，經(jīng)處理后進(jìn)樣測(cè)定，每個(gè)質(zhì)量濃度平行測(cè)定5次，計(jì)算血漿藥物質(zhì)量濃度，所得質(zhì)量濃度與實(shí)際質(zhì)量濃度的比值即為回收率。高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的平均回收率分別為97.66%、101.35%、97.40%，RSD分別為1.19%、2.60%、2.67%（＝5）。符合生物樣品分析方法的基本要求。

2.7.7 精密度試驗(yàn) 分別取高、中、低（7.561、3.780、0.945 1 μg/mL）3個(gè)質(zhì)量濃度的加藥血漿按“2.7.2”項(xiàng)下方法處理，按“2.7.1”項(xiàng)色譜條件，進(jìn)樣測(cè)定，1 d內(nèi)連續(xù)測(cè)定3次，計(jì)算日內(nèi)精密度，每天測(cè)定1次并連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算日間精密度。高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的日內(nèi)精密度RSD分別為1.65%、1.93%、1.06%。日間精密度RSD則分別為1.78%、2.44%、2.36%（＝3）。符合生物樣品分析方法的基本要求。

2.7.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別取高、中、低（7.561、3.780、0.945 1 μg/mL）3個(gè)質(zhì)量濃度的加藥血漿，各個(gè)血漿樣品反復(fù)凍融3次，經(jīng)處理后進(jìn)樣測(cè)定，考察其穩(wěn)定性。高、中、低3種質(zhì)量濃度的RSD分別為1.34%、3.23%、2.26%，結(jié)果顯示，反復(fù)凍融不影響血漿樣品的測(cè)定。

2.7.9 定量限和檢測(cè)限 取波棱甲素對(duì)照品溶液，逐步稀釋，HPLC測(cè)定各質(zhì)量濃度對(duì)應(yīng)信噪比（/）。以/＝10為定量限，以/＝3為檢測(cè)限。結(jié)果顯示，定量限為0.9 μg/mL，檢測(cè)限為0.2 μg/mL。

2.7.10 血藥濃度–時(shí)間曲線 以血藥質(zhì)量濃度對(duì)時(shí)間作圖，血漿藥物質(zhì)量濃度-時(shí)間曲線見圖8，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表7，藥-時(shí)曲線經(jīng)擬合顯示Her-NS在大鼠體內(nèi)動(dòng)力學(xué)行為符合二室模型。由圖8和表7可知，大鼠ig給藥后，2種粒徑的Her-NS均在30 min達(dá)到血藥峰濃度（max），max分別為（15.50±1.83）、（11.84±0.59）mg/L，與波棱甲素原料藥相比，Her-NS的達(dá)峰時(shí)間（max）是波棱甲素的0.6倍，Her- NS200、Her-NS450max是波棱甲素（6.67±0.68）mg/L的2.32、1.78倍。表明Her-NS入血快，且血藥濃度高。Her-NS200、Her-NS450的藥-時(shí)曲線下面積（AUC0～t）分別為（32.55±7.69）、（27.18±4.50）mg/(L·h)，分別是波棱甲素（12.84±0.81）mg/(L·h)的2.54、2.12倍。Her-NS中的max和AUC0～t較波棱甲素原料藥都有了顯著提高（＜0.01），可見，Her-NS較波棱甲素更容易被吸收，Her-NS顯著提高了波棱甲素的體內(nèi)生物利用度。

圖8 Her-NS和波棱甲素(給藥劑量250 mg?kg?1)的血藥濃度-時(shí)間曲線(, n = 6)

表7 大鼠ig給藥Her-NS后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(,n = 6)

與波棱甲素組比較：*＜0.05**＜0.01

*< 0.05**< 0.01herpetrione group

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用反溶劑沉淀法制備納米混懸劑，通過單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，成功制備了2種不同粒徑的Her-NS，即Her-NS-200、Her-NS-450。粒徑分別為200 nm和450 nm左右；PDI小于0.2，SI大于0.75。表明粒徑分布均勻[15]。本實(shí)驗(yàn)考察了穩(wěn)定劑種類、穩(wěn)定劑用量、聯(lián)合穩(wěn)定劑比例、藥物與穩(wěn)定劑比例、攪拌轉(zhuǎn)速等因素對(duì)Her-NS粒徑及PDI的影響，結(jié)果顯示穩(wěn)定劑的種類及攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)其影響較顯著，這可能由于不同穩(wěn)定劑對(duì)維持不同藥物的NS體系效果不同，添加穩(wěn)定劑是維持納米混懸劑穩(wěn)定性的主要方法，良好的穩(wěn)定劑可以為納米混懸劑提供足夠的空間位阻或靜電排斥力，以阻止粒子聚集[15-17]。在本研究中，單一穩(wěn)定劑P188的應(yīng)用雖然能夠獲得較小粒徑的Her-NS，但是粒徑分布較大，不穩(wěn)定。研究報(bào)道，應(yīng)用聯(lián)合穩(wěn)定劑可更好的保證納米混懸劑的穩(wěn)定性。本研究參考文獻(xiàn)報(bào)道[14]，應(yīng)用聯(lián)合穩(wěn)定劑P188和P407，結(jié)合實(shí)驗(yàn)優(yōu)化比例，從而得到較穩(wěn)定的Her-NS。P188和P407均為聚合物，能夠?yàn)镠er-NS提供足夠的空間位阻，以阻止粒子聚集，保證Her-NS的穩(wěn)定?；旌线^程的攪拌轉(zhuǎn)速可能影響沉淀過程的納米粒形成與成長，低轉(zhuǎn)速下，溶液分散慢，在反溶劑中聚集沉淀快，導(dǎo)致納米粒粒徑較大；而轉(zhuǎn)速過高則因能量過度輸入，打破體系原有平衡，導(dǎo)致已獲得的納米粒聚集，分布變差，PDI變大[13]。通過單因素實(shí)驗(yàn)，本研究確定將P188和P407聯(lián)用作為Her-NS的穩(wěn)定劑，所制備的NS粒徑小、粒徑分布較窄。本實(shí)驗(yàn)主要是探討粒徑對(duì)Her-NS藥動(dòng)學(xué)的影響，在確定處方的基礎(chǔ)上，通過控制不同工藝參數(shù)獲得不同粒徑的Her-NS。掃描電鏡結(jié)果顯示，Her-NS200、Her-NS450均呈圓球狀；XRD結(jié)果顯示Her原料藥及不同粒徑的Her-NS均為無定型態(tài)，表明納米化過程不會(huì)影響波棱甲素的形態(tài)及晶型。

體外釋放度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Her-NS200、Her- NS450與波棱甲素原料藥相比，Her-NS的累積釋放度顯著提高（＜0.05），表明將波棱甲素制成Her-NS能提高其體外釋放度。NS粒徑與釋放度呈負(fù)相關(guān)，這是因?yàn)殡S著粒徑的減小，較大的比表面積導(dǎo)致NS[9]的溶解度較高[9,18]。

藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2種粒徑的Her-NS的AUC0～t和max均顯著高于波棱甲素（＜0.01）；表明波棱甲素制成納米混懸劑后，生物利用度顯著提高。這主要是因?yàn)椴ɡ饧姿丶{米化后，粒徑顯著降低，增加波棱甲素的溶出及與胃腸道的黏附性，促進(jìn)了波棱甲素的吸收，進(jìn)而提高了波棱甲素的口服生物利用度。此外，顯著延長的MRT0～t也有利于生物利用度的增加。Her-NS200的AUC0～t和max高于Her-NS450，說明粒徑小更有助于生物利用度的改善。兩者差異不顯著，這與文獻(xiàn)報(bào)道的不一致[9,18]，分析可能原因如下：Her-NS口服進(jìn)入胃腸道，受復(fù)雜的胃腸道環(huán)境如不同的pH值，消化酶等的影響，導(dǎo)致Her-NS在胃腸道有輕微聚集，降低了粒徑差異，導(dǎo)致吸收差異不顯著。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation andpharmacokinetic behaviors of herpetrione nanosuspensions

HANG Ling-yu1, 2, SHEN Bao-de2, SHEN Cheng-ying2, YANG Kuo1, YUAN Hai-long2

1. College of Pharmacy, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China 2. Department of Pharmacy, Air Force Medical Center, Beijing 100042, China

To prepare herpetrione nanosuspension (Her-NS) with different particle sizes, and explore the effects of particle size on the oral bioavailability.Her-NS with two different particle sizes were prepared by anti-solvent precipitation method, and optimized by single factor experiments with average particle size, polydispersity index, and stability index as evaluation indexes. The morphology of Her-NS was observed by scanning electron microscope (SEM), and the physical state was analyzed by X-ray diffraction (XRD). The drug release of Her-NS was evaluated by dialysis method. The oral pharmacokinetics of Her-NS with two different particle sizes were compared using SD rats.Her-NS with two different particle sizes around 200 nm (Her-NS200) and 450 nm (Her-NS450) were successfully prepared with P188 and P407 as stabilizers. SEM showed that Her-NS with two different particle sizes were all spherical in shape, and the XRD analysis showed that Her-NS with two different particle sizes were amorphous.release and pharmacokinetic results showed that the cumulative release and themaxand AUC0—tof Her-NS with two different particle sizes were significantly increased as compared to coarse Her, but themaxand AUC0—tof the Her-NS200were higher than those of Her-NS450.NS can significantly improve the oral bioavailability of Her, and the small particle size is more significant.

herpetrione; anti-solvent precipitation method; nanosuspension; particle size;release; pharmacokinetics; oral bioavailability

R283.6

A

0253 - 2670(2021)07 - 1898 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.07.006

2020-11-23

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81573697）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81873092）；國家重大新藥創(chuàng)制（2016ZX09101073）

杭凌宇，博士研究生，研究方向?yàn)橹兴幹苿┕こ碳夹g(shù)研究。E-mail: 445914871@qq.com

袁海龍，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幮滦徒o藥系統(tǒng)。Tel: (010)66928505 E-mail: yhlpharm@126.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]